胡曉倩 石志鈺 朱玉濤 高琳穎 王平 王宏偉 侯玉霞

摘要 棉花黃萎病是一種嚴(yán)重影響棉株生長的土傳維管束真菌病害。挖掘抗性基因，解析抗病機(jī)制，對創(chuàng)制棉花抗病種質(zhì)防御棉花黃萎病具有重要意義。本研究從抗病棉花品種‘中植棉2號中獲得GhRAR1基因，采用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）技術(shù)、基因過表達(dá)及qRT-PCR技術(shù)探究GhRAR1介導(dǎo)的棉花抗黃萎病機(jī)制。結(jié)果表明，GhRAR1的表達(dá)受棉花黃萎病菌誘導(dǎo)。GhRAR1沉默棉株對黃萎病菌敏感性增強(qiáng)，表現(xiàn)為植株病情指數(shù)升高、葉片萎蔫、莖部維管束組織褐變加重。GhRAR1沉默棉株中活性氧（ROS）生成基因GhRbohD表達(dá)量低，H2O2積累量少。過表達(dá)GhRAR1基因的擬南芥植株對棉花黃萎病抗性增強(qiáng)，AtRbohD表達(dá)量高，H2O2積累量多，發(fā)生過敏反應(yīng)（HR），菌絲擴(kuò)散被抑制。推測GhRAR1可能調(diào)控ROS積累和HR，從而介導(dǎo)棉花對黃萎病菌的抗性。

關(guān)鍵詞 棉花黃萎病;?GhRAR1;?VIGS技術(shù);?抗病

中圖分類號： S 423.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2021639

Abstract Cotton Verticillium wilt is a soil-borne vascular fungal disease， which seriously affects the growth of cotton. Mining resistance genes and exploring disease resistance mechanism are essential for innovating cotton disease-resistant germplasms and controlling cotton Verticillium wilt. Here， we cloned GhRAR1 from the disease-resistant cultivar ‘Zhongzhimian 2， and VIGS， overexpression techniques and qRT-PCR were used to explore the potential mechanism of GhRAR1-mediating defense against Verticillium wilt. The results showed that GhRAR1 was up-regulated in cotton plants inoculated with Verticillium dahliae. When GhRAR1 was knocked down， cotton plants were more susceptible to V.dahliae than the control， with the increase of plant disease index， leaf wilting and heavy browning of vascular bundle tissue in the stem. Furthermore， GhRAR1-silenced cotton seedlings showed lower expression of GhRbohD， and less accumulation of H2O2 than the control. When GhRAR1 was overexpressed in Arabidopsis thaliana， the plants exhibited enhanced resistance to V.dahliae. GhRAR1-overexpressed A.thaliana plants showed higher expression of AtRbohD， more accumulation of H2O2 than wild-type A.thaliana， and appeared hypersensitive response （HR）， thereby inhibited the spread of hyphae. Taken together， our study indicates that GhRAR1 may be involved in regulating ROS accumulation and HR production for the resistance of cotton plants to V.dahliae.

Key words cotton Verticillium wilt;?GhRAR1;?VIGS;?disease resistance

棉花黃萎病的病原為大麗輪枝菌Verticillium dahliae，常規(guī)化學(xué)防治方法難以實(shí)現(xiàn)有效防治［1］，培育棉花抗病品種是解決這一難題的有效途徑，因此研究抗性基因及其作用機(jī)制，為抗病育種提供基因資源顯得尤為重要。

植物本身已進(jìn)化出了復(fù)雜的免疫系統(tǒng)以應(yīng)對病原菌的入侵，有許多抗棉花黃萎病的基因在棉花免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著作用。例如，防衛(wèi)基因GhPGIP1在棉花中過表達(dá)后，PRs、EDS1、PAD4和ICS1基因表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)木質(zhì)部木質(zhì)化，進(jìn)而提高棉花的抗病性［2］;漆酶基因GhLAC15受病原菌的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，過表達(dá)GhLAC15后，棉花木質(zhì)化程度增強(qiáng)、細(xì)胞壁中阿拉伯糖和木糖的積累增多，對黃萎病的抗性增強(qiáng)［3］;編碼富含亮氨酸重復(fù)序列的類受體蛋白基因Gbve1在陸地棉中過表達(dá)增強(qiáng)了對黃萎病菌的抗性［4］;編碼轉(zhuǎn)錄因子基因GhMYB108沉默后，棉花對棉花黃萎病菌的敏感性增強(qiáng)［5］;SA信號通路的GhSAMDC基因［6］，JA通路的GhCDKE基因［7］，ET通路的GbABR1基因［8］等均正向調(diào)控棉花對黃萎病的抗性。

RAR1（required for Mla12-mediated resistance， RAR1）是一種鋅結(jié)合蛋白，有2個(gè)富含半胱氨酸和組氨酸的保守結(jié)構(gòu)域（cysteine and histidine rich domain， CHORD），參與R基因編碼蛋白TIR-NBS-LRR和CC-NBS-LRR介導(dǎo)的防衛(wèi)信號識別與傳導(dǎo)，是植物抗病信號通路的重要組成元件［9-10］。RAR1被植物中的抗病基因觸發(fā)后，激活下游免疫反應(yīng)，如活性氧（ROS）暴發(fā)、過敏反應(yīng)（HR）等，發(fā)揮抗病功能［11］。其中，ROS是植物識別病原菌的早期反應(yīng)中最重要的信號之一［12］，除其本身具有殺菌作用外，還作為誘發(fā)HR的信號分子發(fā)揮作用［13］。HR造成侵染部位壞死，限制病原菌菌絲擴(kuò)散［14］。RAR1基因的功能在大麥Hordeum vulgare中首次被鑒定，研究發(fā)現(xiàn)RAR1突變體在病原菌觸發(fā)的全細(xì)胞H2O2積累和細(xì)胞死亡中受到損害，表明RAR1在大麥抗性途徑早期具有信號傳導(dǎo)功能［9］。在擬南芥Arabidopsis thaliana中，RAR1被證明是R基因觸發(fā)早期防御反應(yīng)的限速調(diào)節(jié)因子，決定了對病原體的遏制程度［10］。據(jù)報(bào)道， SiRAR1基因在抗病品種中受谷銹菌Uromyces setariae-italicae誘導(dǎo)后上調(diào)更顯著，可能正調(diào)控谷子抗病性［15］。目前為止，RAR1在棉花抗黃萎病中的作用機(jī)制尚不清楚。

本研究基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)從‘中植棉2號棉花中獲得GhRAR1基因。通過qRT-PCR技術(shù)分析了棉花GhRAR1基因的組織特異性表達(dá)模式和對棉花黃萎病菌的響應(yīng);分別調(diào)查了GhRAR1沉默棉花植株和穩(wěn)定表達(dá)GhRAR1 的擬南芥植株對棉花黃萎病的抗性水平。其中棉株中GhRAR1基因沉默是通過VIGS技術(shù)實(shí)現(xiàn)的，該技術(shù)以病毒為載體接種到植株中，在當(dāng)代植株中即可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后沉默，操作簡易、快速高效［16］。初步探究了GhRAR1參與棉花抗病的機(jī)理。

1?材料與方法

1.1?植物材料和真菌培養(yǎng)

‘中植棉2號種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所惠贈，種子萌發(fā)后于培養(yǎng)箱中24℃、L∥D=16 h∥8 h條件下培養(yǎng)。擬南芥Arabidopsis thaliana哥倫比亞型（Col-0）種子在4℃春化3 d后，于L∥D=16 h∥8 h，光暗對應(yīng)溫度22℃/18℃條件下培養(yǎng)。

棉花黃萎病菌Vd991菌株在PDA培養(yǎng)基上于25℃培養(yǎng)7 d，然后將菌落轉(zhuǎn)移到查氏液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，獲得孢子懸浮液，調(diào)整濃度為1×107個(gè)/mL用于浸根法［17］及葉片接種試驗(yàn)。

1.2?基因克隆

使用EASYspin 植物 RNA提取試劑盒（博邁德，北京）提取棉花 RNA。采用FastQuant cDNA 第一鏈合成試劑盒（天根，北京）將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，根據(jù)棉花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)特異性引物GhRAR1 （表1），進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得GhRAR1基因，基因序列經(jīng)測序驗(yàn)證正確。

1.3?生物信息學(xué)分析

DNA序列使用Genetyx軟件進(jìn)行分析。通過MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹;使用Clustal Omega在線系統(tǒng)（https：∥www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）進(jìn)行氨基酸序列比對;通過ExPASy （https：∥web.expasy.org/compute_pi/）預(yù)測蛋白分子量、等電點(diǎn)。

1.4?qRT-PCR 分析目的基因表達(dá)特征

設(shè)計(jì)qGhRAR1、 qGhRbohD、 qAtRbohD、 qVd特異性引物（表1），以GhUBQ7 （DQ116441）和AtEF-1-α （NM_100666.4）為內(nèi)參基因。qRT-PCR 使用 SYBR Premix Ex Taq （Tli RNaseH Plus） 試劑盒以 20 μL 的終體積制備反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq （Tli RNaseH Plus） 10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，50 ng/μL cDNA模板2 μL，RNase-free ddH2O 6.8 μL。在ABI7500 熱循環(huán)儀（Applied Biosystems）上進(jìn)行擴(kuò)增，采用三步法反應(yīng)程序，第一步：95℃ 30 s，循環(huán)1次;第二步：95℃ 5 s，60℃ 35 s，循環(huán)40次;第三步：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，循環(huán)1次。每處理分別設(shè)3次生物學(xué)和技術(shù)重復(fù)，相對閾值法（2-ΔΔCt）計(jì)算相對表達(dá)量。

1.5?沉默載體構(gòu)建和沉默植株的獲得

采用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）技術(shù)進(jìn)行基因沉默［16］。

棉花GhCLA1基因控制葉綠素合成，用GhCLA1沉默棉株做陽性對照。根據(jù)GhRAR1功能域序列設(shè)計(jì)引物VIGS-GhRAR1（表1），對‘中植棉2號cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到GhRAR1沉默片段。將沉默片段與VIGS載體PYL192連接，獲得陽性單克隆菌液。提取陽性單克隆質(zhì)粒，構(gòu)建GhCLA1和GhRAR1的沉默載體TRV∷GhCLA1和 TRV∷GhRAR1。

將TRV∷GhCLA1和TRV∷GhRAR1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中測序，然后將序列正確的重組質(zhì)粒通過熱激法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101菌株［18］，將空載體PYL192用同樣的方法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101菌株中作為對照，用TRV∷00表示。將根癌農(nóng)桿菌培養(yǎng)物注射到‘中植棉2號2周齡幼苗的子葉中。將幼苗放回培養(yǎng)箱中生長 2 周，獲得沉默棉株［2］。

1.6?過表達(dá)載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得

將GhRAR1基因和pCAMBIA1300載體（含潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶）經(jīng)Pst I和Sal I酶切后連接，構(gòu)建GhRAR1過表達(dá)載體。熱激法將重組載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌 GV3101 菌株，通過蘸花序法獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥植株［19］，將其產(chǎn)生的種子在含有25 mg/L潮霉素B的MS固體培養(yǎng)基上篩選，顯示100% 潮霉素抗性的穩(wěn)定表達(dá)株系用于后續(xù)試驗(yàn)［14］。

1.7?組織化學(xué)染色

DAB染色用以觀察H2O2積累［20］。每片葉片上滴加10 μL的1×107個(gè)/mL Vd991孢子懸浮液，72 h后，并將其浸入 DAB-HCl 溶液（pH為3.8）中染色 6～7 h，脫色后用生物顯微鏡（Nikon）拍照。

臺盼藍(lán)染色用以觀察菌絲和壞死細(xì)胞［21］。將葉片在臺盼藍(lán)溶液中煮沸1 min，過夜染色，隨后用水合氯醛溶液（250%，m/V）脫色，生物顯微鏡（Nikon）拍照。

1.8?H2O2含量測定

使用 FOX 試劑法［22］測定H2O2含量。FOX試劑：250 μmol/L 硫酸亞鐵銨、100 μmol/L 山梨醇、100 μmol/L 二甲酚橙、25 μmol/L H2SO4、1%無水乙醇。

1.9?病害調(diào)查和真菌生物量檢測

通過觀察植株表型并計(jì)算病情指數(shù)（DI）評估病害嚴(yán)重程度，用0～4級共5個(gè)等級對植株病情進(jìn)行分級統(tǒng)計(jì)［23］。病情指數(shù)=∑（各級病株數(shù)×各級代表值）/（4×調(diào)查總株數(shù)）×100。

通過qRT-PCR對擬南芥中Vd991生物量進(jìn)行量化［24］。將Vd991接種于擬南芥植株，接菌后14 d采集樣品研磨，取100 mg細(xì)粉末提取基因組DNA，以DNA為模板，用qRT-PCR檢測植株中Vd991生物量，引物為qVd-F/-R， 以AtEF-1-α（NM_00666.4）為內(nèi)參基因，相對閾值法（2-ΔΔCt）計(jì)算相對表達(dá)量。

2?結(jié)果分析

2.1?GhRAR1基因特征

GhRAR1基因開放閱讀框663 bp，編碼221個(gè)氨基酸，包含2個(gè)鋅結(jié)合蛋白功能域CHORD-Ⅰ和CHORD-Ⅱ（圖1a）。GhRAR1蛋白的分子量為24.21 kD，等電點(diǎn)為8.46。將AtRAR1（AAF18433.1）、HvRAR1（AAF18432.1）、NtRAR1（AAM62409.1）、TaRAR1（AIX87838.1）與GhRAR1（Gh_D09G189700.1）氨基酸序列進(jìn)行比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1b），發(fā)現(xiàn)GhRAR1與NtRAR1氨基酸，親緣關(guān)系最近。

2.2?GhRAR1組織表達(dá)特征

提取‘中植棉2號根、莖和葉的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR定量分析，發(fā)現(xiàn)GhRAR1基因在棉花根、莖和葉3種組織中都有表達(dá)，在棉花莖部表達(dá)量最高（圖2）。

2.3?大麗輪枝菌（Vd991）誘導(dǎo)GhRAR1表達(dá)

使用大麗輪枝菌強(qiáng)毒力菌株Vd991孢子懸浮液侵染棉株根部，利用qRT-PCR定量分析Verticillium dahliae菌株Vd991侵染后0、6、12、24、48、72 h 的棉花根部GhRAR1基因表達(dá)量變化。結(jié)果（圖3）表明，GhRAR1表達(dá)受Vd991誘導(dǎo)，在24 h時(shí)GhRAR1表達(dá)量上調(diào)達(dá)峰值，約為0 h表達(dá)量的5.5倍。

2.4?GhRAR1基因沉默棉株對大麗輪枝菌的敏感性

利用VIGS技術(shù)沉默棉花中的 GhRAR1 基因。

VIGS處理2周時(shí)，GhCLA1 沉默植株出現(xiàn)明顯白化（圖4a）。

利用半定量RT-PCR檢測棉株中GhRAR1基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)TRV∷GhRAR1植株的GhRAR1條帶亮度明顯比對照（TRV∷00）淺，說明 GhRAR1 基因沉默體系構(gòu)建成功（圖4b）。與此同時(shí)，用qRT-PCR檢測對GhRAR1的沉默效率，結(jié)果表明，與TRV∷00植株相比，TRV∷GhRAR1中GhRAR1表達(dá)量顯著下降（圖4c）。接菌18 d后，與TRV∷00相比，TRV∷GhRAR1棉株對Vd991更加敏感，表現(xiàn)為更多的黃葉、枯萎（圖4d），莖部出現(xiàn)更嚴(yán)重的維管束褐變（圖4e），植株病情指數(shù)顯著升高（圖4f）。

2.5?GhRAR1基因沉默棉株接種大麗輪枝菌后H2O2積累量減少

濃度為1×107個(gè)/mL 的Vd991孢子懸浮液侵染TRV∷GhRAR1棉株和TRV∷00棉株后48 h，TRV∷GhRAR1棉株中ROS生成基因GhRbohD的表達(dá)量顯著低于對照（圖5a）; H2O2積累量在侵染48 h和72 h時(shí)，均顯著少于對照（圖5b）;

對接菌棉株葉片進(jìn)行DAB染色，發(fā)現(xiàn)Vd991侵染72 h時(shí)，TRV∷GhRAR1棉株中被染色部分明顯少于對照（圖5c），與定量測定結(jié)果一致，說明GhRAR1沉默棉株接種大麗輪枝菌后H2O2積累量減少。

2.6?GhRAR1過表達(dá)擬南芥對棉花黃萎病的抗性增強(qiáng)

為探究GhRAR1基因在植物抵御黃萎病菌過程中的作用，構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-GhRAR1，獲得轉(zhuǎn)GhRAR1擬南芥植株，共7個(gè)株系。

對這7個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中GhRAR1基因進(jìn)行定量，野生型擬南芥中并未檢測到GhRAR1基因。選擇GhRAR1穩(wěn)定表達(dá)且表達(dá)量較高的擬南芥株系Line 1、Line 4和Line 5及野生型擬南芥，用濃度為1×107個(gè)/mL 的Vd991孢子懸浮液進(jìn)行浸根處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理后16 d，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片黃化、壞死等癥狀明顯減輕（圖6a），植株中大麗輪枝菌生物量顯著降低（圖6b），且接菌后18 d病情指數(shù)也明顯低于野生型擬南芥植株。

2.7?GhRAR1過表達(dá)擬南芥接黃萎病菌后H2O2積累量增多

濃度為1×107個(gè)/mL的Vd991孢子懸浮液侵染GhRAR1過表達(dá)擬南芥植株后，植株中ROS生成基因AtRbohD的表達(dá)量明顯高于野生型植株（圖7a）。

H2O2積累量在侵染植株48 h和72 h時(shí)均顯著高于野生型植株（圖7b）。

2.8?轉(zhuǎn)GhRAR1基因擬南芥植株產(chǎn)生過敏反應(yīng)限制病原菌的擴(kuò)散

用臺盼藍(lán)溶液對Vd991侵染2 d的擬南芥葉片染色，結(jié)果（圖8）顯示，GhRAR1過表達(dá)植株葉片存在明顯的HR引起的細(xì)胞死亡，且HR的發(fā)生明顯抑制了大麗輪枝菌菌絲的生長。而野生型擬南芥中菌絲生長更多、擴(kuò)散更快。

3?結(jié)論與討論

RAR1是抗病基因介導(dǎo)的抗性反應(yīng)過程中的重要信號元件［25］。本研究從‘中植棉2號中克隆到GhRAR1基因，獲得GhRAR1基因沉默的棉株和GhRAR1過表達(dá)的擬南芥植株。通過對不同植株進(jìn)行黃萎病菌接種、病害調(diào)查、相關(guān)基因表達(dá)量檢測和組織化學(xué)染色探究了GhRAR1基因在抗棉花黃萎病中的作用。

棉花GhRAR1具有植物RAR1蛋白的特征序列，含有2個(gè)CHORD結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化樹分析表明，GhRAR1與煙草NtRAR1 親緣關(guān)系較近。本研究結(jié)果表明GhRAR1對黃萎病菌有響應(yīng)，于Vd991處理后24 h其表達(dá)量達(dá)到峰值。據(jù)報(bào)道，AtRAR1突變以及沉默TaRAR1均導(dǎo)致植物抗病性出現(xiàn)不同程度的減弱［10，26］。為了進(jìn)一步驗(yàn)證GhRAR1是否參與植物對棉花黃萎病菌的防御響應(yīng)，本研究構(gòu)建了GhRAR1沉默棉株和GhRAR1過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。結(jié)果表明，沉默棉株對棉花黃萎病敏感性增強(qiáng);葉片枯黃、壞死程度明顯加重，莖部維管束褐變加重。過表達(dá)GhRAR1基因的擬南芥植株對棉花黃萎病抗性增強(qiáng)。與野生型相比葉片枯黃、壞死程度明顯減輕，大麗輪枝菌定殖量明顯減少，表明GhRAR1在植物抗棉花黃萎病反應(yīng)中起正調(diào)控作用。

RAR1被認(rèn)為是R基因誘導(dǎo)的防御反應(yīng)的限速因子，在ROS暴發(fā)的上游發(fā)揮作用［10］，且ROS除本身具有殺菌作用外還作為信號參與抗病反應(yīng)［13，27］。結(jié)果證實(shí)Vd991處理后GhRAR1基因沉默棉株的ROS生成相關(guān)基因RbohD的表達(dá)量和H2O2積累量均低于對照，與DAB染色結(jié)果一致;GhRAR1基因過表達(dá)擬南芥植株中RbohD的表達(dá)量和H2O2積累量均高于對照。此外，Vd991侵染后的組織化學(xué)染色結(jié)果表明，GhRAR1基因過表達(dá)擬南芥及時(shí)出現(xiàn)HR響應(yīng)，有效抑制病原菌菌絲的擴(kuò)散。表明GhRAR1基因可能通過影響H2O2的積累和ROS的暴發(fā)，影響HR的發(fā)生，在植株抗棉花黃萎病的早期反應(yīng)中發(fā)揮作用。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）