李璐，邢曉旭，朱慶賀，王俊，李梓健，趙飛宇，趙鵬宇，孫東波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

腹瀉是一種由多種非感染或感染類因素引起的胃腸道疾病，其特征為頻繁水樣便和腹痛，甚至死亡[1]。腹瀉也是全球養(yǎng)豬業(yè)面臨的嚴(yán)重問題之一，據(jù)報道，每年死于腹瀉的仔豬比例超過50%，已經(jīng)嚴(yán)重影響畜牧業(yè)的發(fā)展[2]。目前，對于腹瀉的治療并沒有特效藥進(jìn)行治療，臨床多以抗生素并加以補(bǔ)液治療，然而，隨著細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)問題不斷出現(xiàn)，對治療腹瀉的效果并不顯著，加上“減抗替抗”等相關(guān)政策的實施，尋找新型、安全、高效的天然抗腹瀉藥物對預(yù)防、控制動物腹瀉的發(fā)生以及降低畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)損失具有重要意義。

車前草（Plantago asiatica L），為車前科（Plantaginaceae）車前屬（Plantago）植物，種子和整株草都可以作為藥物對相關(guān)疾病進(jìn)行治療，是一種中國傳統(tǒng)中草藥，該植物在亞洲大部分地區(qū)都有分布[3-4]。車前草（車前屬）在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中被廣泛使用，其中一些也被現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所接受。車前草富含多種活性成分，這些成分有助于發(fā)揮特定的治療作用[5]。近些年的研究發(fā)現(xiàn)車前草是一種有效的傷口愈合劑，同時也是一種抗?jié)儭⒖固悄虿?、抗腹瀉、抗炎、抗傷害、抗菌和抗病毒藥物[6]。目前，國內(nèi)外報道中，關(guān)于車前草中總黃酮提取相關(guān)研究的報道相對較少，相關(guān)人員對技術(shù)變更的了解較少，因此，優(yōu)化車前草總黃酮提取工藝，為有效提取、純化車前草黃酮類成分，合理利用車前草，提高其藥用價值具有較大意義。

研究采用響應(yīng)面法對車前草中黃酮類化合物的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過蓖麻油誘導(dǎo)小鼠腹瀉模型和小鼠腸道蠕動模型探究車前草黃酮類化合物對腹瀉的影響，為車前草總黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)及用于治療仔豬腹瀉藥物的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF級昆明小鼠共30 只，雌雄各半，體重18～22 g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.2 實驗藥物

車前草購自中國黑龍江省哈爾濱市中草藥市場；蘆丁對照品購自上海源葉公司；蓖麻油購自天津福晨化學(xué)試劑公司。

1.1.3 儀器設(shè)備

表1 儀器設(shè)備Table 1 The detail information of instruments

1.2 實驗方法

1.2.1 車前草總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

按照朱良會，張意笠等[7-8]利用NaNO2-Al（NO3）3比色法繪制車前草總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體操作如下：分別精確吸取每毫升含0.1 mg 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，將溶液分別加入已準(zhǔn)備好的試管中；分別將濃度為30%的乙醇溶液加入到各個試管中，使溶液體積固定在5 mL；再向試管中加入0.3 mL 5%的NaNO2溶液；輕搖溶液使其混合均勻，置于室溫下靜置6 min；向其中加入0.3 mL 的Al（NO3）3溶液，再次混合均勻后靜置6 min；最后向其中加入4 mL 濃度為1 mol·L-1的NaOH 溶液及0.4 mL 的蒸餾水，再次混合均勻后，于室溫下靜置15 min。分別置于510 nm 的波長下并測定其吸光度，根據(jù)分光光度計輸出結(jié)果繪制出吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 車前草總黃酮提取

選取料液比、提取溫度、提取時間、乙醇濃度作為變量，控制其他三個變量相同，只改變其中一個變量，分別對車前草中提取的總黃酮含量進(jìn)行測算。測算方法是：首先收集提取出的溶液，將其置于3 000 rpm·min-1的離心機(jī)中離心5 min；取出上清液并過濾，將過濾后溶液用一定濃度的提取溶劑將其定容到25 mL；根據(jù)分光光度計輸出結(jié)果繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，以確定總黃酮的質(zhì)量濃度。

1.2.3 車前草總黃酮提取率測定

取出5 mL 的黃酮提取液，按照1.3.1 中的方法對提取液中的總黃酮的質(zhì)量濃度進(jìn)行測定，根據(jù)總黃酮提取率（mg·g-1）=總黃酮質(zhì)量濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)/車前草質(zhì)量公式對提取率進(jìn)行計算。

1.2.4 單因素分析

分別取出料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 的溶液，在濃度為70%的乙醇溶液、溫度為80 ℃的環(huán)境下2 h，測量其黃酮含量；取出料液比為1∶20 的溶液，將溫度分別設(shè)定在70、75、80、85、90 ℃，同樣在70%的乙醇溶液環(huán)境下2 h 進(jìn)行提取，測定其黃酮含量；取出料液比為1∶20 的溶液，將溫度設(shè)定在80 ℃，分別提取時間分別為1、1.5、2、2.5、3 h，測定黃酮的含量；取出料液比為1∶20 的溶液，將溫度設(shè)定在80 ℃，在乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%的條件下提取時間2 h，測定其酮含量。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化

研究選擇硝酸鋁顯色法作為檢測方法對溶液中的黃酮含量進(jìn)行檢測，并根據(jù)公式計算提取率。研究在Box-Behnken 分析的基礎(chǔ)上，設(shè)定提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度這四個變量，分別作為自變量，將總黃酮提取率的變化值作為因變量，通過Design-Expert 8.0.5 對其最優(yōu)提取條件進(jìn)行測算，結(jié)果見下表2 中。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平Table 2 Response surface test factors and levels

1.2.6 車前草總黃酮抗蓖麻油誘導(dǎo)的腹瀉模型試驗

按照南蘋瑤[29]利用蓖麻油誘導(dǎo)小鼠腹瀉制作小鼠腹瀉模型，在進(jìn)行實驗前，將實驗小鼠禁食18 h，根據(jù)隨機(jī)性原則將30 只小鼠分為5 組，每組6 只，第一組灌服0.2 mL 的蒸餾水，作空白對照；第二組灌服0.2 mL 的蓖麻油（在其他組灌服藥物1 h 之后灌服）；第三、四、五組分別按低劑量組（100 mg·kg-10.2 mL）、中劑量組（200 mg·kg-10.2 mL）、高劑量組（300 mg·kg-10.2 mL）灌服車前草總黃酮提取物0.2 mL，作為藥物組，灌服1 h 后，各組均灌服0.2 mL 蓖麻油。觀察并記錄連續(xù)6 h 內(nèi)小鼠的初次腹瀉時間、總排便次數(shù)、計算排便抑制率。

1.2.7 車前草總黃酮抗蓖麻油誘導(dǎo)的腸蠕動模型試驗

同樣按照1.2.6 上述方法對實驗小鼠進(jìn)行禁食、隨機(jī)分配、藥物灌服，第一組灌服0.2 mL 的蒸餾水，作空白對照；第二組灌服0.2 mL 的蓖麻油（在其他組灌服藥物1 h 之后灌服）；第三、四、五組分別按低劑量組（100 mg·kg-10.2 mL）、中劑量組（200 mg·kg-10.2 mL）、高劑量組（300 mg·kg-10.2 mL）灌服車前草總黃酮提取物0.2 mL，作為藥物組；1 h 后，各組小鼠均灌服0.2 mL 標(biāo)準(zhǔn)碳粉溶液；30 min 后，將小鼠安樂死，從小鼠體內(nèi)取出小腸，將小腸均勻展開形成直線，對小腸的總長度、碳粉溶液在小腸內(nèi)的推進(jìn)距離進(jìn)行計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素分析結(jié)果

通過單因素分析法驗證了不同條件下黃酮的提取效率變化情況，結(jié)果顯示，不同因素對黃酮提取率的影響見下圖1（A～D）中所示，從圖中可以看出，在其他因素不變的條件下，料液比增加，黃酮取得率先增加，在料液比為1∶15 時最高，隨著液料比改變，其黃酮提取率趨勢無變化，詳見圖1-A。在其他因素不變的條件下，隨著提取溫度的升高，黃酮提取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃時，總黃酮提取率最高，85 ℃有下降趨勢，見圖1-B。在其他因素不變的條件下，隨著提取時間的增加，黃酮取得率在一定時間范圍內(nèi)持續(xù)上升，在2 h 時達(dá)到峰值，見圖1-C。在其他因素不變的條件下，乙醇濃度的增加使黃酮的提取率顯著上升，在濃度為70%時最高，見圖1-D。

圖1 單因素考察料液比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）、乙醇濃度（D）對黃酮提取效果的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratio（A），extraction temperature（B），extraction time（C）and ethanol concentration（D）on PTF extraction investigated by single factor method

2.2 響應(yīng)面法實驗設(shè)計優(yōu)化結(jié)果

實驗?zāi)康氖菍ふ易顑?yōu)條件下的黃酮提取率，通過單因素分析的實驗數(shù)據(jù)用響應(yīng)面法進(jìn)行分析，為了更好地測定黃酮類化合物的含量，采用紫外分光光度法測定了黃酮類化合物的含量。以蘆丁為參考物質(zhì)，在510 nm 處測定不同已知濃度的蘆丁的吸光度值。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的r2值為0.999 5，符合標(biāo)準(zhǔn)曲線的使用條件。將提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度作為變化因素，對其中單一因素的影響情況進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，然后通過Design-Expert 8.0.5 對其最優(yōu)提取條件進(jìn)行測算，利用ANOVA 進(jìn)行響應(yīng)面回歸，結(jié)果如下表3 所示。模型的均方誤差為0.015 6＜0.05，表明模型回歸顯著，實驗方法可靠。結(jié)果如圖2所示，通過RSM 得到了最佳的提取條件，當(dāng)乙醇濃度為70.36%，提取溫度為85.6 ℃，提取時間為1.29 h，液材比為1∶15.99 時，得到車前草總黃酮的提取率。得到了二次多元擬合回歸模型方程：提取率=11.28+0.62 A+0.68 B+0.41 C+0.75 D-0.15 AB-0.56 AC-0.43 AD-0.33 BC+0.11 BD+0.2 CD-0.57 A2-0.8 B2-1.28 C2-0.87 D2，在最佳提取條件下，總黃酮類化合物的提取速率為12.41 mg·g-1，從該提取過程中提取的總黃酮類化合物用于后續(xù)實驗。（A 為乙醇濃度，B為提取溫度，C 是為提取時間，D 為料液比。）

圖2 響應(yīng)面結(jié)果Fig.2 Response surface result

表3 響應(yīng)面法實驗設(shè)計Table 3 Response surface methodology experimental design

2.3 車前草總黃酮抗蓖麻油誘導(dǎo)的腹瀉模型試驗結(jié)果

通過蓖麻油誘導(dǎo)小鼠腹瀉制作小鼠腹瀉模型驗證該藥物對小鼠腹瀉次數(shù)的影響，結(jié)果如圖3-A 所示，給藥組的小鼠腹瀉次數(shù)比腹瀉對照組要極顯著降低（P＜0.01）。通過蓖麻油誘導(dǎo)小鼠腹瀉制作小鼠腹瀉模型驗證該藥物對小鼠腹瀉初次時間的影響，如圖3-B 所示，給藥組的首次腹瀉開始時間要比腹瀉對照組晚。這表明總黃酮能夠有效抑制小鼠腹瀉。

圖3 小鼠腹瀉次數(shù)（A）、小鼠初次腹瀉時間（B）Fig.3 Diarrhea times of mice（A），time of first diarrhea of mice（B）

2.4 車前草總黃酮抗蓖麻油誘導(dǎo)的腸蠕動模型試驗結(jié)果

通過蓖麻油誘導(dǎo)小鼠腹瀉制作小鼠腹瀉模型驗證該藥物對小鼠腸蠕動的影響，結(jié)果如圖4 所示，與健康對照組比較，腹瀉對照組碳墨法推進(jìn)率顯著后移（P＜0.05），顯示碳墨已經(jīng)推進(jìn)至模型組小鼠小腸末端，表明實驗采用蓖麻油誘導(dǎo)小鼠腹瀉造模成功。車前草總黃酮給藥組與腹瀉對照組比較，腹瀉模型組碳墨法推進(jìn)率顯著降低（P＜0.05）。

圖4 碳粉推進(jìn)比Fig.4 Carbon powder propulsion ratio

3 討論

腹瀉是一種在動物群體中常見且高發(fā)的疾病，腹瀉可以使動物營養(yǎng)不良，導(dǎo)致維生素缺乏，引起動物貧血，降低動物抵抗力以及造成動物機(jī)體平衡紊亂，腹瀉嚴(yán)重時可以導(dǎo)致動物死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[9]。腹瀉的最主要因素是細(xì)菌性感染，這類因素對腹瀉的預(yù)防和治療非常不利。迄今為止，各種實驗藥物和策略已用于治療腹瀉，例如使用新霉素、消膽胺/左氧氟沙星和頭孢泊肟等抗生素[10]。雖然這些策略可以緩解腹瀉，但由于引起腹瀉的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，并不能完全阻斷腹瀉，尋找針對動物腹瀉的替代治療方法變得越來越迫切，因此特異性天然抗腹瀉藥物已成為研究者的熱點之一。更重要的是，天然藥物中許多活性成分的存在減少了藥物耐藥性的發(fā)生。這是由于天然藥物中不同生物活性成分的獨特特征，包括多個靶點和復(fù)雜的機(jī)制[11]。天然藥物已成為篩選抗急性腹瀉藥物的最佳選擇。目前，蓖麻油誘導(dǎo)小鼠腹瀉模型已廣泛應(yīng)用于抗腹瀉藥物的臨床篩選[12]，蓖麻油釋放的蓖麻油酸刺激胃腸道黏膜，導(dǎo)致胃腸道炎癥、胃腸道分泌增加，胃腸道運動增強(qiáng)[13-14]，此外，由于碳粉表面為多孔結(jié)構(gòu)，大量藥物會吸附在碳粉的表面，這使得碳粉具有了標(biāo)記作用，如果藥物能夠減慢腸道的蠕動，通過給小鼠灌注碳粉并取出小鼠小腸，觀察糞便在小腸中的位置，就可以據(jù)此推斷出藥物是否能夠減慢腸道的蠕動。在研究中，腹瀉組的碳粉推進(jìn)率要明顯減少（P＜0.05），這一結(jié)果與其他研究人員的研究結(jié)論基本一致[15-18]，說明黃酮具有減慢腸道蠕動的作用。

研究中所使用的響應(yīng)面法在黃酮類化合物的提取方面具有廣泛的應(yīng)用，一方面，方法不僅能夠彌補(bǔ)正交試驗的不足，而且有助于研究者找出最優(yōu)影響因素和最優(yōu)組合的響應(yīng)價值，降低檢測的數(shù)量，全面了解各個因素的影響水平高低[19]；另一方面，從藥用植物中提取有效成分對藥物的開發(fā)和利用有很大的影響[20]，研究人員通過優(yōu)化提取過程，實現(xiàn)了在有限條件下獲得更多提取物的目標(biāo)[21]。其中，響應(yīng)面法（RSM）已廣泛應(yīng)用于不同的工藝優(yōu)化領(lǐng)域。例如，利用RSM 優(yōu)化橄欖餅油的超臨界二氧化碳提取工藝，有效提高了食品化學(xué)的產(chǎn)量和生物活性分子的含量，同時分析了RSM 和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ANN）對膜潤濕的影響[22]，RSM 操作方便，同時考慮多種因素對工藝的影響。從而計算最佳提取條件，這就是藥用植物活性成分的提取。該研究中，優(yōu)化了車前草黃酮的提取過程?；邳S酮類化合物容易溶于醇，廣泛應(yīng)用于黃酮類化合物的提取[23]，響應(yīng)曲面法（RSM）被用來優(yōu)化影響提取速率的四個關(guān)鍵因素，包括乙醇的體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時間和料液比。RSM 具有高精度、高效、模型構(gòu)建準(zhǔn)確的特點，廣泛應(yīng)用于各種專業(yè)工藝優(yōu)化，特別是天然化合物的提取[24-25]。采用Box-behnken 設(shè)計（BBD）RSM 優(yōu)化模擬車前草總黃酮的提取工藝，與RSM 的復(fù)合設(shè)計（CCD）相比，BBD通過更少的試驗可以更有效地獲得最佳條件[26]。因此，BBD 設(shè)計了29 組實驗，研究了4 個因素對車前草黃酮提取率的影響，得到了6 個二次因素模型，結(jié)果表明四個因素存在顯著相關(guān)性，當(dāng)乙醇濃度為70.36%，提取溫度為85.6 ℃，提取時間為1.29 h，料液比為1∶15.99，方法可以得到總黃酮的提取率。車前草黃酮的提取率為12.41 mg·g-1。

研究采用蓖麻油誘導(dǎo)腹瀉模型評價了黃酮類化合物的抗腹瀉作用。結(jié)果表明，車前草總黃酮可顯著減少小鼠腹瀉次數(shù)，且呈劑量依賴性。車前草總黃酮類化合物能顯著抑制腸道蠕動，從而抑制腸道蠕動，減少腹瀉的形成[27-28]。表明車前草總黃酮具有研究開發(fā)價值和潛力，為深入研究車前草黃酮化合物及提高車前草資源開發(fā)利用提供理論依據(jù)，同時也為開發(fā)車前草作為抗腹瀉藥物提供科學(xué)依據(jù)。