程兢業(yè) 吳鴻億 趙力 王婧

摘 要：蘑菇進(jìn)入食用和消化環(huán)節(jié)后難以辨認(rèn)，本試驗(yàn)探究加工與消化對(duì)蘑菇DNA提取的影響，改良DNA提取方法，為毒蘑菇中毒物種鑒別奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明，改良CTAB法將OD260/OD280值提升至1.97～2.00，濃度由559.00～1 131.68 μg·mL-1提升至877.33～1 219.33 μg·mL-1；對(duì)油脂含量高的樣品進(jìn)行除油處理，除油后DNA濃度達(dá)1 339.33 μg·mL-1；改良CTAB法可提取所有樣品DNA，且提取的DNA較為完整；改良CTAB法與試劑盒法相比在DNA提取過程中可操作性較高，提取成本低，提取的DNA濃度高，平均濃度達(dá)到1 291.05 μg·mL-1，OD值較為穩(wěn)定，均在1.8～2.0。

關(guān)鍵詞：蘑菇；加工；消化；DNA提取

Abstract： This experiment investigates the effect of processing and digestion on the extraction of mushroom DNA to improve the DNA extraction method and to lay the foundation for the identification of poisonous mushroom species. The results showed that the modified CTAB method increased the OD260/OD280 values to 1.97～2.00 and concentrations from 559.00～1 131.68 μg·mL-1 to 877.33～1 219.33 μg·mL-1. The samples with high oil content were de-oiled and the DNA concentration reached 1 339.33 μg·mL-1 after de-oiling. The modified CTAB method was more operable and less costly than the kit method in the DNA extraction process， and the extracted DNA concentration was higher， with an average concentration of 1 291.05 μg·mL-1， and the OD values were more stable， ranging from 1.8～2.0.

Keywords： mushrooms; processing; digesting; DNA extraction

在我國，誤食毒蘑菇而引發(fā)的中毒事件時(shí)有發(fā)生，毒蘑菇在進(jìn)入食用和消化環(huán)節(jié)后難以用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法辨認(rèn)，近年來DNA分子標(biāo)記技術(shù)在真菌物種鑒別中發(fā)展迅速，而高質(zhì)量基因組DNA提取為其奠定了基礎(chǔ)。目前國內(nèi)外已有一些關(guān)于蘑菇基因組DNA提取方法的報(bào)道，但由于蘑菇組織中含有大量的多糖、蛋白質(zhì)和色素等物質(zhì)，以及加工和消化過程中DNA有所降解，導(dǎo)致后續(xù)相關(guān)分子實(shí)驗(yàn)受到影響[1-4]。因此，筆者在前人的研究基礎(chǔ)上，采用試劑盒法和CTAB法提取加工和消化后的蘑菇DNA，且對(duì)經(jīng)典的CTAB法進(jìn)行改良，利用瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度和PCR擴(kuò)增檢測(cè)DNA質(zhì)量，對(duì)提取方法、加工方式及消化對(duì)DNA的影響進(jìn)行初步的研究，同時(shí)也為毒蘑菇DNA的提取提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

食用菌杏鮑菇、香菇購于當(dāng)?shù)爻小?/p>

CTAB緩沖液（2% CTAB、100 mmol·L-1 Tris-HCl、25 mmol·L-1 EDTA、1.5 mol·L-1 NaCl）；2-巰基乙醇；蛋白酶K（20 mg·mL-1）；RNase A；酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）；氯仿∶異戊醇（24∶1）；胃蛋白酶；甲醇∶氯仿∶水（1.0∶2.0∶0.8）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 加工方式

加工方式采用炒、水煮、烘干和凍干的方法。①炒：平底鍋燒熱后倒入食用油將蘑菇炒至熟透。②水煮：水沸騰后放入蘑菇，分別在水中煮至5 min、10 min、15 min、30 min、45 min和60 min。③烘干：將蘑菇切成薄片，60 ℃烘箱烘干6～7 h備用。④凍干：將蘑菇切成薄片于-80 ℃冰箱放置一晚后真空冷凍干燥48 h，取出密封備用。以上樣品均分為兩份，一份消化實(shí)驗(yàn)備用，一份作為對(duì)照。

1.2.2 消化試驗(yàn)

人工胃液配制及消化處理參考GAUSTERER等的試驗(yàn)[5]。

1.2.3 DNA提取

本研究參照原有CTAB法[6-7]，對(duì)其進(jìn)行改良，提高DNA質(zhì)量和提取成功率。改良后CTAB法操作步驟如下。稱取1 g蘑菇組織研磨后放入10 mL滅菌離心管中，加入5 mL CTAB緩沖液，500 ?L 2-巰基乙醇，80 ?L蛋白酶K，置于65 ℃的恒溫水浴鍋中消化1 h。取上清液至新的離心管中，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）溶液，振蕩至乳白色，12 000 r·min-1離心10 min。加入1% RNase A溶液，37 ℃水浴30 min。加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1），振蕩至乳白色，12 000 r·min-1離心10 min。取上清液至新的離心管中，加入等體積預(yù)冷異丙醇，-20 ℃放置30 min后12 000 r·min-1離心10 min。棄上清液，加入800 ?L 70%乙醇洗滌兩次，無水乙醇洗滌一次，棄去乙醇，室溫晾干或超凈工作臺(tái)吹干，加入100 ?L滅菌雙蒸水，-20 ℃下保存。

真菌基因組DNA提取試劑盒購自索萊寶生物技術(shù)有限公司，具體操作方法參照試劑盒說明書。

1.2.4 DNA質(zhì)量分析

（1）紫外檢測(cè)。取5 μL DNA樣品，加入雙蒸水或TE緩沖液稀釋10倍，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量DNA濃度及OD260/OD280。

（2）PCR擴(kuò)增。采用引物ITS4/ITS5和LROR/LR5，PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，其中包含2 μL 10×PCR buffer，1.6 μL dNTP（2.5 mmol·L-1），1.2 μL Mg2+（25 mmol·L-1），0.4 μL Taq酶（2.5 U），上下引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，27次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

（3）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。取DNA樣品5 μL，6×Loading buffer 1 μL混勻，在1%的瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中上樣，置于0.5×TAE緩沖液中，120 V電泳35 min，采用Gel-Pro analyzer軟件拍照并保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外分析結(jié)果

2.1.1 不同提取方法紫外分析結(jié)果

3種方法提取新鮮食用菌基因組DNA紫外分析結(jié)果見表1，試劑盒法、CTAB法、改良CTAB法均能提取杏鮑菇和香菇子實(shí)體中的DNA，3種提取方法存在顯著性差異（P＜0.05）。改良CTAB法的OD260/OD280值在1.8～2.0，說明蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)已去除干凈，無RNA污染，得到的DNA純度最好。CTAB法提取的杏鮑菇OD260/OD280值小于1.8，存在蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)，香菇OD260/OD280值大于2.0，存在RNA污染，且CTAB法在提取DNA過程中，出現(xiàn)較多黏稠膠狀物質(zhì)，上清液為黃褐色，抽提后DNA沉淀仍有色素殘留。試劑盒法提取香菇DNA的OD260/OD280值小于1.8，說明受到蛋白質(zhì)及酚類物質(zhì)污染較嚴(yán)重。3種方法相比，改良CTAB法得到的DNA濃度較高，其次是CTAB法，試劑盒法得到的DNA濃度最低。

2.1.2 加工和胃消化樣品紫外分析結(jié)果

試劑盒和改良CTAB兩種方法DNA紫外分析結(jié)果見表2和3，兩種方法所提取的除油和未除油樣品DNA濃度均存在顯著差異性（P＜0.05），未除油樣品DNA的OD260/OD280值小于1.8，說明蛋白質(zhì)、酚類污染嚴(yán)重，DNA溶液中雜質(zhì)較多。除油后樣品DNA質(zhì)量有所提高，OD260/OD280值均在1.8～2.0，且DNA濃度高于除油前，濃度達(dá)1 339.33 μg·mL-1。因此，可在DNA提取前對(duì)炒制樣品對(duì)進(jìn)行預(yù)處理以消除樣品中油脂對(duì)DNA的影響。改良CTAB法提取杏鮑菇水煮5 min、10 min和15 min之間，45 min和60 min之間DNA濃度變化無顯著性差異，消化組樣品在水煮5～30 min時(shí)DNA濃度變化無顯著性差異。

試劑盒法提取的水煮樣品中，杏鮑菇水煮15～45 min時(shí)DNA濃度無明顯變化，其余水煮組內(nèi)樣品濃度均存在差異，濃度由51.67～177.67 μg·mL-1逐漸降低至19.67～83.33 μg·mL-1。隨著水煮時(shí)間的延長(zhǎng)，水煮樣品DNA濃度整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。改良CTAB法提取的干制樣品DNA存在顯著性差異（P＜0.05），烘干樣品濃度均大于凍干樣品濃度，兩種提取方法均表明消化后干制樣品DNA濃度明顯低于消化前。

試劑盒法和改良CTAB法提取效果比較見圖1，兩種DNA提取方法之間存在顯著性差異（P＜0.05），改良CTAB法所提取DNA濃度均高于試劑盒法，平均濃度達(dá)到1 291.05 μg·mL-1，DNA質(zhì)量較高，

OD值均在1.8～2.0。因此所建立的DNA提取方法用于消化和加工等復(fù)雜樣品DNA提取，且可應(yīng)用于毒蘑菇中毒案例中，提取蘑菇加工樣品及胃消化殘留物等，對(duì)毒蘑菇的中毒與防治具有重大意義。

2.2 電泳分析結(jié)果

采用試劑盒法提取加工和消化樣品DNA電泳結(jié)果見圖2，新鮮樣品DNA作為對(duì)照。DNA易溶于水，隨著高溫與水煮時(shí)間的延長(zhǎng)，很難從水煮樣品中提取完整DNA片段。所有加工樣品成功擴(kuò)增出ITS片段，消化后水煮杏鮑菇45 min、60 min和炒制杏鮑菇未能擴(kuò)增出ITS片段，消化后杏鮑菇水煮60 min和未除油未能擴(kuò)增出LSU片段。水煮杏鮑菇45 min、水煮香菇30～60 min和消化后炒制香菇LSU條帶較暗，香菇未除油ITS條帶較暗，說明DNA提取成功但含量較低。對(duì)炒制樣品進(jìn)行除油處理后，存在彌散片段，干制樣品基因組DNA片段完整主帶清晰，烘干香菇和消化后凍干香菇未能擴(kuò)增出LSU片段。所有消化樣品條帶均變暗，說明與新鮮和加工樣品相比，消化樣品DNA有所降解，DNA得率較低。引物ITS擴(kuò)增成功率為86.5%，引物L(fēng)SU擴(kuò)增成功率為84.6%，兩種引物結(jié)合使用可將擴(kuò)增成功率提高至88.5%。

新鮮食用菌DNA作為對(duì)照，改良CTAB法提取加工和消化樣品DNA電泳結(jié)果見圖2，水煮5～10 min樣品基因組DNA條帶清晰，消化后水煮樣品無完整條帶，所有加工樣品成功擴(kuò)增出ITS和LSU片段，水煮香菇30 min的LSU條帶和水煮香菇15 min的ITS條帶較暗，消化后的水煮香菇5～10 min擴(kuò)增出ITS非特異性片段，片段大小在250 bp左右，消化后水煮杏鮑菇15 min樣品LSU條帶較暗，其余消化后樣品均成功擴(kuò)增出ITS片段。炒制樣品未進(jìn)行除油處理時(shí)基因組DNA無明顯條帶，進(jìn)行除油處理后可見其主帶清晰完整，且無拖尾現(xiàn)象。干制樣品基因組DNA主帶不完整，存在大量彌散DNA片段條帶。改良CTAB法提取樣品DNA引物ITS擴(kuò)增成功率為86.5%，LSU擴(kuò)增成功率為82.7%，兩種引物結(jié)合使用可將擴(kuò)增成功率提高至100%，因此可將ITS和LUS兩種引物聯(lián)合使用以保證PCR擴(kuò)增成功率。

3 結(jié)論與討論

由于進(jìn)入加工和消化階段的蘑菇很難通過形態(tài)學(xué)鑒定其物種，對(duì)于誤食毒蘑菇中毒案例，針對(duì)性治療便難以進(jìn)行，因此本試驗(yàn)通過研究加工條件和DNA提取方法，提高DNA提取成功率，為后續(xù)DNA分子鑒別實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。食用菌中含有較多酚類、多糖及色素等物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)形成膠黏狀物并裹挾著DNA[8]。1995年Borroso.G.提出了CTAB法，但CTAB法最早應(yīng)用于植物基因組DNA的提取，隨后此方法開始應(yīng)用于蘑菇DNA的提取。韓利剛等[9]在這種方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良來提取絲狀真菌的DNA且取得了很好的效果。同年王春暉等[10]將CTAB法加以改進(jìn)，使此法更簡(jiǎn)單、易操作。江玉姬等[11]將CTAB法與其他方法加以比較，發(fā)現(xiàn)CTAB法是一種優(yōu)良的蘑菇DNA提取方法，DNA產(chǎn)量高，多糖和蛋白質(zhì)含量低，符合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求。

本試驗(yàn)在對(duì)CTAB法進(jìn)行改良時(shí)，采用加入蛋白酶K以去除蘑菇組織中的蛋白質(zhì)，加入2-巰基乙醇以去除多酚類物質(zhì)，加入RNase A以去除RNA。由于RNA酶會(huì)影響DNA質(zhì)量，于是選擇將RNase A溶液在使用酚/氯仿/異戊醇抽提液抽提一次后加入，在進(jìn)行第二次抽提時(shí)可將RNA酶一起去除。油脂的存在對(duì)DNA質(zhì)量存在一定的影響，于是在進(jìn)行DNA提取前對(duì)炒制樣品進(jìn)行除油處理，所得DNA質(zhì)量與除油前相比具有明顯的提升。DNA為水溶性極強(qiáng)的物質(zhì)，利用水煮的加工方式較難提取完整DNA片段。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)水煮時(shí)間梯度探究水煮時(shí)間對(duì)DNA提取的影響，結(jié)果顯示隨著加工時(shí)間延長(zhǎng)，所得樣品DNA濃度逐漸減少，試劑盒法未能成功提取所有樣品DNA，而改良CTAB法則成功提取所有樣品DNA。引物ITS結(jié)合引物L(fēng)SU便能將擴(kuò)增成功率提高至100%，改良CTAB法能提取水煮5～10 min樣品較為完整的DNA片段。綜上所述，改良CTAB法適用于加工和消化樣品高質(zhì)量DNA的提取。

參考文獻(xiàn)

[1]陳國明，魏海蓮，李志強(qiáng)，等.平菇DNA不同提取方法比較[J].廣西林業(yè)科學(xué)，2014，43（1）：69-74.

[2]楊振華，張靠穩(wěn)，馬愛瑛.賀蘭山紫蘑菇基因組DNA提取方法研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（20）：10557-10559.

[3]MAETA K，OCHI T，TOKIMOTO K，et al.Rapid species identification of cooked poisonous mushrooms by using real-time PCR[J].Appl Environ Microbiol，2008，74（10）：3306-3309.

[4]WANG S，LIU Y，XU J.Comparison of different drying methods for recovery of mushroom DNA[J].Sci Rep，2017，7（1）：3008.

[5]GAUSTERER C，PENKER M，KRISAI-GREILHUBER I，et al.Rapid genetic detection of ingested Amanita phalloides[J].Forensic Sci Int Genet，2014，9：66-71.

[6]李剛，李寶健.一種簡(jiǎn)單高效提取食用菌總DNA的方法[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2000（增刊3）：56-58.

[7]張紅，秦蓮花，譚琦，等.用改進(jìn)的CTAB法提取香菇基因組DNA[J].上海大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006（5）：547-550.

[8]王藝琴，郭豪，張素勤，等.脆木耳基因組DNA提取方法優(yōu)化[J].中國食用菌，2022，41（4）：48-52.

[9]韓利剛，袁毅，王罡.絲狀真菌組織DNA的提取[J].生物技術(shù)，1999（6）：38-41.

[10]王春暉，劉文彬，鄧潔姣.一種提取食用菌DNA的有效方法[J].食用菌，1999（1）：9-10.

[11]江玉姬，謝寶貴，陳文校.草菇DNA提取方法初探[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2000（2）：61-64.