張雷雷 林韋康

摘 要：目的：為了探討西澳菲斯特農(nóng)場(chǎng)赤桉蜂蜜（Fewsters Farm Jarrah Honey，F(xiàn)FJH）改善大腸埃希菌腹瀉小鼠腸道的作用效果。方法：采用大腸埃希菌注射塑造相關(guān)性腹瀉小鼠模型，分為正常組、模型組、諾氟沙星組、市售蜂蜜組、FFJH組，成功建模后測(cè)定各組小鼠腹瀉率、腹瀉指數(shù)、體質(zhì)量、小腸推進(jìn)率和血清胃腸激素含量。結(jié)果：相對(duì)于正常組，模型組小鼠腹瀉指數(shù)明顯增加（P＜0.01）；相對(duì)于模型組，諾氟沙星組、市售蜂蜜高劑量組、FFJH低中高劑量組小鼠腹瀉指數(shù)均有所減少，有顯著性差異（P＜0.01）；相比模型組，F(xiàn)FJH低中高劑量組體質(zhì)量有顯著性差異（P＜0.01）；FFJH中高劑量組MTL含量明顯升高（P＜0.01）；FFJH中高劑量組顯著降低了小鼠血清VIP含量（P＜0.01）。結(jié)論：FFJH對(duì)大腸埃希菌腹瀉有顯著效果，可通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠腸道環(huán)境和修復(fù)腸道微生態(tài)，改善小鼠腹瀉的臨床癥狀。

關(guān)鍵詞：西澳菲斯特農(nóng)場(chǎng)赤桉蜂蜜；大腸埃希菌；小鼠腹瀉模型

Abstract： Objective： In order to explore the effect of Fewsters Farm jarrah honey on improving the intestinal tract of mouse with Escherichia coli diarrhea. Method： The model of diarrhea related mouse was established by injection of Escherichia coli， which was divided into normal group， model group， norfloxacin capsule group， commercially available honey group， and FFJH group. After successful modeling， the diarrhea mouse， diarrhea index， body mass， small intestine propulsion mouse and serum gastrointestinal hormone content of mouse in each group were determined. Result： Compared with the normal group， the diarrhea index of the model group was significantly increased （P < 0.01） ， while compared with the model group， the diarrhea index of the Norfloxacin group， the high dose honey group and the low， middle and high dose FFJH group were decreased， compared with the model group， the body weight of FFJH low， middle and high dose group had significant difference （P < 0.01） . The content of MTL in high dose FFJH group was significantly increased （P < 0.01） ， and the content of VIP in serum was significantly decreased in high dose FFJH group （P < 0.01） . Conclusion： FFJH has significant effect on diarrhea caused by Escherichia coli. It may improve the clinical symptoms of diarrhea in mouse by regulating the intestinal environment and repairing intestinal microecology.

Keywords： Fewsters Farm jarrah honey; Escherichia coli; mouse diarrhea model

腹瀉是全球范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問(wèn)題，人群患病范圍廣，發(fā)病率較高，同時(shí)在我國(guó)衛(wèi)生疾控方面被列為重點(diǎn)防治的疾病之一[1]。長(zhǎng)期研究表明，腸道微生態(tài)平衡環(huán)境對(duì)機(jī)體的健康有著重要的影響[2]，機(jī)體的腸道疾病也可能與其腸道微生態(tài)平衡紊亂有著密切聯(lián)系[3]?？股啬軌驓⑺烂舾胁≡?，但也會(huì)破壞機(jī)體腸道中菌群環(huán)境平衡，甚至影響正常的新陳代謝[4]，進(jìn)而引發(fā)腸道的正常消化功能紊亂和機(jī)體免疫力下降，并伴有腹瀉等癥狀[5]。

蜂蜜的使用范圍較廣。蜂蜜可以通過(guò)抗菌性能緩解炎癥，還可以修復(fù)腸道黏膜，改善腸道微生態(tài)，使其達(dá)到平衡狀態(tài)[6-7]。桉樹(shù)蜜呈深琥珀色，新鮮蜜桉醇味較濃，對(duì)跌打損傷、癰腫瘡瘍及抗感染等有較高的藥用價(jià)值[8]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑

西澳菲斯特農(nóng)場(chǎng)赤桉蜂蜜（Fewsters Farm Jarrah Honey，F(xiàn)FJH）；致病性大腸埃希菌；小鼠血管活性腸肽（VIP）ELISA試劑盒；小鼠胃動(dòng)素（MTL）ELISA試劑盒；諾氟沙星。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

XPR電子分析天平；BX63-CellSens型全電動(dòng)智能顯微鏡；BIO-RAD680型酶標(biāo)儀；Wellwash Versa雙排全自動(dòng)洗板機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6小鼠，雄性，SPF級(jí)，個(gè)體質(zhì)量（20±2） g，6～8周齡，動(dòng)物在（23±1）℃的環(huán)境中，在相對(duì)濕度55%±15%、12 h的光/暗循環(huán)條件下，可以自由取食和飲水。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法及檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 FFJH對(duì)小鼠體重、腹瀉率、腹瀉指數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)將C57BL/6 雄性小鼠隨機(jī)分為9組，每組15只，分別為正常組，造模組，諾氟沙星組，市售蜂蜜低劑量組、中劑量組、高劑量組，F(xiàn)FJH低劑量組、中劑量組、高劑量組。除正常小鼠，其余各組均于腹腔注射0.4 mL 5×108 CFU·mL-1的大腸埃希菌溶液，連續(xù)給藥3 d。造模小鼠出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)減少、肛周污穢、便溏，即可視為造模成功。

造模成功后開(kāi)始給藥，正常組市售蜂蜜和模型組市售蜂蜜小鼠給予相同體積的生理鹽水，其他各組小鼠可根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)給予不同藥物，每日給藥1次，給藥體積0.4 mL，連續(xù)15 d。實(shí)驗(yàn)分組情況為諾氟沙星組（0.56 mg·kg-1）、市售蜂蜜低（20%）、中（40%）、高（80%）劑量組和FFJH低（20%）、中（40%）、高（80%）劑量組。給藥15 d后，記錄小鼠體重。

依照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》（第4版）[9]，分別測(cè)定實(shí)驗(yàn)第0 d、1 d、3 d、5 d、7 d、9 d小鼠腹瀉率。觀察各組小鼠注射大腸埃希菌后4 h內(nèi)的排便情況并記錄[10]，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組計(jì)算腹瀉指數(shù)，計(jì)算公式如下。

腹瀉率=腹瀉動(dòng)物數(shù)/該組動(dòng)物總數(shù)×100%；腹瀉指數(shù)=稀便率×平均稀便級(jí)。

1.4.2 FFJH對(duì)小鼠小腸推進(jìn)率的影響

通過(guò)注射大腸埃希菌溶液，建立小鼠腹瀉模型，計(jì)算給定時(shí)間內(nèi)小腸內(nèi)部的碳末的推進(jìn)率，以此評(píng)判模型小鼠的胃腸蠕動(dòng)功能水平[11]。小鼠同1.4.1方法處理，除正常組，在其他小鼠最后一次給藥0.5 h后，灌胃0.2 mL 5%碳末懸液。灌胃結(jié)束1 h后，脫頸處死小鼠，打開(kāi)腹腔，取自幽門(mén)至回盲部的腸管部分，放置于托盤(pán)上，輕拉成一條直線，小腸總長(zhǎng)度通過(guò)測(cè)量腸管長(zhǎng)度得出，計(jì)算小腸碳末推進(jìn)率。

1.4.3 FFJH對(duì)小鼠血清胃腸激素的影響

給藥周期結(jié)束后，小鼠在禁食12 h，通過(guò)摘去眼球取血，靜置1.5 h，以3 000 r·min-1 離心10 min，分離血清于-20 ℃冰箱留存。根據(jù)ELISA試劑盒的相關(guān)說(shuō)明書(shū)測(cè)定胃動(dòng)素（Motilin，MTL）、血管活性腸肽（Vasoactine Intrestinal Peptide，VIP）含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 FFJH對(duì)大腸埃希菌腹瀉小鼠模型小鼠體重的影響

FFJH對(duì)大腸埃希菌腹瀉小鼠模型小鼠體重的影響如圖1所示。模型組小鼠注射大腸埃希菌之后，進(jìn)食量、飲水量均減少，精神萎靡，被毛散亂無(wú)光澤，肛周毛發(fā)被稀便污染，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后小鼠體重較正常組顯著降低（P＜0.01），出現(xiàn)了明顯的腹瀉現(xiàn)象。相比模型組，F(xiàn)FJH低、中、高劑量組小鼠飲食及活動(dòng)顯著增加（P＜0.01），精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，肛周毛發(fā)較干凈，腹瀉癥狀減輕。這些結(jié)果表明FFJH對(duì)大腸埃希菌腹瀉小鼠具有一定的修復(fù)作用。

##表示與正常組（空白組）相比差異極顯著（P＜0.01）；**表示與模型組相比差異極顯著，P＜0.01。

2.2 FFJH對(duì)小鼠腹瀉率和腹瀉指數(shù)的影響

2.2.1 FFJH對(duì)小鼠腹瀉率的影響

造模小鼠3 d后開(kāi)始出現(xiàn)活動(dòng)減少、精神萎靡、肛周污穢、便溏的現(xiàn)象。模型組，諾氟沙星組，市售蜂蜜中、高劑量組，F(xiàn)FJH低、中、高劑量組腹瀉率均為100%，市售蜂蜜低劑量組腹瀉率為90%，認(rèn)為塑造大腸桿菌腹瀉小鼠模型成功。實(shí)驗(yàn)第5 d，模型組小鼠腹瀉率為80%，市售蜂蜜低、中、高劑量組小鼠腹瀉率為80%，F(xiàn)FJH低劑量組小鼠腹瀉率均為80%，F(xiàn)FJH中、高劑量組小鼠腹瀉率為70%。實(shí)驗(yàn)第9 d，各給藥組小鼠情況逐漸好轉(zhuǎn)，僅有市售蜂蜜低劑量組和模型組小鼠存在腹瀉現(xiàn)象，其精神仍舊萎靡，活動(dòng)較少。

2.2.2 FFJH對(duì)小鼠腹瀉指數(shù)的影響

由圖2可知，相對(duì)于正常組，模型組小鼠的腹瀉指數(shù)顯著增加（P＜0.01），說(shuō)明造模成功。相對(duì)于模型組，諾氟沙星組，市售蜂蜜高劑量組，F(xiàn)FJH低、中、高劑量組小鼠的腹瀉指數(shù)均有顯著減少（P＜0.01）。

##表示與正常組相比差異極顯著，P＜0.01；**表示與模型組相比差異極顯著，P＜0.01。

2.3 FFJH對(duì)小鼠小腸推進(jìn)率的影響

由圖3可知，與正常組相比，模型組碳末推進(jìn)率顯著增高（P＜0.01），說(shuō)明腹瀉模型制備成功。與模型組相比，諾氟沙星組，F(xiàn)FJH低、中、高劑量可顯著降低模型小鼠的小腸推進(jìn)率（P＜0.01），說(shuō)明FFJH在腹瀉條件下能顯著改善鼠腸道環(huán)境。

##表示與正常組相比差異極顯著，P＜0.01；**表示與模型組相比差異極顯著，P＜0.01。

2.4 FFJH對(duì)小鼠血清胃腸激素的影響

由圖4可知，與正常組相比，模型組小鼠的血清MTL含量出現(xiàn)顯著降低，VIP含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，F(xiàn)FJH中劑量組MTL含量明顯升高（P＜0.05），F(xiàn)FJH高劑量組MTL含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，諾氟沙星組、FFJH中劑量組和FFJH高劑量組顯著降低了小鼠血清VIP含量（P＜0.01），市售蜂蜜低、中、高劑量組和FFJH低劑量組可明顯降低小鼠血清VIP含量（P＜0.05），提示FFJH具有一定改善消化道環(huán)境的作用。

3 結(jié)論與討論

綜上所述，本試驗(yàn)采用注射大腸埃希菌溶液，采用大腸埃希菌注射塑造相關(guān)性腹瀉小鼠模型，通過(guò)測(cè)定各組小鼠體質(zhì)量、腹瀉率和腹瀉指數(shù)、小腸推進(jìn)率和血清胃腸激素含量，發(fā)現(xiàn)FFJH可以改善大腸桿菌所致腹瀉小鼠的體重、腹瀉率及血清胃腸激素等相關(guān)指標(biāo)，對(duì)機(jī)體有一定的修復(fù)作用。本研究也存在一定不足之處，實(shí)驗(yàn)雖然證明了FFJH可以通過(guò)其專用特性及改善腸道微生態(tài)能夠改善腹瀉，卻并未對(duì)腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)相關(guān)的具體的發(fā)生機(jī)制進(jìn)一步探究。

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