崔夢琪 張桂欣 羅璇 王曉飛 張貞理

摘 要：膽堿是一種重要的水溶性微量營養(yǎng)素，通常被歸為類維生素，它對維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能以及神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿合成至關(guān)重要。膽堿在特殊膳食用食品中有嚴(yán)格的添加要求，準(zhǔn)確測定極其重要。本文對國內(nèi)外特殊膳食用食品中膽堿檢測方法中樣品處理、儀器、試劑、自動化程度等進(jìn)行比較分析，以期為檢測人員提供理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：膽堿；特殊膳食用食品；檢測方法；前處理

Abstract： Choline is an important water-soluble micronutrient that is often classified as “vitamin-like.” It is critical for cell membrane structure and function and in synthesis of the neurotransmitter acetylcholine. Choline has been added in foods for special dietary users with a strict limitation to the amount of addition. Thus， accurate determination of choline has great significance. In this paper， the sample treatment， instrument， reagent and automation of the method for determination of choline in foods for special dietary users are brieflfly presented， so as to provide a reference for testing personnel.

Keywords： choline; foods for special dietary users; detection method; sample treatment

特殊膳食用食品是為滿足特殊的身體或生理狀況和（或）滿足疾病、紊亂等狀態(tài)下的特殊膳食需求，而專門加工或配方的食品，包括嬰幼兒配方食品、嬰幼兒輔食食品、特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品以及其他特殊膳食食用食品（輔食營養(yǎng)補(bǔ)充品、孕婦、乳母營養(yǎng)補(bǔ)充食品等）[1]。膽堿是一種添加在特殊膳食用食品中的營養(yǎng)強(qiáng)化劑，具有重要的生理功能。研究表明，膽堿在腦發(fā)育和開發(fā)認(rèn)知、記憶與學(xué)習(xí)能力，以及促進(jìn)肝臟機(jī)能方面都發(fā)揮著重要作用[2]。目前，膽堿的充足攝入量為嬰兒125 mg·d-1，19歲及以上的女性為425 mg·d-1，19歲及以上的男性為550 mg·d-1[3]。人體可自身合成膽堿或者從食物中獲取，對于一些特殊人群如嬰幼兒、孕婦、乳母或某些疾病患者，除通過食物攝取外，還需通過特殊膳食用食品來補(bǔ)充。我國國家標(biāo)準(zhǔn)在嬰兒配方食品、特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品、其他特殊膳食用食品中對膽堿都有明確規(guī)定[4-8]。

目前，國內(nèi)外已報(bào)道了許多關(guān)于膽堿的檢測方法，但都有局限性，本文對膽堿檢測方法進(jìn)行詳盡概述，以期為檢測人員從事膽堿檢測提供理論指導(dǎo)。

1 樣品前處理方法

膽堿是一種強(qiáng)有機(jī)堿，通常情況下在動物有機(jī)體內(nèi)主要以游離態(tài)膽堿、乙酰膽堿、卵磷脂或鞘磷脂等形式存在，一般用水作為提取試劑只能提取樣品中的游離態(tài)膽堿，因此很多研究者利用酸、堿或者酶將樣品中結(jié)合態(tài)的膽堿變成游離態(tài)，然后再進(jìn)行測定，因此水解法是測定特殊膳食用食品中膽堿的常見前處理方法。目前，絕大多數(shù)采用的前處理方法為樣品在70 ℃下，用鹽酸水解3 h，然后用磷脂酶D酶解[9-13]。文獻(xiàn)中報(bào)道過的其他前處理方法有酸微波消解[14-15]、堿水解[16-17]。

2 檢測方法

2.1 分光光度法

紫外可見分光光度法檢測樣品中的膽堿大多需要先發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成有色物質(zhì)，可見區(qū)有吸收，然后才能測定，酶法和雷氏鹽分光光度法都是基于此原理。膽堿受到膽堿氧化酶的作用釋放過氧化氫，在過氧化物酶的作用下，與苯酚和4-氨基安替比林反應(yīng)生成有色物質(zhì)，在波長505 nm處測定吸光度并進(jìn)行定量分析?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定》（GB 5413.20—2022）[9]第一法和AOAC官方方法（999.14）[10]都是基于酶法原理進(jìn)行膽堿測定。KHAN等[11]將二氮熒光素代替苯酚和4-氨基安替比林，也可以生成有色物質(zhì)，并在502 nm處測定吸光度定量膽堿含量。RADER等[12]優(yōu)化了AOAC官方方法，通過加入活性炭消除高含量維生素C對酶比色法影響，并將該方法應(yīng)用于一系列含膽堿的膳食補(bǔ)充劑，包括膳食補(bǔ)充片、膠囊、液體產(chǎn)品等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加到嬰幼兒配方乳粉和代表性膳食補(bǔ)充劑中的膽堿回收率達(dá)85%～114%。雷氏鹽分光光度法則是利用膽堿雷納克銨鹽的丙酮溶液在可見區(qū)有吸收的原理進(jìn)行測定[18]。劉旻雯[19]和梁喜玲[20]分別對比了上述兩種方法測定嬰幼兒乳粉、特殊醫(yī)學(xué)配方食品中的膽堿含量，結(jié)果顯示兩種方法測得的膽堿含量相近，均能滿足檢測要求。

CARTER等[16]結(jié)合毛細(xì)管電泳法與分光光度法，實(shí)現(xiàn)了對嬰幼兒配方食品中膽堿的檢測，以1-甲基咪唑?yàn)樘结槪捎?.1 mmol·L-1鹽酸調(diào)節(jié)背景電解質(zhì)pH值，內(nèi)標(biāo)法定量。丁曉靜等[21]以4-甲基咪唑?yàn)樘结?，?0 mmol·L-1磷酸二氫鈉+20 mmol·L-1磷酸+7 mmol·L-1為背景電解質(zhì)，外標(biāo)法測定膽堿含量，發(fā)現(xiàn)該方法線性關(guān)系、精密度和回收率良好，方法簡單，能滿足對嬰幼兒奶粉中膽堿分析的要求。

酶促反應(yīng)結(jié)合分光光度法是目前實(shí)驗(yàn)室測定膽堿最常用的方法，但該法檢出限高，不適合大批量樣品檢測；雷氏鹽分光光度法前處理復(fù)雜、耗時長；毛細(xì)管電泳采用紫外法在實(shí)際應(yīng)用中存在一定制約，普通實(shí)驗(yàn)室使用率低，推廣較困難。

2.2 色譜/質(zhì)譜法

色譜法具備靈敏度高，檢測結(jié)果準(zhǔn)確度好等優(yōu)勢；質(zhì)譜法被認(rèn)為是一種同時具備高特異性和高靈敏度的方法，有大量報(bào)道顯示，色譜法和質(zhì)譜法已經(jīng)用于膽堿的檢測。盧越圻等[22]建立了柱前衍生-高效液相色譜法測定嬰幼兒食品和乳品中膽堿含量的方法，樣品經(jīng)水解后，F(xiàn)moc-Cl衍生，C18柱分離后，F(xiàn)LD檢測，該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，回收率為85.0%～110.4%，RSD為1.27%～3.78%。

LAIKHTMAN等[23]采用離子色譜法和抑制電導(dǎo)率法測定嬰幼兒配方奶粉中的膽堿，樣品用酸水解后，注入色譜系統(tǒng)，分離后經(jīng)抑制型電導(dǎo)檢測器測定。同時，筆者將此方法與AOAC官方方法（999.14）進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)測定結(jié)果（平均值）低于酶比色法，將此結(jié)果歸因于省略了磷脂酶D處理，盡管存在這種偏差，該方法仍然可以用來準(zhǔn)確測定粉狀、濃縮和即食嬰兒配方奶粉中的膽堿。

ANDRIEUX等[13]建立了液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Liquid Chromatograph Mass Spectrometer，LC-MS）同時測定嬰幼兒配制乳粉和保健品中游離左旋肉堿和總膽堿的方法，樣品經(jīng)水解和酶解后，色譜分離，單四極桿檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法膽堿回收率為94%～103%，RSD為2%左右。ZHENG等[14]建立了采用親水性色譜柱串聯(lián)質(zhì)譜法測定嬰幼兒配方乳粉中的游離態(tài)和總的膽堿和左旋肉堿的方法。該方法膽堿回收率為85.0%～104%，RSD＜5%。潘拾朝等[24]建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定特殊醫(yī)學(xué)配方食品中膽堿含量得方法，樣品經(jīng)酸水解，C18柱分離，采用UPLC-MS/MS外標(biāo)法測定。該方法線性關(guān)系良好，R為0.999 3，回收率為96.1%～103.4%。

薛靜[25]采用離子色譜法（Ion Chromatography，IC）、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法（High Performance Liquid Chromatography-Evaporative Light Scattering Detection，HPLC-ELSD）及高效液相色譜-質(zhì)譜法（High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS）3種方法測定奶粉中的膽堿，并進(jìn)行比較分析。檢測限為HPLC-ELSD＞IC＞HPLC-MS；精密度為IC＞HPLC-ELSD＞HPLC-MS；回收率為IC＞HPLC-ELSD＞HPLC-MS，綜合考慮發(fā)現(xiàn)IC法更適合奶粉中膽堿的測定。此外，SAUCERMAN等[17]利用GC檢測三甲胺間接測定膽堿，膽堿發(fā)生霍夫曼分解反應(yīng)，產(chǎn)生揮發(fā)性三甲胺，并通過頂空進(jìn)樣，F(xiàn)ID檢測。

液相色譜法部分需要衍生化，增加了前處理步驟。而離子色譜法和質(zhì)譜法已成為國標(biāo)方法，其中離子色譜作為實(shí)驗(yàn)室較為常見的儀器，可進(jìn)行膽堿測定；上文介紹的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法僅需27 min就可完成檢測，但質(zhì)譜設(shè)備較其他設(shè)備昂貴，在普通實(shí)驗(yàn)室中難以普及。

2.3 電化學(xué)方法

大部分電化學(xué)方法測定膽堿是利用膽堿氧化酶氧化膽堿，過氧化氫的產(chǎn)生和氧的消耗可以轉(zhuǎn)化為電化學(xué)信號進(jìn)行檢測。LIMA等[26]建立了利用流動注射和電位檢測膽堿的方法，樣品經(jīng)過酸水解后，被固定化膽堿氧化酶氧化生成過氧化氫，過氧化氫引起碘化物的氧化，電位檢測碘化物濃度變化，從而測定膽堿含量。PATI等[27]在70 ℃條件下，用鹽酸水解牛奶、奶粉和大豆卵磷脂水解物3 h，游離態(tài)膽堿通過流動注射分析和固定化膽堿氧化酶安培生物傳感器檢測。PANFILI等[15]在110 ℃條件下，使用微波水解5 min，采用膽堿氧化酶電化學(xué)生物傳感器的方法快速測定食品中的膽堿。PATI等[27]描述的生物傳感器測定膽堿是基于H2O2的產(chǎn)生，而PANFILI等[15]是基于O2的消耗。此外，PATI等[28]還建立了雙生物傳感器的方法來測定游離態(tài)膽堿和結(jié)合態(tài)膽堿，使用磷脂酶D生物傳感器與膽堿氧化酶安培生物傳感器，結(jié)合酸水解步驟，可定量測定牛奶和膳食補(bǔ)充劑中總膽堿、游離態(tài)膽堿和磷脂酰膽堿。電化學(xué)法專一性好、干擾少，但目前還未得到廣泛應(yīng)用，不適合批量樣品檢測。

3 國內(nèi)外特殊膳食用食品中膽堿的檢測方法對比

目前，能夠檢測特殊膳食用食品中膽堿的方法有很多，從樣品處理、儀器、試劑等方面進(jìn)行比較，結(jié)果見表1。特殊膳食用食品中膽堿的檢測方法均有其特點(diǎn)及局限性，膽堿測定中樣品制備耗時最多，通常采用的水浴時間需要3 h，利用微波消解技術(shù)可以縮短時間。目前酶促反應(yīng)與分光光度法聯(lián)合使用是檢測膽堿最常用的方法，但酶價(jià)格較高，不適合大批量樣品的檢測；雷氏鹽法分光光度法前處理復(fù)雜；毛細(xì)管電泳、生物傳感器法研究較少，還未成熟；離子色譜法的電導(dǎo)檢測器為通用型檢測器，專一性差；液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用方法適合測定大批量樣品。

4 展望

膽堿因其功能越來越多被應(yīng)用到食品、醫(yī)藥領(lǐng)域?？焖?、準(zhǔn)確的膽堿檢測分析方法一直都是檢測人員研究的熱點(diǎn)，分光光度法是檢測膽堿中最常用的方法，但有一定的局限性。隨著儀器設(shè)備的發(fā)展，利用色譜法、質(zhì)譜法、電化學(xué)法檢測膽堿受到越來越多檢測人員的關(guān)注，但這些方法采用傳統(tǒng)的70 ℃酸水解3 h，耗時長，已經(jīng)有作者研究利用微波爐改進(jìn)水解方法，減少樣品前處理時間。因此優(yōu)化前處理方法，結(jié)合色譜、質(zhì)譜及電化學(xué)的儀器設(shè)備，將是未來膽堿檢測分析的發(fā)展方向。

參考文獻(xiàn)

[1]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝特殊膳食用食品標(biāo)簽：GB 13432—2013[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2013.

[2]常碧影，張麗英.當(dāng)前氯化膽堿的質(zhì)量與有關(guān)應(yīng)用的幾個問題[J].飼料廣角，2004（6）：31-34.

[3]ZEISEL S H，DA COSTA K A.Choline：an essential nutrient for public health[J].Nutr Rev，2009，67（11）：615-623.

[4]國家衛(wèi)生健康委員會，國家市場監(jiān)督管理總局.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰兒配方食品：GB 10765—2021[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2021.

[5]中華人民共和國衛(wèi)生部.特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品通則：GB 25596—2010[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[6]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品通則：GB 29922—2013[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2013.

[7]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 輔食營養(yǎng)補(bǔ)充品：GB 22570—2014[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014.

[8]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 孕婦及乳母營養(yǎng)補(bǔ)充食品：GB 31601—2015[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2015.

[9]國家衛(wèi)生健康委員會，國家市場監(jiān)督管理總局.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定：GB 5413.20—2022[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2022.

[10]WOOLLARD D C，INDYK H E.Determination of choline in milk and infant formulas by enzymatic analysis：collaborative study[J].Journal of Aoac International，2000，83（1）：131-138.

[11]KHAN S M，KHAN T M，WELLS R D，et al.A sensitive enzyme-based colorimetric assay for choline-containing phospholipids[J].Sci Food Agric，1992，58（3）：443-445.

[12]RADER J I，WEAVER C M，TRUCKSESS M W.Extension of AOAC official method 999.14 （choline in infant formula and milk） to the determination of choline in dietary supplements[J].AOAC Int，2004，87（6）：1297-1304.

[13]ANDRIEUX P，KILINC T，PERRIN C，et al.Simultaneous determination of free carnitine and total choline by liquid chromatography/mass spectrometry in infant formula and health-care products：single-laboratory validation[J].AOAC Int，2008，91（4）：777-785.

[14]ZHENG H，YU W J，XUE X，et al.Simultaneous determination of free and total choline and L-carnitine in infant formula using hydrophilic interaction liquid chromatography with tandem mass spectrometry[J].J Sep Sci，2018，41（16）：3176-3185.

[15]PANFILI G，MANZI P，COMPAGNONE D，et al.Rapid assay of choline in foods using microwave hydrolysis and a choline biosensor[J].J Agric Food Chem，2000，48（8）：3403-3407.

[16]CARTER N，TRENERRY V C.The determination of choline in vitamin preparations， infant formula and selected foods by capillary zone electrophoresis with indirect ultraviolet detection[J].Electrophoresis，1996，17（10）：1622-1626.

[17]SAUCERMAN J R，WINSTEAD C E，JONES T M.Quantitative gas chromatographic headspace determination of choline in adult and infant formula products[J].J Assoc Off Anal Chem，1984，67（5）：982-986.

[18]尹鳳芝，張慧.嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定：雷氏鹽分光光度法點(diǎn)[J].技術(shù)與應(yīng)用，2013，11（增刊1）：54-57.

[19]劉旻雯.酶比色法和雷氏鹽分光光度法在測定嬰幼兒乳粉中膽堿的比較[J].現(xiàn)代食品，2019（15）：174-177.

[20]梁喜玲.酶比色法和雷氏鹽分光光度法在測定特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中的膽堿含量的比較[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2021（9）：64-66.

[21]丁曉靜，田緒，李疆，等.毛細(xì)管區(qū)帶電泳-間接紫外檢測法測定嬰兒配方奶粉中的膽堿[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)，2018，9（10）：2228-2303.

[22]盧越圻，孫潔，金志浩，等.柱前衍生-高效液相色譜法測定嬰幼兒食品和乳品中膽堿含量[J].工業(yè)微生物，2022，52（6）：27-31.

[23]LAIKHTMAN M，ROHRER J S.Determination of choline in infant formula by ion chromatography[J].AOAC Int，1999，82（5）：1156-1162.

[24]潘拾朝，黎小蘭，陳宏壁.超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測定特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中膽堿含量[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)，2019，10（21）：7412-7417.

[25]薛靜.離子色譜法和高效液相色譜法測定奶粉中膽堿含量的研究[D].長春：東北師范大學(xué)，2008.

[26]LIMA J L F C，DELERUE-MATOS C，VAZ M C.Enzymatic determination of choline in milk using a FIA system with potentiometric detection[J].Analyst，2000，7：1281-1284.

[27]PATI S，QUNITO M，PALMISANO F，et al.Determination of choline in milk， milk powder， and soy lecithin hydrolysates by flow injection analysis and amperometric detection with a choline oxidase based biosensor[J].J Agric Food Chem，2004，52（15）：4638-4642.

[28]PATI S，PALMISANO F，QUINTO M，et al.Quantitation of major choline fractions in milk and dietary supplements using a phospholipase D bioreactor coupled to a choline amperometric biosensor[J].J Agric Food Chem，2005，53：6974-6979.