鄒雨虹 楊丹妮 張曉金

摘 要：建立膜芯片法檢測(cè)即食果蔬中的常見致病微生物，實(shí)現(xiàn)快速、簡(jiǎn)便、同步篩檢6種細(xì)菌和病毒。利用反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)將待測(cè)靶標(biāo)基因中的特異性序列作為探針固定在尼龍膜上，利用多對(duì)帶生物素標(biāo)記的引物對(duì)待測(cè)靶標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增，并通過酶-底物顯色，產(chǎn)生肉眼可辨的信號(hào)。單次反應(yīng)即可得出多種指標(biāo)結(jié)果，同時(shí)結(jié)合多重PCR技術(shù)以雙重反應(yīng)體系來確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，該方法具備特異性強(qiáng)及靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，為食品中致病微生物的快速檢測(cè)提供了新思路。

關(guān)鍵詞：即食果蔬；致病微生物；快速檢測(cè)；膜芯片

Abstract： Establish a membrane chip method to detect common pathogenic microorganisms in ready-to-eat fruits and vegetables， achieving rapid， simple， and synchronous screening of six bacteria and viruses. Using the reverse dot blot technique， the specific sequence of the target gene was fixed on the nylon membrane as a probe. At the same time， multiple pairs of biotin-labeled primers were used to amplify the target gene. Through enzyme-substrate color development， visible signals were generated. Combined with multiple PCR technology， the dual reaction system ensures the accuracy of test results， and a single reaction can simultaneously screen multiple indicators.：The results show that this method has the advantages of strong specificity and high sensitivity， and the detection results are accurate， which provides a new idea for the rapid detection of pathogenic microorganisms in food.

Keywords： ready-to-eat fruits and vegetables; pathogenic microorganism; rapid detection; membrane chip

水果和蔬菜富含各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有益于預(yù)防慢性疾病以及提高免疫力[1]。即食果蔬是指以新鮮水果和蔬菜為主要原料，經(jīng)過加工處理后，通過冷藏或低溫運(yùn)輸并進(jìn)入冷柜銷售的即食或即用的果蔬制

品[2-3]。即食果蔬在流入市場(chǎng)前一般沒有經(jīng)過高溫加工等滅菌步驟，人們可以直接鮮切、涼拌食用，容易出現(xiàn)交叉污染繼而引發(fā)食源性疾病[4]，危害到人們的健康。其中，大腸埃希氏菌、單增李斯特菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等致病微生物均在黃瓜、萵筍、苦苣、番茄、菠菜、瓜類、蘋果和梨等即食果蔬中檢出[5-6]。

目前針對(duì)即食果蔬中致病菌檢測(cè)的方法主要有傳統(tǒng)分離培養(yǎng)及生化鑒定、酶聯(lián)免疫吸附、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（主要為熒光定量PCR法）、基因芯片法等[7]，常規(guī)的分離培養(yǎng)基及生化鑒定檢測(cè)方法仍是我國(guó)食品中常見致病菌檢測(cè)的主要方式[8]。但此方法耗時(shí)長(zhǎng)且步驟煩瑣，一般需要5～7 d得出結(jié)果?？紤]到果蔬保質(zhì)期極短的特殊性，檢測(cè)周期過長(zhǎng)會(huì)嚴(yán)重影響果蔬產(chǎn)品的快速流通，很大程度上加重了即食果蔬生產(chǎn)企業(yè)在儲(chǔ)藏及質(zhì)量管理上的負(fù)擔(dān)。

近年來出現(xiàn)的PCR技術(shù)逐漸被應(yīng)用在食品中致病微生物的檢測(cè)中，該技術(shù)縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)靈敏度及檢測(cè)效率[9]，但無(wú)法利用一次實(shí)驗(yàn)操作同時(shí)對(duì)多種致病菌進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于目前生鮮果蔬流通不暢的問題仍無(wú)法提供解決思路。因此，利用膜芯片檢測(cè)工作平臺(tái)開發(fā)一種針對(duì)多種致病菌同步快速檢測(cè)的方法，對(duì)于即食果蔬行業(yè)的發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

膜芯片技術(shù)基于反向斑點(diǎn)雜交原理開發(fā)，利用反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)（Reverse Dot Blot，RDB）將待測(cè)基因中的特異性序列作為探針固定在尼龍膜上，并采用生物素標(biāo)記的引物進(jìn)行基因的擴(kuò)增，同時(shí)將擴(kuò)增產(chǎn)物與固定在尼龍膜上的探針進(jìn)行雜交，經(jīng)化學(xué)顯色后可在雜交點(diǎn)上形成肉眼可見的信號(hào)，單次反應(yīng)即可同時(shí)篩查多種靶標(biāo)[10]。該方法的特別之處在于將多重PCR技術(shù)與反向斑點(diǎn)雜交（RDB）技術(shù)相結(jié)合形成檢測(cè)體系，可以同時(shí)提取細(xì)菌和病毒中的DNA和RNA，同步擴(kuò)增特異性基因片段，在膜芯片上形成肉眼可見的檢測(cè)靶點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)所有靶標(biāo)的共同檢測(cè)。本文主要針對(duì)的即食果蔬中金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌O157、沙門氏菌、諾如病毒和輪狀病毒這6種常見致病菌進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 樣品來源

本實(shí)驗(yàn)所用的樣本（即食生菜、即食黃瓜、鮮切牛油果、鮮切火龍果、蘋果、胡蘿卜、金橘、苦苣、鮮切菠蘿和鮮切羊角蜜）購(gòu)自各市場(chǎng)中。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株

細(xì)菌采用實(shí)驗(yàn)保存的陽(yáng)性菌株：沙門氏菌（CICC號(hào)21513）、大腸埃希氏菌O157：H7（CICC號(hào)21530）、金黃色葡萄球菌（CICC號(hào)10384）、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（CICC號(hào)21633），在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌株復(fù)蘇備用。病毒樣本采用購(gòu)買標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品的形式進(jìn)行。

1.1.3 儀器與試劑

MFS-24基因膜芯片檢測(cè)工作站（四川華漢三創(chuàng)生物科技有限公司）；Fresco17高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司）；膜芯片檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：HT114B，四川華漢三創(chuàng)生物科技有限公司）；細(xì)菌DNA提取試劑盒（貨號(hào)：DP302，天根生化科技有限公司）；病毒DNA/RNA提取試劑盒（貨號(hào)：DP315，天根生化科技有限公司）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物及探針設(shè)計(jì)

通過查看文獻(xiàn)并結(jié)合實(shí)際結(jié)果，最終選取以下基因序列。引物和探針的設(shè)計(jì)由Primer Premier 5.0軟件完成，具體對(duì)應(yīng)的特異性基因詳細(xì)信息見表1。

1.2.2 樣本前處理

樣本的前處理階段選用致病菌共增菌培養(yǎng)基，將待測(cè)樣品與6種陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行前增菌。取共增菌培養(yǎng)基干粉5.96 g，加入蒸餾水至完全溶解，調(diào)節(jié)pH值至7.2±0.2并定容到100 mL，將滅菌鍋條件設(shè)置為121 ℃、20 min，滅菌后冷卻備用。無(wú)菌稱取10 g待檢樣品，加入至100 mL的增菌培養(yǎng)基中，設(shè)置恒溫振蕩培養(yǎng)箱參數(shù)為35 ℃和150 r·min-1，過夜培養(yǎng)。最后從共增菌液中取1～5 mL，提取DNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.2.3 樣品核酸制備

采用多重PCR技術(shù)擴(kuò)增待檢靶標(biāo)，以高純度的基因組DNA為模板，核酸樣品純度A260/A280在1.8～2.0可保證多重PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率；DNA樣品模板加入量≥200 ng以保證檢測(cè)效果。使用細(xì)菌DNA提取試劑盒或病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒分別進(jìn)行提取。

1.2.4 多重PCR擴(kuò)增

（1）樣本核酸擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為2×Multiplex PCR Master Mix 10 μL，OneStep EnzymeMix 0.45 μL，Hela cell total RNA 1 μL，樣品DNA 20～400 ng，最后用無(wú)核酸酶滅菌水補(bǔ)足20 μL。

（2）PCR擴(kuò)增程序、溫度及反應(yīng)時(shí)間如表2所示。

1.2.5 膜芯片雜交

產(chǎn)物變性階段：將上述實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物在95 ℃變性5 min使其解鏈后立即置于冰上備用；雜交儀設(shè)置：雜交儀在開機(jī)前檢查瓶中的蒸餾水水位達(dá)到水位線，打開基因膜芯片檢測(cè)工作站的電源和開關(guān)，觀察廢液瓶是否空置，隨后打開軟件，等待工作站顯示自檢成功后，點(diǎn)擊確定按鈕；使用耗材和試劑的準(zhǔn)備工作：使用前分別檢查試劑瓶BCDE中的液體，如果存在結(jié)晶，則置于36 ℃水浴鍋中溶解至結(jié)晶消失后使用；將雜交試劑進(jìn)行分裝，準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量的雜交管并將200 μL B液加入至每個(gè)雜交管中；芯片和樣品的加載：將準(zhǔn)備好的C～J試劑瓶開蓋，取已加入樣品的雜交管及膜芯片放入工作站指定位置并確保一一對(duì)應(yīng)，隨后關(guān)閉試劑盤和反應(yīng)盤的蓋板及儀器倉(cāng)門，并再次檢查芯片與雜交管是否放置正確；運(yùn)行程序：加載“基因膜芯片檢測(cè)工作站標(biāo)準(zhǔn)雜交流程”，根據(jù)檢測(cè)樣品放置的位置選中相應(yīng)的按鈕，點(diǎn)擊“運(yùn)行”開始實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 結(jié)果判讀

實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效的前提是膜芯片上PC點(diǎn)顯色，NC點(diǎn)不顯色。反應(yīng)結(jié)果可用肉眼進(jìn)行判讀，也可參照膜芯片核酸分子雜交儀成像分析系統(tǒng)得出的結(jié)果。膜芯片點(diǎn)陣圖及多重PCR陽(yáng)性質(zhì)控反應(yīng)結(jié)果如圖1和圖2所示。

2 市售樣本檢測(cè)結(jié)果與分析

對(duì)市場(chǎng)中購(gòu)買的10個(gè)即食果蔬樣本，提取其核酸，采用建立的膜芯片法進(jìn)行檢測(cè)鑒定，結(jié)果芯片圖如圖3所示，灰色點(diǎn)表示該點(diǎn)位陽(yáng)性，無(wú)圓點(diǎn)則表示該點(diǎn)位陰性，同時(shí)還應(yīng)結(jié)合膜芯片點(diǎn)陣圖的基因序列進(jìn)行肉眼判讀。

在3份樣本（即食生菜、即食黃瓜、金橘）中檢出了金黃色葡萄球菌，而單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌O157、沙門氏菌及諾如病毒、輪狀病毒未檢出；另外7份樣本均未檢出此6種致病微生物。結(jié)果表明，市場(chǎng)中售賣的即食果蔬存在被致病微生物感染的風(fēng)險(xiǎn)，通過建立的膜芯片法能夠達(dá)到多種致病菌的同步檢測(cè)。

3 討論

本項(xiàng)目將多重PCR技術(shù)與反向斑點(diǎn)雜交（RDB）技術(shù)相結(jié)合形成檢測(cè)體系，同時(shí)提取6種致病微生物提取的DNA和RNA，并同步擴(kuò)增特異性基因片段，在膜芯片上顯示直觀的檢測(cè)靶點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)多種致病菌的同步檢測(cè)。本文建立的多重反應(yīng)體系中，利用特異性引物，可以在一次PCR反應(yīng)體系中同時(shí)鑒別出金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸埃希氏菌O157、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，以及諾如病毒、輪狀病毒這6種致病菌，并且在48 h內(nèi)能得出準(zhǔn)確結(jié)果。此方法快捷便利，檢測(cè)條件限制不多，能滿足PCR實(shí)驗(yàn)環(huán)境的實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行檢測(cè)，并可實(shí)現(xiàn)一次操作同步檢測(cè)多種致病微生物，大大提高了檢測(cè)效率。

膜芯片法作為一種具備優(yōu)勢(shì)的檢測(cè)新方法，應(yīng)用于食品的致病菌快速篩查中，可以提供更為快速且準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，且無(wú)需耗費(fèi)大量人力資源。此方法有效解決了傳統(tǒng)分離培養(yǎng)基法耗時(shí)過長(zhǎng)的問題，有利于保障即食果蔬產(chǎn)品的順暢流通；有利于其他食品企業(yè)有效控制微生物污染風(fēng)險(xiǎn)，防止食源性疾病造成食品安全問題；有利于食品安全監(jiān)管抽檢工作高效地進(jìn)行，為食品安全監(jiān)管工作提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。隨著基因膜芯片研究的不斷深入，相信膜芯片技術(shù)也會(huì)不斷發(fā)展，在食品致病性微生物的檢測(cè)中能得到更加廣泛的應(yīng)用。

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