陳延寧 侯亞茹 杜麗霞 艾慶蕊 張大虎 侯少陽(yáng)

摘 要：目的：基于腸桿菌科基因間重復(fù)共有序列聚合酶鏈反應(yīng)（Enterobacterialrepetitive Intergenic Consensus PCR，ERIC-PCR）技術(shù)，設(shè)計(jì)特異性引物探針，實(shí)現(xiàn)干酪乳桿菌的靶向檢測(cè)。方法：以干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）HP-B1142為研究對(duì)象，通過(guò)不同實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）的ERIC-PCR反應(yīng)體系。通過(guò)凝膠電泳獲得特定的條帶，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序和分析，設(shè)計(jì)出特異性的引物探針，達(dá)到對(duì)干酪乳桿菌靶向鑒別的目的。結(jié)果：通過(guò)不同實(shí)驗(yàn)，得到干酪乳桿菌的最佳ERIC-PCR反應(yīng)體系；基于干酪乳桿菌ERIC基因片段，獲得兩對(duì)特異性引物，可在多種DNA的混合溶液中快速靶向鑒別出干酪乳桿菌。結(jié)論：基于ERIC-PCR技術(shù)獲得的特異性引物探針，可高效、靈敏地實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生境中干酪乳桿菌檢出。

關(guān)鍵詞：聚合酶鏈反應(yīng)；干酪乳桿菌；靶向檢測(cè)；引物探針

Abstract： Objective： To design specific primer probes based on ERIC-PCR technology to achieve targeted detection of Lactobacillus casei. Method： Using Lactobacillus casei HP-B1142 as the research object， the ERIC-PCR reaction system of Lactobacillus casei was optimized through different experiments. Specific bands were obtained by gel electrophoresis， sequenced and analyzed， and specific primer probes were designed to achieve the purpose of targeted identification of Lactobacillus casei. Result： Through different experiments， the optimal ERIC-PCR reaction system for Lactobacillus casei was obtained. Based on the ERIC gene fragment of Lactobacillus casei， two pairs of specific primers were obtained， which can quickly target and identify Lactobacillus casei in a mixture of multiple DNA solutions. Conclusion： The specific primer probe obtained based on ERIC-PCR technology can efficiently and sensitively detect Lactobacillus casei in complex habitats.

Keywords： polymerase chain reaction; Lactobacillus casei; targeted detection; primer probes

益生菌（Probiotics）于1907年由梅切尼科夫首次提出。益生菌廣泛存在于人體內(nèi)，種類(lèi)多樣，具有促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收、提高機(jī)體免疫力等功能。此外，研究發(fā)現(xiàn)益生菌用于發(fā)酵乳制品能夠有效緩解乳糖不耐受癥狀[1]。此外，益生菌對(duì)維持宿主腸道菌群平衡有非常重要的作用[2-3]，同時(shí)，益生菌還可用于治療兒童急性腹瀉[4]。干酪乳桿菌屬于乳桿菌屬，為革蘭氏陽(yáng)性菌，作為益生菌的一種，具有降血壓、降膽固醇、抑制腫瘤生長(zhǎng)的功能，同時(shí)可以促進(jìn)細(xì)胞分裂，具有增強(qiáng)人體免疫以及預(yù)防癌癥等作用[5]。目前針對(duì)腸道細(xì)菌的鑒定技術(shù)主要有生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)、16S rRNA測(cè)序比對(duì)和細(xì)菌特異性基因檢測(cè)、全基因組測(cè)序[6]等分子生物學(xué)方法[7]。近些年來(lái)發(fā)展的基質(zhì)輔助激光解析飛行質(zhì)譜技術(shù)，可以通過(guò)檢測(cè)菌體蛋白質(zhì)指紋圖譜達(dá)到對(duì)不同細(xì)菌屬、種的鑒定[8]，同時(shí)基于MALDI-TOF的分型方法也在快速發(fā)展當(dāng)中[9]。但是上述方法均存在操作復(fù)雜等問(wèn)題，急需一種簡(jiǎn)便、高效的干酪乳桿菌鑒別方法，實(shí)現(xiàn)干酪乳桿菌的痕量檢出。

ERIC序列，即腸桿菌基因間重復(fù)序列，首先由Sharples等[10]于1990年發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌，并將其命名為基因間重復(fù)單位[11]。腸桿菌科基因間重復(fù)共有序列聚合酶鏈反應(yīng)（Enterobacterialrepetitive Intergenic Consensus PCR，ERIC-PCR）是根據(jù)ERIC的核心序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增兩個(gè)ERIC之間序列，不同細(xì)菌的ERIC序列在染色體的位置不一樣，因此可以根據(jù)擴(kuò)增條帶位置和數(shù)量來(lái)判斷是否為同一基因型多位點(diǎn)序列分型[12]，ERIC序列具有高度保守性，因此通過(guò)普通PCR方法擴(kuò)增片段可以獲得DNA指紋圖譜[13]。ERIC-PCR技術(shù)在DNA指紋圖譜技術(shù)中的廣泛應(yīng)用使得細(xì)菌在亞種層次上的鑒別分類(lèi)有了更好的依據(jù)[14-15]。由于此方法較傳統(tǒng)鑒別方法更為便利，目前被廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)中的菌株鑒別分類(lèi)方面。由于細(xì)菌基因組的復(fù)雜性，不同的細(xì)菌會(huì)有不同的反應(yīng)條件，通過(guò)不斷優(yōu)化反應(yīng)體系，利用ERIC-PCR技術(shù)設(shè)計(jì)出特異性引物，可在不同的細(xì)菌DNA中靶向鑒別出特定的菌株。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用ERIC-PCR技術(shù)設(shè)計(jì)出特異性引物，首先將目的菌株進(jìn)行分離純化，再運(yùn)用改良的SDS堿裂解法提取目的菌株的DNA，通過(guò)對(duì)比不同反應(yīng)條件下的結(jié)果，對(duì)ERIC-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，再將產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，并將目的片段進(jìn)行回收測(cè)序，得到測(cè)序結(jié)果后，運(yùn)用DNAMAN V6軟件進(jìn)行特異性引物的設(shè)計(jì)，最終得到特異性引物并進(jìn)行驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的特異性引物可以在菌株混合基因組DNA中通過(guò)PCR技術(shù)檢測(cè)出干酪乳桿菌，提高了菌種的特異性鑒別效率。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

S1010掌上離心機(jī)，美國(guó)賽洛捷克；DYY-6C型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；YXQ-75G全自動(dòng)數(shù)顯立式高壓蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海皓莊儀器有限公司；T100 Thermal PCR儀，美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2 材料與試劑

瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，康為世紀(jì)生物科技有限公司；2K plus Ⅱ DNA marker，北京全式金生物科技有限公司；純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；Tris堿、十二烷基硫酸鈉（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS），德國(guó)Sigma公司；溴化乙錠（Ethidium Bromide，EB），美國(guó)Amresco公司；Taq DNA聚合酶、T5單克隆載體，北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 目的基因DNA的提取純化

將干酪乳桿菌HP-B1142接種至MRS固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h，獲得純化的目的菌株。目前有許多提取DNA的方法，為了提高實(shí)驗(yàn)效率，本實(shí)驗(yàn)使用改良的SDS堿裂解法，用50 μL含有RNase A酶（10 mg·L-1）的1×TE溶液重懸，于-20 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 設(shè)計(jì)特異性引物探針

使用ERIC-PCR技術(shù)對(duì)HP-B1142基因組DNA進(jìn)行PCR，對(duì)長(zhǎng)度約為2 700 bp和500 bp的兩條DNA片段進(jìn)行回收，連接至T5載體，送至金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

將得到的兩組測(cè)序結(jié)果利用BLAST在線比對(duì)工具進(jìn)行比對(duì)分析，同時(shí)將序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，接收序列號(hào)分別為OP700792、OP700793。利用DNAMAN V6軟件設(shè)計(jì)出對(duì)應(yīng)片段的特異性引物，最后進(jìn)行引物的特異性檢驗(yàn)。

1.3.3 引物探針的含量限度檢驗(yàn)

從實(shí)驗(yàn)室自建微生物資源菌庫(kù)中選取5株常用益生菌菌株，分別為植物乳桿菌HP-B1098、鼠李糖乳桿菌HP-B1083、副干酪乳桿菌HP-B1145、嗜酸乳桿菌HP-B1079、瑞士乳桿菌HP-B1126，將其作為陰性對(duì)照。取以上5種細(xì)菌等濃度的混合DNA溶液，等量混合，使混合基因組DNA濃度與干酪乳桿菌基因組DNA濃度相等。將干酪乳桿菌基因組DNA與5種細(xì)菌的混合DNA溶液相混合，配制成干酪乳桿菌基因組DNA相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%（絕對(duì)含量900 ng·mL-1）、30%（絕對(duì)含量270 ng·mL-1）、3%（絕對(duì)含量27 ng·mL-1）、0%（絕對(duì)含量0 ng·mL-1）的混合溶液作為模板，使用設(shè)計(jì)的兩對(duì)特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.3.4 引物的特異性檢驗(yàn)

為了檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)中的兩組特異性引物是否可以特異性鑒別干酪乳桿菌，特從實(shí)驗(yàn)室中選取了其他不同的5種細(xì)菌進(jìn)行檢驗(yàn)。5種細(xì)菌分別為植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌、瑞士乳桿菌。以本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的1142-a-F/1142-a-R為一對(duì)引物，1142-2-F/1142-2-R為一對(duì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.3.5 引物的普適性檢驗(yàn)

為了確定該引物探針是否可以通用地檢測(cè)出干酪乳桿菌這一菌種，現(xiàn)選取干酪乳桿菌的近緣菌株進(jìn)行普適性檢驗(yàn)，驗(yàn)證其通用性。將Lactobacillus casei DSM 20011、Lactobacillus case JCM 8129、Lactobacillus case IDCC 3451、Lactobacillus case JX 20225、Lactobacillus case ATCC 11443共5株近緣干酪乳桿菌作為引物探針普適性檢驗(yàn)的對(duì)照，分別對(duì)上述菌株及本實(shí)驗(yàn)所研究的干酪乳桿菌HP-B1142進(jìn)行PCR，以所設(shè)計(jì)的1142-a-F/1142-a-R為一對(duì)引物，1142-2-F/1142-2-R為一對(duì)引物，進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.3.6 運(yùn)用兩對(duì)特異性引物檢驗(yàn)市售公示配方中含有干酪乳桿菌的產(chǎn)品

通過(guò)選取3種市售產(chǎn)品來(lái)進(jìn)行檢驗(yàn)，可以用來(lái)確定本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的兩對(duì)特異性引物是否可以精準(zhǔn)檢驗(yàn)出產(chǎn)品中的干酪乳桿菌，檢測(cè)其實(shí)用效果。選取3種市售公示配方中含有干酪乳桿菌的產(chǎn)品，提取產(chǎn)品基因組DNA為模板，以所設(shè)計(jì)的1142-a-F/1142-a-R為一對(duì)引物，1142-2-F/1142-2-R為一對(duì)引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA測(cè)序及特異性引物的設(shè)計(jì)

以干酪乳桿菌DNA作為模板進(jìn)行ERIC-PCR操作，獲得長(zhǎng)度約為2 000 bp和500 bp的兩條DNA條帶，通過(guò)測(cè)序獲得其DNA序列，長(zhǎng)度分別為1 815 bp和428 bp。使用DNAMAN V6軟件分別設(shè)計(jì)出針對(duì)兩條DNA片段的特異性引物探針。引物探針命名及序列分別為1142-a-F：5'-CTAAGGTAGCTGATCGGTGGCACGATC-3'，1142-a-R：5'-CACTCTTGCCAATGGTCATCGCTG-3'；1142-2-F：5'-CAATCCATCAGTCAGAATGTGGAAGC-3'，1142-2-R：5'-CGAATGCACATGAGGATATCATTTCAGC-3'。同時(shí)使用兩對(duì)特異性引物以干酪乳桿菌HP-B1142基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，可以得到條帶清晰長(zhǎng)度約為400 bp和1 800 bp的目標(biāo)片段，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1。

M：2K plus Ⅱ DNA marker；A圖中1以1142-2-F/1142-2-R為引物、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）HP-B1142基因組DNA為模板進(jìn)行驗(yàn)證。B圖中1以1142-a-F/1142-a-R為引物、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）HP-B1142基因組DNA為模板進(jìn)行驗(yàn)證。

2.2 引物的特異性檢驗(yàn)

為了確定本特異性引物是否具有特異性，是否能達(dá)到特異性鑒別干酪乳桿菌的目的，采用PCR的方式驗(yàn)證兩對(duì)引物探針的特異性。對(duì)所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，由圖2可知，以干酪乳桿菌基因組DNA為模板的1、2泳道可成功獲得目標(biāo)條帶，而以其他菌株基因組DNA為模板的泳道均無(wú)法得到目標(biāo)條帶。由此，該特異性引物探針可特異性檢出干酪乳桿菌。

M：2K plus Ⅱ DNA marker；圖中1、3、5、7、9、11皆選用1142-a-F/1142-a-R為引物，所選用模板分別為干酪乳桿菌HP-B1142、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌、瑞士乳桿菌基因組DNA。圖中2、4、6、8、10、12皆選用1142-2-F/1142-2-R為引物，所選用模板分別為干酪乳桿菌HP-B1142、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌、瑞士乳桿菌基因組DNA。

2.3 引物探針可檢測(cè)基因組DNA的含量限度檢驗(yàn)

為確定本研究所設(shè)計(jì)的兩對(duì)特異性引物探針可檢測(cè)的基因組DNA含量限度，以混合DNA溶液為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。對(duì)所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。由圖3中可知，在干酪乳桿菌基因組DNA濃度為27 ng·mL-1時(shí)，本實(shí)驗(yàn)的兩對(duì)引物探針依然可完成干酪乳桿菌的特異性檢出。

M：2K Plus Ⅱ DNA marker；1～2泳道為干酪乳桿菌含量100%（絕對(duì)含量900 ng·mL-1）、3～4泳道為干酪乳桿菌含量30%（絕對(duì)含量270 ng·mL-1）、5～6泳道為干酪乳桿菌含量3%（絕對(duì)含量27 ng·mL-1）、7～8泳道為干酪乳桿菌含量0%（絕對(duì)含量0 ng·mL-1）的溶液。1、3、5、7泳道使用的引物探針是1142-a-F/1142-a-R，2、4、6、8泳道使用的引物探針是1142-2-F/1142-2-R。

2.4 引物探針普適性檢驗(yàn)

由于干酪乳桿菌作為益生菌被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)應(yīng)用和研究中，因此，準(zhǔn)確鑒別干酪乳桿菌種及其近緣種也同樣重要。采用本實(shí)驗(yàn)中的兩對(duì)引物探針，對(duì)與HP-B1142近緣的5株干酪乳桿菌進(jìn)行PCR驗(yàn)證，圖4實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩對(duì)引物探針均可擴(kuò)增出目標(biāo)條帶從而實(shí)現(xiàn)近緣干酪乳桿菌檢出。

M：2K Plus Ⅱ DNA marker；1～2、3～4、5～6、7～8、9～10、1～12泳道分別以干酪乳桿菌HP-B1142、DSM 20011、JCM 8129、IDCC 3451、JX 20225、ATCC 11443基因組DNA為模板。1、3、5、7、9、11泳道使用的引物探針是1142-a-F/1142-a-R，2、4、6、8、10、12泳道使用的引物探針是1142-2-F/1142-2-R。

2.5 運(yùn)用兩對(duì)特異性引物檢驗(yàn)市售公示配方中含有干酪乳桿菌的產(chǎn)品

選取3種市售產(chǎn)品來(lái)進(jìn)行檢驗(yàn)，可以用來(lái)確定本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的兩對(duì)特異性引物是否可以達(dá)到精準(zhǔn)檢驗(yàn)產(chǎn)品中的干酪乳桿菌，檢測(cè)其實(shí)用效果。對(duì)所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。圖5中泳道均可得到目標(biāo)條帶，進(jìn)而判斷市售產(chǎn)品中含有干酪乳桿菌。由此可知，本實(shí)驗(yàn)涉及的兩對(duì)特異性引物探針可以用于市售產(chǎn)品中干酪乳桿菌的檢驗(yàn)，具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

M：2K Plus Ⅱ DNA marker；1～2、3～4、5～6分別以市售混合益生菌產(chǎn)品一、市售混合益生菌產(chǎn)品二及市售益生菌產(chǎn)品三的基因組DNA為模板；1、3、5泳道使用的引物探針是1142-a-F/1142-a-R，2、4、6泳道使用的引物探針是1142-2-F/1142-2-R。

3 結(jié)論

ERIC-PCR技術(shù)在DNA指紋圖譜技術(shù)中的廣泛應(yīng)用，使得細(xì)菌在亞種層次上的鑒別分類(lèi)有了更好的依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用ERIC-PCR技術(shù)設(shè)計(jì)得到的兩對(duì)特異性引物，已將引物序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，接收序列號(hào)為OP700792、OP700793。獲得兩對(duì)引物探針1142-a-F/1142-a-R，1142-2-F/1142-2-R，并驗(yàn)證其特異性、普適性、含量限度及是否可鑒別市售產(chǎn)品中的干酪乳桿菌，大大增強(qiáng)了該引物探針的實(shí)用性及可靠性。上述兩對(duì)引物探針可以在微量DNA溶液（絕對(duì)含量27 ng·mL-1）中高效實(shí)現(xiàn)干酪乳桿菌的痕量檢出，并可在復(fù)雜生境中實(shí)現(xiàn)市售產(chǎn)品中干酪乳桿菌的特異性檢出。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的兩對(duì)特異性引物探針較現(xiàn)有干酪乳桿菌的鑒別方法有了較大優(yōu)化，克服了現(xiàn)有方法中操作復(fù)雜、易被污染的缺點(diǎn)，可簡(jiǎn)單、快速檢出復(fù)雜生境樣本中干酪乳桿菌；在醫(yī)療保健、科研活動(dòng)等方面有著良好的實(shí)用性和廣闊的市場(chǎng)前景。

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