戰(zhàn)笑蕾 王馨玥 李小宇 張春雨 劉建青 王晨 王斌 梁雨欣 王永志 程曉非

摘要 苜?；ㄈ~病毒（alfalfa mosaic virus， AMV）是一種世界性分布、宿主范圍廣、具有嚴(yán)重危害性的植物病毒，能引起大豆的嚴(yán)重病害。本研究利用原核表達(dá)的AMV CP蛋白制備的抗血清，建立了高效、準(zhǔn)確的AMV間接ELISA檢測(cè)方法，并應(yīng)用于病害調(diào)查和抗性鑒定，結(jié)果表明制備的3份抗血清對(duì)重組蛋白和AMV感染的大豆植物粗提液的效價(jià)均達(dá)到256 000倍，血清特異性分析結(jié)果顯示3份抗血清僅識(shí)別感染AMV的大豆葉片，不識(shí)別感染大豆花葉病毒（soybean mosaic virus， SMV）的大豆葉片。通過建立的AMV間接ELISA與常規(guī)RT-PCR同時(shí)對(duì)采集的50份疑似感染AMV的大豆樣品進(jìn)行檢測(cè)，有46份樣品檢測(cè)結(jié)果一致，符合率達(dá)92%。利用建立的AMV ELISA方法和課題組已建立的SMV ELISA方法對(duì)吉林省大豆主產(chǎn)區(qū)的大豆樣品進(jìn)行病毒檢測(cè)的結(jié)果表明，病毒檢出率為38.30%，SMV的檢出率達(dá)30.85%，AMV的檢出率達(dá)17.06%，復(fù)合侵染率為9.61%。對(duì)接種AMV的40個(gè)大豆品種進(jìn)行抗性鑒定，結(jié)果顯示40份大豆全部感染AMV，但是病毒載量存在差異，部分品種表現(xiàn)出AMV抗性，其中大豆抗性資源11份，首次發(fā)現(xiàn)AMV造成的大豆病害已經(jīng)成為吉林省大豆的主要病害之一。

關(guān)鍵詞 大豆;?苜?；ㄈ~病毒;?抗性鑒定;?間接ELISA

中圖分類號(hào)： S 431.14

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022011

Abstract Alfalfa mosaic virus （AMV） is a plant virus with worldwide distribution， wide host range， and serious harmfulness， which causes serious disease in soybean. In this study， the antiserum prepared by prokaryotic expression of AMV CP protein was used to establish an efficient and accurate indirect ELISA method for detection of AMV， which was applied to disease investigation and resistance identification. The results showed that the titers of the prepared three antiserums against recombinant protein and crude extract of soybean plants infected with AMV reached 256 000 times. Serum specificity analysis showed that the three antiserums only recognized AMV infected soybean leaves and did not recognize soybean mosaic virus （SMV） infected soybean leaves. A total of 50 soybean samples suspected to be infected with AMV were simultaneously detected by the established AMV indirect ELISA and conventional RT-PCR methods. The detection results of 46 samples were consistent， and the coincidence rate was 92%. The established AMV ELISA method and SMV ELISA method were used to detect the virus in soybean samples from the main soybean producing areas in Jilin province. The results showed that the detection rate of virus was 38.30%， the positive rate of SMV was 30.85%， the positive rate of AMV was 17.06%， and the composite infection rate was 9.61%. Resistance identification of 40 soybean varieties inoculated with AMV showed that all 40 soybean varieties were infected with AMV， but the viral load was significantly different. Some varieties showed AMV resistance， including 11 soybean resistant resources. The soybean disease caused by AMV had become one of the main diseases of soybean in Jilin province for the first time.

Key words soybean;?alfalfa mosaic virus;?resistance identification;?indirect ELISA

大豆是我國(guó)重要的糧食作物，2019年中央1號(hào)文件正式提出實(shí)施大豆振興計(jì)劃［1］。吉林地區(qū)的氣候與土壤為大豆提供了良好的生長(zhǎng)發(fā)育環(huán)境，一直以來都是我國(guó)大豆種植的主產(chǎn)區(qū)。已知能夠侵染大豆的病毒有50種以上，其中大豆花葉病毒（soybean mosaic virus， SMV）和苜?；ㄈ~病毒（alfalfa mosaic virus， AMV）是危害吉林省大豆質(zhì)量與產(chǎn)量的主要病毒。SMV隸屬于馬鈴薯Y病毒科Potyviridae馬鈴薯Y病毒屬Potyvirus，是引起大豆花葉病的主要病原，在世界各地的大豆產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。該病毒于1915年在美國(guó)康涅狄格州首次被發(fā)現(xiàn)，自然條件下可造成10%到50%的減產(chǎn)，損失最高可達(dá)94%。AMV屬于雀麥花葉病毒科Bromoviridae苜?；ㄈ~病毒屬Alfamovirus，是一種世界性分布的病毒［2］。該病毒于1931年在美國(guó)的紫花苜蓿中首次被發(fā)現(xiàn)，此后在亞洲、非洲、南美、北美相繼被報(bào)道［3］。AMV能夠侵染51科430多種雙子葉植物，其中包括豆科和茄科等許多重要經(jīng)濟(jì)作物，主要通過蚜蟲以非持久方式進(jìn)行傳播，也可以汁液摩擦傳播，在某些植物中還能通過種子傳毒［4］。AMV造成的癥狀從隱蔽到嚴(yán)重不等，主要表現(xiàn)為花葉、皺縮、黃化和環(huán)斑畸形等，是一種具有嚴(yán)重危害性的植物病毒［5-8］。目前尚無有效治療病毒病的藥劑，高效、精準(zhǔn)的病毒檢測(cè)技術(shù)是該病害防治的前提。

AMV的基因組全長(zhǎng)約為8 300 nt，由3條正義單鏈RNA組成，根據(jù)長(zhǎng)度分別命名為RNA1、RNA2和RNA3［9］。RNA1編碼的P1蛋白的N-末端有類似轉(zhuǎn)甲基酶的區(qū)域，C-末端有類似解旋酶的區(qū)域;RNA2編碼的P2蛋白有依賴于RNA復(fù)制的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase， RdRp），兩者共同構(gòu)成了AMV的復(fù)制酶。RNA3含有2個(gè)開放閱讀框，編碼病毒的運(yùn)動(dòng)蛋白（movement protein，MP）和24 kD的病毒衣殼蛋白（coat protein， CP）。MP位于RNA3的5′末端，由RNA3直接翻譯，CP位于RNA3的3′末端，通過亞基因組RNA4翻譯［10-12］。研究發(fā)現(xiàn)，除了病毒粒子組裝外，CP還在細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)、復(fù)制和促進(jìn)病毒翻譯中起著重要的作用［13-14］。目前植物病毒檢測(cè)技術(shù)主要以分子生物學(xué)檢測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)為主。對(duì)AMV的檢測(cè)主要以CP為靶標(biāo)，序列比對(duì)表明，不同AMV株系的CP在核苷酸水平上的一致性為93%～99%，在氨基酸水平上的一致性為92%～100%［2，15-16］。具有高特異性、高靈敏度的RT-PCR是近年來應(yīng)用于AMV研究的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，有學(xué)者通過CP保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物建立不同作物AMV的檢測(cè)方法［5，17-19］。RT-PCR需要專業(yè)人員與設(shè)備，成本較高且操作復(fù)雜，不適用于基層高通量的田間樣品檢測(cè)［17］。基于血清學(xué)的ELISA（enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）檢測(cè)技術(shù)，具有成本低、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。韓俊麗等利用美國(guó)生產(chǎn)的AMV三抗夾心ELISA法（TAS-ELISA）成功檢測(cè)到AMV［20］。Ahoonmanesh等利用兔和雞的抗體建立了檢測(cè)AMV的雙抗夾心ELISA法，該方法還可用于蚜蟲傳播病毒的研究［21］。

目前國(guó)內(nèi)AMV的ELISA檢測(cè)主要依賴于進(jìn)口試劑盒，本研究首次以AMV的大豆中國(guó)分離物衣殼蛋白為抗原，通過免疫動(dòng)物，獲得AMV大豆分離物的抗體，建立了大豆AMV間接ELISA檢測(cè)方法，首次對(duì)吉林省大豆進(jìn)行AMV流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)AMV已經(jīng)成為吉林省大豆的主要病害之一。初步應(yīng)用于大豆種質(zhì)資源的AMV抗性分析，鑒定大豆抗性資源11份，為抗病育種和抗病機(jī)理的研究提供技術(shù)支持。

1?材料與方法

試驗(yàn)于2020年至2021年在吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院完成。

1.1?材料

供試材料：感染AMV的大豆及苜蓿葉片、pET-28a載體、Top10感受態(tài)菌株、BL21（Plyss）表達(dá)菌株均由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存;40份黑龍江大豆品種由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院保存。

1.2?主要試劑及儀器

主要試劑：6×His標(biāo)簽單克隆抗體購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司;限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶購(gòu)自安諾倫（北京）生物科技有限公司;TRIzol試劑盒、1st Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自大連寶生物公司（TaKaRa）;DAB顯色試劑盒、TMB顯色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;EasyFusion Assembly Master Mix同源重組克隆試劑盒購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司;Ni2+離子親和層析柱購(gòu)自美國(guó)GE公司;無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒購(gòu)自天根生化科技 （北京）有限公司;HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG抗體和弗氏佐劑購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

主要儀器：洗板機(jī)、酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)伯騰儀器有限公司;高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)（CT15RE型）購(gòu)自日本日立公司。

1.3?AMV CP基因克隆及同源性分析

采用TRIzol法從感染AMV的大豆葉片及苜蓿葉片中提取總RNA，根據(jù)1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書合成cDNA，并以其為模板，根據(jù)AMV CP基因保守序列設(shè)計(jì)特異性引物：AMV-CPs（5′-AGG-AGATATACCATGGGAAGTTCTTCACAAAA-GAAAGCTGGTG-3′）和AMV-CPa（5′-GGTGGTGGTGCTCGAGATGACGATCAAGATCGTCAGC-3′）;以cDNA為模板，利用合成的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增采用10 μL反應(yīng)體系：Premix Ex TaqTM 5 μL、cDNA 1 μL、10 μmol/L正反向引物各0.5 μL、ddH2O 3 μL。PCR反應(yīng)體系：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后送往吉林省庫(kù)美科技有限公司測(cè)序驗(yàn)證。利用Clustal X軟件對(duì)2種不同來源的AMV CP的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.4?重組蛋白的表達(dá)與純化

通過同源重組法將AMV CP基因與pET-28a載體連接，構(gòu)建pET-28a-AMV重組載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落后擴(kuò)大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證。將構(gòu)建成功的pET-28a-AMV轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 Rossetta表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)OD600值為0.5～0.6時(shí)，IPTG誘導(dǎo)3 h，12 000 r/min離心20 min，棄上清，去離子水重懸菌體，超聲裂解后分別收集上清和菌體，SDS-PAGE電泳檢測(cè)，鑒定重組蛋白表達(dá)情況，通過8 mol/L尿素溶解包涵體蛋白，經(jīng)Ni2+親和層析柱得到純化的AMV CP蛋白。純化后的蛋白進(jìn)行Western blot鑒定：重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，一抗采用6×His標(biāo)簽單克隆抗體，二抗采用辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG，DAB顯色液顯色。

1.5?抗血清的制備及特異性分析

純化后的AMV CP蛋白與等體積弗氏完全佐劑混合，充分乳化后對(duì)昆明鼠進(jìn)行基礎(chǔ)免疫，采用肌肉注射，每次每只小鼠免疫50 μg的重組蛋白，每隔2周以蛋白加等體積弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫3次后尾部采血，通過間接ELISA對(duì)抗血清效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)。

通過Western blot方法對(duì)制備的AMV抗血清進(jìn)行特異性分析，將檢測(cè)的大豆葉片用10 mL 0.01 mol/L PBS研磨后提取上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，一抗使用制備的AMV 抗血清，二抗采用辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG，DAB顯色液顯色。

1.6?間接ELISA檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

1.6.1?間接ELISA檢測(cè)方法的建立

碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）稀釋AMV CP蛋白至2 μg/mL后100 μL/孔包被酶標(biāo)板，4℃靜置過夜;加入5%脫脂奶280 μL/孔，37℃封閉1 h;檢測(cè)抗體用5%脫脂奶稀釋后加入酶標(biāo)板，100 μL/孔，搖床65 r/min，37℃孵育1 h;酶標(biāo)抗體用5%脫脂奶稀釋后加入酶標(biāo)板，100 μL/孔，搖床65 r/min，37℃孵育1 h，以上每一步結(jié)束后，PBST洗滌6次;加入TMB顯色液100 μL/孔，避光顯色8～10 min，以2 mol/L H2SO4溶液為終止液50 μL/孔終止顯色;酶標(biāo)儀測(cè)定OD450處吸光度值，根據(jù)公式：檢測(cè)樣品OD450（P值）/陰性對(duì)照OD450（N值）≥ 2.1判定檢測(cè)結(jié)果為陽性。

以上試驗(yàn)每孔設(shè)置3個(gè)平行，同時(shí)設(shè)置陽性（感染AMV的大豆葉片）、陰性（健康的大豆葉片）、空白（去離子水）3個(gè)對(duì)照。

1.6.2?靈敏度檢測(cè)

將AMV CP蛋白從1 000 ng/mL等比稀釋至7.812 5 ng/mL，運(yùn)用建立的檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，建立間接ELISA靈敏度曲線，并得出最低檢測(cè)限。

1.6.3?樣品檢測(cè)

對(duì)田間采集的50份疑似感染AMV的大豆樣品進(jìn)行檢測(cè)，分別將健康的大豆葉片、疑似感染AMV的大豆葉片按1∶10（m/V，g/mL）比例加入碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）研磨后取上清100 μL/孔，包被酶標(biāo)板，運(yùn)用建立的間接ELISA方法和RT-PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證。AMV特異性引物：AMV CPs（5′-ATGAGTTCTTCACAAAAGAAAGCTGG-3′）和AMV CPa（5′-ATGACGATCAAGATCGTCAGCTTC-3′），按1.2中步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)比兩種方法的檢測(cè)結(jié)果，驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。

1.7?吉林省大豆SMV病毒和AMV病毒感染情況調(diào)查

2021年8月，在吉林省公主嶺市、遼源市、撫松市、敦化市和資源區(qū)5個(gè)地區(qū)選擇連片地塊面積在1 hm2以上的生產(chǎn)田為代表，采用五點(diǎn)取樣法隨機(jī)采集大豆樣品，經(jīng)液氮速凍后置于-80℃冰箱保存。利用建立的AMV間接ELISA檢測(cè)方法和實(shí)驗(yàn)室已建立的SMV間接ELISA檢測(cè)方法［22］對(duì)大豆樣品進(jìn)行檢測(cè)，分析不同地區(qū)大豆植株的病毒感染情況。

1.8?不同大豆品種的AMV抗性評(píng)價(jià)

取感染AMV的大豆葉片加入PBS（pH 7.4）進(jìn)行研磨，12 000 r/min 離心3 min，取上清液。在種植的40個(gè)不同品種的大豆葉片上噴灑500目金剛砂，吸取100 μL病毒液滴在噴灑金剛砂的葉片上，用手指輕輕涂抹3～5次，摩擦接種3 min后用清水沖洗接種葉，再覆蓋一層濕紙巾保濕。觀察葉片發(fā)病情況，接種21 d后，取新生葉片進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，分析不同品種大豆的感染情況。

以上試驗(yàn)每孔設(shè)置3個(gè)平行，同時(shí)設(shè)置陽性（感染AMV的大豆葉片）、陰性（健康的‘威廉姆斯10號(hào)大豆）、空白（去離子水）3個(gè)對(duì)照。

2?結(jié)果與分析

2.1?AMV CP蛋白的表達(dá)與鑒定

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在694 bp左右有一條特異性條帶，與AMV CP基因大小相符合，經(jīng)測(cè)序后確定為AMV CP基因，CP蛋白序列對(duì)比結(jié)果表明（圖1），來源于大豆的AMV與來源于苜蓿的AMV CP序列同源性為96%，有4個(gè)氨基酸殘基不同。

將成功構(gòu)建的pET-28a-AMV轉(zhuǎn)入表達(dá)菌Rossetta中，擴(kuò)大培養(yǎng)后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，分別取誘導(dǎo)前、后的菌體及純化后的AMV CP蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定，如圖2a所示，在25 kD左右有一條特異性的條帶，與預(yù)期大小一致，以包涵體形式表達(dá)。Ni2+離子親和層析柱對(duì)目的蛋白純化后進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定，在25 kD左右觀察到單一的目的條帶，證明已得到高純度的目的蛋白。純化后的蛋白進(jìn)行Western blot鑒定，在25 kD左右有一條清晰的特異性條帶（圖2b），證明純化后的重組蛋白為AMV CP蛋白。

2.2?抗血清效價(jià)及特異性分析

分別以AMV CP重組蛋白和感染AMV的大豆葉片粗提物為抗原包被酶標(biāo)板，將免疫4次后獲得的抗血清梯度稀釋，采用間接ELISA檢測(cè)方法對(duì)抗血清的效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，制備的3份AMV抗血清檢測(cè)AMV CP蛋白和AMV感染大豆葉片蛋白粗提物，效價(jià)均能達(dá)到256 000倍。

通過Western blot檢測(cè)對(duì)制備的AMV抗血清進(jìn)行特異性分析，如圖4所示，制備的AMV抗血清能夠特異性識(shí)別感染AMV的不同品種的大豆葉片;不識(shí)別感染大豆花葉病毒soybean mosaic virus（SMV）的大豆葉片，說明制備的AMV抗血清特異性良好。

2.3?間接ELISA檢測(cè)方法靈敏度

將AMV CP蛋白等比稀釋，運(yùn)用建立的間接ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，如圖5所示，以AMV CP蛋白濃度為橫坐標(biāo)，P/N值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性方程y=0.022 2x+0.964 5，R2=0.998 5，當(dāng)P/N=2.1時(shí)，AMV CP蛋白的最低檢測(cè)限為46.7 ng/mL。

2.4?檢測(cè)方法準(zhǔn)確性分析

利用本研究建立的AMV間接ELISA檢測(cè)方法和RT-PCR方法對(duì)50份大豆樣品進(jìn)行檢測(cè)，兩種方法檢測(cè)結(jié)果均為陽性的樣品數(shù)為30份，均為陰性的樣品16份，ELISA檢測(cè)結(jié)果為陰性而RT-PCR檢測(cè)結(jié)果為陽性的樣品4份，可得：一致率＝（共同陽性結(jié)果份數(shù)+共同陰性結(jié)果份數(shù)）/樣品總數(shù)，即92%。

2.5?吉林省大豆SMV病毒和AMV病毒感染情況調(diào)查

對(duì)采集的1 342份大豆樣品進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，病毒檢出率為38.30%，SMV的陽性檢出率達(dá)30.85%，AMV的陽性檢出率達(dá)17.06%，雙病毒復(fù)合侵染的陽性檢出率達(dá)9.61%，表明這兩種病毒在吉林省大豆種植區(qū)普遍存在。

對(duì)不同大豆種植區(qū)病毒感染情況的調(diào)查分析表明（表1），各個(gè)產(chǎn)區(qū)大豆樣品的感染率普遍偏高。其中敦化地區(qū)陽性檢出率最高，達(dá)42.70%，公主嶺地區(qū)陽性檢出率相對(duì)較低，為35.75%。此次調(diào)查的5個(gè)地區(qū)中，只有遼源地區(qū)不存在病毒復(fù)合侵染的情況，其他4個(gè)產(chǎn)區(qū)均存在雙病毒復(fù)合侵染的情況，陽性檢出率分別為3.62%、9.11%、12.00%、17.88%。其中敦化地區(qū)復(fù)合侵染率最高。

2.6?大豆品種的AMV抗性評(píng)價(jià)

AMV接種40個(gè)大豆品種，接種21 d后，發(fā)現(xiàn)‘墾豐22等29個(gè)大豆品種出現(xiàn)出典型AMV感染癥狀，葉片大面積黃化、葉片邊緣明顯卷曲皺縮，植株生長(zhǎng)受到嚴(yán)重影響（圖6a），推測(cè)這些品種可能對(duì)AMV沒有抗性;‘黑農(nóng)23等11個(gè)供試大豆品種的幼苗表現(xiàn)出較輕微的發(fā)病癥狀，主要表現(xiàn)為葉片有黃色斑點(diǎn)或者并無明顯的黃斑，無法直接觀察到AMV感染的特征（圖6b），說明這些品種可能對(duì)AMV侵染具有抗性或耐病性。運(yùn)用建立的AMV間接ELISA檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行病毒檢測(cè)，結(jié)果如圖7所示，40個(gè)大豆樣品全部感染AMV病毒，其中‘墾豐22的OD450值最高而且高于陽性對(duì)照，結(jié)合田間癥狀表現(xiàn)，該品種是高感AMV品種;‘黑農(nóng)23‘黑農(nóng)24‘黑農(nóng)30‘黑農(nóng)34‘黑農(nóng)44‘黑農(nóng)71‘中龍606‘黑農(nóng)55‘墾豐17‘黑河3號(hào)‘綏農(nóng)53的OD450值在0.2到0.25之間，病毒載量較低，結(jié)合田間癥狀評(píng)價(jià)，這11個(gè)品種具有AMV抗性;其余28個(gè)品種OD450在0.25到0.4之間，病毒載量較高。表明不同大豆品種對(duì)AMV的抗性有明顯差異。

3?結(jié)論與討論

大豆病毒種類較多，僅憑表型難以區(qū)分，通常采用核酸和血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行甄別［21-24］。血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)單方便、耗時(shí)較短、更適合基層人員使用［27-28］。但是AMV的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)研究的較少，尤其是感染大豆的AMV研究更是鮮有報(bào)道。本研究從表現(xiàn)花葉和葉片壞死癥狀的大豆植株上獲得了AMV分離物，并克隆了大豆AMV分離物的CP基因，不同來源（大豆和苜蓿）的AMV CP蛋白有4個(gè)氨基酸殘基不同，因此，以AMV大豆分離物CP蛋白制備的抗體對(duì)大豆源AMV更具特異性和敏感性。以大腸桿菌重組表達(dá)的CP蛋白為免疫原制備的抗血清能特異性識(shí)別AMV病毒，而且效價(jià)非常高，說明大腸桿菌重組表達(dá)的AMV CP蛋白的免疫特性與天然病毒CP蛋白相似，而重組表達(dá)蛋白比病毒純化要簡(jiǎn)便很多。另外，本研究選擇在載體pET-28b的Nco Ⅰ和Xho Ⅰ兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間插入CP基因，這樣表達(dá)出來的重組CP蛋白除了His標(biāo)簽以外，只有自身的序列，能夠最大程度體現(xiàn)AMV CP蛋白的抗原特性。

以本研究獲得的抗體為基礎(chǔ)建立的大豆源AMV間接ELISA檢測(cè)方法為田間樣品檢測(cè)提供了高效、精準(zhǔn)的檢測(cè)技術(shù)，經(jīng)試驗(yàn)證明，準(zhǔn)確性達(dá)到92%。本研究還證明該ELISA檢測(cè)方法適用于苜蓿的AMV檢測(cè)（數(shù)據(jù)未列出）。利用本研究獲得的重組CP蛋白，通過免疫BABL/c小鼠和細(xì)胞融合技術(shù)，可以制備AMV的單克隆抗體，建立雙抗體夾心ELISA，進(jìn)一步提高AMV檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。

吉林省是我國(guó)大豆種植的主產(chǎn)區(qū)，本研究首次對(duì)吉林省田間大豆植株進(jìn)行AMV和SMV感染調(diào)查，結(jié)果表明，兩種病毒在大豆產(chǎn)區(qū)普遍存在，且存在復(fù)合侵染的情況，占全部樣品的9.61%;Malapi-Nelson等研究發(fā)現(xiàn)SMV與AMV復(fù)合侵染會(huì)導(dǎo)致大豆植株出現(xiàn)更為嚴(yán)重的癥狀［30］。從本次調(diào)查獲得的吉林省AMV檢出率（17%）來看，AMV已經(jīng)成為影響吉林省大豆生產(chǎn)的主要病毒之一。敦化是吉林省大豆的主產(chǎn)區(qū)，來自敦化地區(qū)的大豆植株樣品中，AMV檢出率超過30%，為吉林省最高，并且復(fù)合感染率也達(dá)到了17.88%，個(gè)別田塊受AMV影響而大幅減產(chǎn)（產(chǎn)量損失大于35%），因此，針對(duì)AMV的防控技術(shù)和抗病育種研究顯得越來越重要。氣候變化和吉林省特殊的地理位置，導(dǎo)致蚜蟲等傳播介體種群數(shù)量逐年增長(zhǎng)，可能是大豆AMV病害流行增加的原因之一，針對(duì)傳播介體的防控也應(yīng)該受到足夠的重視［29］。

抗病育種是防控病毒病危害的有效手段，抗性鑒定是抗病育種的重要環(huán)節(jié)，國(guó)內(nèi)學(xué)者培育和推廣了很多抗SMV的大豆品種，但是至今仍未有抗AMV和SMV的大豆雙抗品種和抗AMV的大豆單抗品種。應(yīng)加強(qiáng)抗性資源的挖掘和AMV致病性與大豆抗病性分子機(jī)制的研究，選育抗性品種。本研究對(duì)黑龍江地區(qū)40個(gè)大豆主栽品種進(jìn)行了AMV接種，接種21 d 后運(yùn)用建立的間接ELISA方法對(duì)其進(jìn)行病毒檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，40個(gè)大豆品種全部感染AMV病毒。本研究還發(fā)現(xiàn)部分感染AMV的大豆沒有明顯癥狀，屬于隱癥感染，因此病毒檢測(cè)有助于提高AMV抗性鑒定的準(zhǔn)確性。本研究未發(fā)現(xiàn)對(duì)AMV免疫的大豆品種，但部分品種表現(xiàn)一定水平的抗性。結(jié)合AMV檢測(cè)技術(shù)，進(jìn)一步對(duì)大豆種質(zhì)資源進(jìn)行AMV抗性鑒定，篩選抗性資源［31-32］，進(jìn)而為品種選育提供科學(xué)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：田?喆）