趙嵩

摘 要：ATP生物發(fā)光技術(shù)是基于螢火蟲(chóng)發(fā)光原理，利用“熒光素酶-熒光素體系”快速檢測(cè)三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate，ATP）來(lái)判斷衛(wèi)生狀況，其具有操作簡(jiǎn)單、快速、方便的特點(diǎn)，ATP生物發(fā)光技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品接觸表面清潔效果的評(píng)價(jià)。本文以某企業(yè)選擇ATP衛(wèi)生監(jiān)測(cè)系統(tǒng)開(kāi)展的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)為例，構(gòu)建ATP驗(yàn)證方案，包括靈敏度、衰減率、重復(fù)性以及實(shí)際樣本檢測(cè)，可幫助企業(yè)科學(xué)有效地選擇適合的ATP衛(wèi)生監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。

關(guān)鍵詞：生物發(fā)光技術(shù)；腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）；清潔效果；驗(yàn)證評(píng)價(jià)

Abstract： ATP bioluminescence technology is based on the glow principle of firefly luminescence， and uses the “Luciferase luciferin system” to rapidly detect ATP， which is used to judge the health status. It has the characteristics of simple operation， fast and convenient. ATP bioluminescence technology has been widely used to evaluate the cleaning effect of food contact surfaces. This study takes the validation of a certain brand of ATP health monitoring system as an example to build an ATP validation scheme， including sensitivity， decay rate， repeatability， and actual sample testing， which can help enterprises choose an appropriate ATP health monitoring systems more scientifically and effectively.

Keywords： bioluminescence technology; adenosine triphosphate（ATP）; cleaning effect; validation evaluation

腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine Triphosphate，ATP）又稱(chēng)三磷酸腺苷。ATP是一切生命體能量的直接來(lái)源，普遍存在于動(dòng)植物、細(xì)菌、真菌細(xì)胞和食物殘?jiān)校鵁o(wú)生命的碎屑物質(zhì)中不存在ATP[1]。生物活性物質(zhì)中的ATP含量是相對(duì)恒定的，借助“熒光素-熒光素酶”發(fā)光反應(yīng)可對(duì)ATP進(jìn)行定量測(cè)試，從而反映出生物細(xì)胞量的殘留。ATP與熒光素反應(yīng)發(fā)出的熒光強(qiáng)度（Relative Light Unit，RLU）與活細(xì)胞數(shù)量基本呈正比例關(guān)系[2]。熒光值越高，表明ATP的量越多，也就意味著表面的殘留物越多，清潔狀態(tài)越差。因此，ATP檢測(cè)法就被用來(lái)快速檢驗(yàn)物品表面是否潔凈。

RLU值越高代表存在微生物污染風(fēng)險(xiǎn)的可能性越大，但ATP不能替代微生物涂抹檢測(cè)，一般ATP的靈敏度可達(dá)到10-15 mol ATP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（有的品牌甚至更高），以細(xì)菌為例基本也要達(dá)到103才能達(dá)到ATP的檢測(cè)靈敏度[3]。研究表明，只有純微生物培養(yǎng)物而沒(méi)有任何食物殘?jiān)那闆r下，熒光強(qiáng)度（RLU）和菌落數(shù)（Colony-Forming Units，CFU）呈很好的正相關(guān)關(guān)系[4]。

ATP生物發(fā)光技術(shù)由于具有操作簡(jiǎn)單、快速、方便的特點(diǎn)，能夠簡(jiǎn)單快速驗(yàn)證清潔消毒效果而被廣泛應(yīng)用于食品、制藥、醫(yī)療和養(yǎng)殖等行業(yè)。隨著ATP生物發(fā)光技術(shù)的普及，市場(chǎng)也涌現(xiàn)了大量的ATP衛(wèi)生監(jiān)測(cè)系統(tǒng)品牌，如3M、海凈納、龜甲萬(wàn)、天隆、美正、巔峰、綠洲等品牌，其價(jià)格和性能差異較大，也造成了用戶(hù)選擇的困惑。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

兩個(gè)品牌ATP衛(wèi)生監(jiān)測(cè)系統(tǒng)（包括ATP熒光檢測(cè)儀和表面ATP采樣拭子）；Pipet-lite移液槍?zhuān)绹?guó)RAININ公司）；sx500高壓滅菌鍋（日本TOMY公司）；ATP標(biāo)準(zhǔn)品（Merck，貨號(hào)：A1852-1VL）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、大腸桿菌（ATCC 25922）、啤酒酵母菌（ATCC 10231）。

1.2 使用方法

從2～8 ℃環(huán)境中取出ATP表面采樣拭子，放置10～20 min使其恢復(fù)至室溫狀態(tài)。撕開(kāi)包裝袋，取出采樣拭子。拔出含有潤(rùn)濕棉簽的手柄，若涂抹表面，則按Z字形涂抹待測(cè)表面10 cm×10 cm的區(qū)域；若檢測(cè)ATP液體標(biāo)準(zhǔn)品，則將20 μL待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品滴加至棉簽上。后將棉簽插回拭子內(nèi)并按下，使其與底液接觸，將檢測(cè)管左右搖晃5～10 s，充分混勻后，插入對(duì)應(yīng)品牌的ATP熒光檢測(cè)儀，點(diǎn)擊快速檢測(cè)即可。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證方法

1.3.1 靈敏度

靈敏度是驗(yàn)證一個(gè)系統(tǒng)/方法的重要性能指標(biāo)。先進(jìn)行陰性值檢測(cè)，來(lái)確定ATP的本底值。兩種品牌分別取6支拭子，無(wú)需取出棉簽，直接按下手柄使棉簽與反應(yīng)液接觸，按照1.2進(jìn)行操作。靈敏度驗(yàn)證方法為取ATP標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋多個(gè)濃度梯度，取1×10-13 mol和1×10-15 mol兩個(gè)濃度，按照1.2進(jìn)行分別檢測(cè)，重復(fù)8次。對(duì)比不同ATP標(biāo)準(zhǔn)品濃度檢測(cè)值與陰性值，與陰性有顯著差異的最低檢測(cè)濃度為其靈敏度。

1.3.2 衰減率

ATP反應(yīng)激發(fā)后，其熒光信號(hào)會(huì)隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐步衰減，考慮到檢測(cè)人員在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的過(guò)程中易受外界因素的影響，衰減過(guò)快可能會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。衰減率的驗(yàn)證方法為測(cè)定拭子在5 min內(nèi)的熒光檢測(cè)值衰減率，吸取20 μL不同濃度梯度ATP標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，測(cè)定兩個(gè)品牌的ATP在反應(yīng)開(kāi)始后5 min內(nèi)的熒光衰減率，分別在反應(yīng)1 min、2 min、3 min、4 min和5 min時(shí)進(jìn)行讀值。

1.3.3 重復(fù)性

精密度是保證獲得良好準(zhǔn)確度的先決條件，一般情況下，測(cè)量精密度不好，就不可能有良好的準(zhǔn)確度，而重復(fù)性是精密度的一個(gè)重要度量方式。取一份高濃度（1×10-13 mol）ATP標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，分別檢測(cè)兩個(gè)品牌ATP在同一濃度下的重復(fù)性，檢測(cè)方法參考1.2。同一濃度ATP標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)測(cè)試10次，計(jì)算10次結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD），重復(fù)性用RSD表示。

1.4 實(shí)際檢測(cè)效果驗(yàn)證方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株檢測(cè)

選取較為常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌（大腸埃希氏菌，ATCC 25922）、革蘭氏陰性細(xì)菌（金黃色葡萄球菌，ATCC 6538）和真菌（酵母菌，ATCC 10231），分別檢測(cè)兩個(gè)品牌ATP對(duì)不同菌體的檢測(cè)靈敏度。

取新鮮菌液，稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4和10-5梯度，從兩個(gè)品牌的ATP表面采樣拭子中取出棉簽，用移液槍準(zhǔn)確移取20 μL菌液滴于棉簽頭上，等待30 s，然后將棉簽插回檢測(cè)管內(nèi)并按下，使其與底液接觸，將檢測(cè)管左右搖晃5～10 s，插入對(duì)應(yīng)的ATP熒光檢測(cè)儀，等待30 s，開(kāi)始檢測(cè)。將得到的熒光值與菌落數(shù)一一對(duì)應(yīng)。把不同濃度菌液的檢測(cè)熒光值與ATP拭子自身陰性值進(jìn)行對(duì)比，有顯著差異的最低濃度即為菌液的檢測(cè)靈敏度。

1.4.2 實(shí)際表面檢測(cè)

對(duì)桌面進(jìn)行清潔消毒后，將桌面劃分為相鄰的20塊10 cm×10 cm的面積，分別用2個(gè)品牌的ATP進(jìn)行檢測(cè)，操作方法參照1.2。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈敏度驗(yàn)證結(jié)果

由表1可知，在標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1×10-15 mol的 ATP水平上，兩個(gè)品牌ATP仍能檢出RLU值，且結(jié)果與陰性有顯著差異；10-15 mol ATP濃度下，品牌一檢測(cè)值約是品牌二的1.8倍，陰性值約為1.5倍，倍數(shù)關(guān)系基本一致，由于在10-15 mol ATP濃度的熒光值與陰性熒光值有較大差異，故二者的檢測(cè)靈敏度一致，均為10-16 mol ATP。

2.2 衰減率驗(yàn)證結(jié)果

采用兩個(gè)品牌的ATP衛(wèi)生監(jiān)測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)不同濃度ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液，由表2可知，品牌一在濃度1×10-13 mol反應(yīng)第5 min時(shí)熒光值是最高熒光值的95%；在濃度1×10-15 mol反應(yīng)第5 min時(shí)，熒光值是最高熒光值的97%。品牌二在濃度1×10-13 mol反應(yīng)第5 min時(shí)熒光值是最高熒光值的94%；在濃度1×10-15 mol反應(yīng)第5 min時(shí)，熒光值是最高熒光值的89%。從數(shù)據(jù)上看，兩個(gè)品牌的衰退率都滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求（25%以?xún)?nèi)）[5]，但品牌一的衰減率表現(xiàn)更佳。

2.3 重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果

在同濃度ATP水平下，兩個(gè)品牌ATP衛(wèi)生監(jiān)測(cè)系統(tǒng)10次檢測(cè)結(jié)果的RSD均為9%，偏差值小于15%，均能滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求，詳見(jiàn)表3。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)菌株驗(yàn)證結(jié)果

采用金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、大腸桿菌（ATCC25922）、白色念珠菌（ATCC10231）3種常見(jiàn)菌株，在不同菌株濃度下進(jìn)行ATP的驗(yàn)證。結(jié)果顯示，兩個(gè)品牌的ATP衛(wèi)生監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)值顯示出穩(wěn)定的倍數(shù)關(guān)系，具體驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表4、表5、表6，且隨著菌株濃度的降低，檢測(cè)值均呈現(xiàn)較好的梯度關(guān)系。菌株在高濃度下，檢測(cè)值或存在偏低情況，與低濃度不完全呈線(xiàn)性關(guān)系，但影響較小。

2.5 實(shí)際表面檢測(cè)結(jié)果

選取同一桌面的相鄰區(qū)域，分別用兩個(gè)品牌的ATP表面采樣拭子進(jìn)行涂抹取樣和檢測(cè)，并計(jì)算其RSD。從表7結(jié)果可以看出，兩個(gè)品牌的檢測(cè)值及其趨勢(shì)表現(xiàn)基本一致。

3 結(jié)論

通過(guò)上述驗(yàn)證，兩個(gè)品牌的ATP衛(wèi)生監(jiān)測(cè)系統(tǒng)靈敏度一致，均為1×10-16 mol，在衰減率、重復(fù)性測(cè)試上表現(xiàn)基本一致，兩個(gè)品牌在菌株檢測(cè)和實(shí)際表面樣品檢測(cè)中，檢測(cè)結(jié)果與線(xiàn)性趨勢(shì)基本一致，說(shuō)明兩個(gè)品牌的ATP衛(wèi)生監(jiān)測(cè)系在菌株裂解效力和檢測(cè)靈敏度上有很好的一致性。在實(shí)際驗(yàn)證中，用戶(hù)可根據(jù)以上驗(yàn)證方案，選擇重復(fù)性和衰減率更佳的品牌，至于靈敏度，可根據(jù)用戶(hù)對(duì)潔凈度要求情況來(lái)選擇，此外還需要結(jié)合性能和價(jià)格綜合考慮，最終篩選出最合適的ATP衛(wèi)生監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。

參考文獻(xiàn)

[1]侯英，吳雪瓊，王興華.ATP生物發(fā)光原理及應(yīng)用研究[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，7（12）：12-13.

[2]張鳳蘭，徐瀟，王海燕，等.ATP生物發(fā)光法評(píng)價(jià)餐飲具的微生物污染研究[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2016，7（3）：911-916.

[3]丘勒紅，梁俊健，林淑儀，等.ATP生物熒光法在乳品企業(yè)清洗效果評(píng)價(jià)方面的應(yīng)用[J].中國(guó)乳業(yè)，2022（10）：72-76.

[4]許慧瓊，王一梅，朱軍生，等.ATP生物熒光法在洗手效果評(píng)價(jià)中的應(yīng)用[J].中國(guó)消毒學(xué)雜志，2018，35（5）：370-372.

[5]董曼曼，衛(wèi)星華，孫曉，等.手持式ATP熒光檢測(cè)儀性能評(píng)價(jià)[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2018，9（11）：2627-2630.