羅藝徽 吳姍姍 王振常 呂艷杭

〔摘要〕 目的 探討壯肝逐瘀煎聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mensenchymal stem cell， BMMSC）移植對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的影響。方法 取20只大鼠為正常對照組（A組），另取80只造模成功后的大鼠，隨機(jī)分為模型組（B組）、單純壯肝逐瘀煎組（C組）、單純BMMSC組（D組）、壯肝逐瘀煎聯(lián)合BMMSC組（E組），每組20只。A組、B組、D組灌服生理鹽水（0.1 mL/kg，1次/d），C組、E組灌服壯肝逐瘀煎（0.1 mL/kg，1次/d），各組均連續(xù)干預(yù)12周。其中，第4周末，B組、C組尾靜脈注射生理鹽水，D組、E組尾靜脈注射BMMSC。干預(yù)后，采用HE染色觀察各組大鼠肝臟病理變化；采用全自動生化儀檢測肝功能指標(biāo)[谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransaminase， AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase， ALT）、總膽紅素（total bilirubin， TBIL）、白蛋白（albumin， ALB）]變化；采用RT-PCR檢測肝組織甲胎蛋白（alpha fetoprotein， AFP）、ALB、細(xì)胞角蛋白18（cytokeratin 18， CK18）mRNA；采用Western blot檢測表皮生長因子（epidermal growth factor， EGF）、肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor， HGF）的表達(dá)；冷凍切片技術(shù)檢測攜帶綠色熒光蛋白的BMMSC向肝臟歸巢的情況。結(jié)果 B組肝小葉結(jié)構(gòu)被廣泛增生的纖維化組織分割并包繞成大小不等的圓形或類圓形的肝細(xì)胞團(tuán)（即假小葉），肝細(xì)胞排列絮亂、壞死、變性及再生。C組、D組、E組肝小葉結(jié)構(gòu)得到不同程度的恢復(fù)，肝細(xì)胞變性、水腫得到不同程度的改善。與A組比較，B組AST、ALT、TBIL明顯升高（P<0.05），ALB和AFP、ALB、CK18 mRNA及HGF、EGF蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05）。與B組比較，C組、D組、E組AST、ALT、TBIL明顯降低（P<0.05），ALB和AFP、ALB、CK18 mRNA及HGF、EGF蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05）。與E組比較，C組、D組AST、ALT、TBIL明顯升高（P<0.05），ALB和AFP、ALB、CK18 mRNA及HGF、EGF蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05）。免疫熒光結(jié)果顯示，E組肝臟內(nèi)攜帶綠色熒光蛋白數(shù)量明顯高于A組、D組。結(jié)論 壯肝逐瘀煎聯(lián)合BMMSC治療可抗肝纖維化，可有效促進(jìn)BMMSC向肝臟歸巢，修復(fù)受損的肝組織。

〔關(guān)鍵詞〕 壯肝逐瘀煎；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植；聯(lián)合治療；歸巢；CCl4；肝纖維化

〔中圖分類號〕R259 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.03.012

Effects of Zhuangfang Zhuanggan Zhuyu Decoction combined with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on rats with CCl4-induced liver fibrosis

LUO Yihui， WU Shanshan， WANG Zhenchang， LV Yanhang

Guangxi International Zhuang Medicine Hospital， Nanning， Guangxi 530201， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the effects of Zhuanggan Zhuyu Decoction （ZGZYD） combined with bone marrow mesenchymal stem cell （BMMSC） transplantation on rats with CCl4-induced liver fibrosis. Methods A total of 20 rats was taken as normal control group （group A）. Another 80 model rats were randomly divided into model group （group B）， ZGZYD group （group C）， BMMSC group （group D）， ZGZYD+BMMSC group （group E）， with 20 rats in each group. Group A， B and D were administrated with physiology brine （0.1 mL/kg， once a day）， while group C and E were administrated with ZGZYD （0.1 mL/kg， once a day）. All groups were treated for 12 weeks. At the end of the 4th week， group B and C were injected with normal saline into caudal vein， meanwhile， group D and E were injected with BMMSC into caudal vein. After the intervention， the pathological changes of liver in each group were observed by HE staining; automatic biochemical instrument was used to detect the changes of liver function indexes [aspartate aminotransaminase （AST）， alanine aminotransferase （ALT）， total bilirubin （TBIL）， albumin （ALB）]; RT-PCR was used to detect alpha fetoproteinb （AFP）， ALB， and cytokeratin 18 （CK18） mRNA in liver tissue; the expression of epidermal growth factor （EGF） and hepatocyte growth factor （HGF） was detected by Western blot and the homing of BMSC with green fluorescent protein to liver tissue was detected by frozen section. Results The normal liver lobules in group B were segmented and surrounded by extensively proliferative fibrosis tissue into circular or quasi-circular hepatocyte masses of different sizes （false lobe）， with disorganized hepatocytes and hepatocyte necrosis， degeneration and regeneration. While in group C， D and E， the liver lobular structure was recovered to different extent， and hepatocyte degeneration and edema were improved to varying degrees. Compared with group A， the AST， ALT and TBIL in group B were significantly higher （P<0.05）， while ALB and AFP， ALB and CK18 mRNA， as well as protein expression of EGF and HCG were significantly lower （P<0.05）. Compared with group B， the AST， ALT and TBIL in group C， D and E were significantly lower （P<0.05）， but the ALB， and AFP， ALB， CK18 mRNA as well as protein expression of EGF and HCG were significantly higher （P<0.05）. Compared with group E， the AST， ALT， and TBIL in group C and D were significantly higher （P<0.05）， but the ALB， AFP， ALB， CK18 mRNA， protein expression of EGF and HCG were significantly lower （P<0.05）. The results of immunofluorescence showed that the number of green fluorescent protein in the liver of group E was significantly higher than that of group A and D. Conclusion ZGZYD combined with BMMSC treatment can resist liver fibrosis， effectively promote BMMSC homing to the liver， and repair the damaged liver tissue.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Zhuanggan Zhuyu Decoction; bone marrow mesenchymal stem cell transplantation; combination therapy; homing; CCl4; liver fibrosis

壯醫(yī)是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分，更是極具民族特色的醫(yī)學(xué)。壯醫(yī)的基礎(chǔ)理論主要包括：“陰陽為本，天地人三氣同步”的天人合一自然觀，“三道”（氣道、水道、谷道）、“兩路”（龍路、火路）的生理病理觀，“毒虛致百病”的病因病機(jī)，“調(diào)氣、補(bǔ)虛、祛毒”的治療原則和“主藥、公藥、母藥、幫藥”的方劑配伍用藥原則[1]。壯醫(yī)學(xué)把肝稱為“咪疊”，肝纖維化可納入壯醫(yī)學(xué)“咪疊蠱”范疇。壯醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“咪疊蠱”是由于人體正氣虧虛，毒邪侵人體，“毒”邪寄生“咪疊”，阻塞“三道”“兩路”，致噓嘞（氣血）瘀滯，“咪疊”疏泄功能失調(diào)，使內(nèi)毒蘊(yùn)生、三氣不能同步[2]。壯肝逐瘀煎在已故全國老中醫(yī)藥專家學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承工作指導(dǎo)老師林沛湘治療慢性肝炎、肝硬化的有效驗(yàn)方基礎(chǔ)上，融入頗具壯醫(yī)特色的“澤蘭”“虎杖”等藥，在臨床上運(yùn)用已有近40年，能顯著改善慢性肝炎、肝硬化患者的臨床癥狀[3]。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mensenchymal stem cell， BMMSC）是一類起源于中胚層的成體干細(xì)胞，具有自我更新及多向分化潛能，以修復(fù)受損的細(xì)胞、組織和器官，以達(dá)到治療疾病的目的[4-6]。BMMSC是一種多功能干細(xì)胞，不僅可以在體內(nèi)分化為正常的肝細(xì)胞及膽管上皮細(xì)胞，還可以通過分泌多種促進(jìn)肝臟的生長因子，達(dá)到逆轉(zhuǎn)肝纖維化的目的[7]。研究證實(shí)，BMMSC移植后對肝硬化患者近期效果顯著，表現(xiàn)為肝功能明顯好轉(zhuǎn)，臨床癥狀顯著改善，但其遠(yuǎn)期效果不理想，限制了其廣泛應(yīng)用[8-10]。本研究通過壯肝逐瘀煎聯(lián)合BMMSC闡述中醫(yī)藥的優(yōu)勢，通過中醫(yī)藥改善移植后的BMMSC生存微環(huán)境，促進(jìn)BMMSC向肝樣細(xì)胞分化。

1 材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?實(shí)驗(yàn)動物 ?成年SPF級Wistar大鼠110只，雌雄各半，體質(zhì)量120～150 g，5周齡的SPF級Wistar雄性大鼠10只，均購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，實(shí)驗(yàn)動物合格證：SCXK（桂）2018-0001。本實(shí)驗(yàn)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心及醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心、廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化實(shí)驗(yàn)室及中醫(yī)內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室完成。實(shí)驗(yàn)動物的管理及處置經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)國際壯醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過（倫理審批號：2016-S067）。大鼠飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，相對濕度50%～65%。

1.1.2 ?實(shí)驗(yàn)藥物 ?壯肝逐瘀煎由生黃芪15 g（批號：180503），薏苡仁45 g（批號：180121），生牡蠣30 g（批號：180201），黃精20 g（批號：180204），枸杞子20 g（批號：180323），橘紅12 g（批號：180526），澤蘭30 g（批號：180522），鱉甲30 g（批號：170908），雞內(nèi)金15 g（批號：171004），虎杖20 g（批號：170929），大棗15 g（批號：171106）組成，免煎顆粒藥物均購自江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬國際壯醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部嚴(yán)格按照1∶6比例進(jìn)行顆粒配方。

1.1.3 ?主要試劑 ?CCl4分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海有限公司，批號：219006）；花生油（山東煙臺萊陽魯花濃香花生油有限公司，批號：20190622）；DMEM培養(yǎng)液（美國Gibco公司，批號：180229）；細(xì)胞分離液（密度1.073 g/L，批號：161126）、胰蛋白酶（批號：181109）均購自德國Sigma公司；裂解液（批號：R0010）、緩沖液（批號：P1016）、TBST（批號：T1081）、脫脂奶粉（批號：D8340）、ECL顯色劑（批號：PE0010）均購自北京索萊寶科技有限公司；表皮生長因子（epidermal growth factor， EGF，批號：ab83760）、肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor， HGF，批號：ab77851）、β-actin（批號：ab8227）、羊抗兔抗體（批號：ab6721）均購自英國Abcam公司。

1.1.4 ?主要儀器 ?低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司，型號：5417R）；石蠟切片機(jī)（紹興譜爾儀器設(shè)備有限公司，型號：SHANDON）；全自動生化分析儀（南京頤蘭貝生物科技有限公司，型號：ES-480）；顯微鏡（日本Olympus公司，型號：IX71-22FL/PH）；蛋白核酸分析儀（美國Beckman Coulter公司，型號：DU-640）；凝膠成像儀（上海天能科技有限公司，型號：5200）。

1.2 ?實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ?實(shí)驗(yàn)動物分組 ?隨機(jī)取20只成年Wistar大鼠為正常對照組（A組），剩余的90只大鼠采用CCl4復(fù)合因素行肝纖維化造模。于第8周末隨機(jī)處死10只，驗(yàn)證肝纖維化模型是否成功。取80只造模成功后的大鼠，隨機(jī)分為模型組（B組）、單純壯肝逐瘀煎組（C組）、單純BMMSC組（D組）、壯肝逐瘀煎聯(lián)合BMMSC組（E組），每組20只。

1.2.2 ?造模方法 ?采用CCl4植物油混懸液復(fù)合因素誘導(dǎo)肝纖維化方法進(jìn)行造模[11]，皮下注射40% CCl4（第1次為5 mL/kg，以后每隔3天為3 mL/kg），聯(lián)合高脂、低蛋白食物（以玉米面為飼料，實(shí)驗(yàn)第1～2周加用0.5%膽固醇、20%豬油）。為了避免肝纖維化自然修復(fù)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的影響，所有造模大鼠灌胃給藥開始后仍每周腹腔注射1次40% CCl4 3 mL/kg[11]。

1.2.3 ?大鼠BMMSC的提取 ?取10只5周齡雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死。取股骨，保留骨骺，無菌處理后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺內(nèi)，無菌血管鉗夾碎兩端骨骺，用吸滿PBS的注射器沖出骨髓腔內(nèi)的骨髓，收集于離心管內(nèi)。將采集到的骨髓用細(xì)胞分離液分離。將密度為1.073 g/mL的細(xì)胞分離液先置于試管底部，然后按照3∶2的比例緩慢滴加獲得的骨髓液，3000 r/min、半徑30 cm離心30 min，棄上清液，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后更換培養(yǎng)液，此后每3天換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞匯合度至70%時(shí)傳代，培養(yǎng)至第4代，取2×106個(gè)BMMSC，經(jīng)大鼠尾靜脈注射，用于體內(nèi)移植[12]。

1.2.4 ?給藥方法 ?A組、B組、D組灌服生理鹽水（0.1 mL/kg，1次/d），C組、E組灌服壯肝逐瘀煎（0.1 mL/kg，

1次/d）[11]，各組均連續(xù)干預(yù)12周。其中，第4周末，B組、C組尾靜脈注射生理鹽水，D組、E組尾靜脈注射BMMSC。

1.2.5 ?標(biāo)本的采集與處理 ?干預(yù)后，禁食12 h，經(jīng)1%戊巴比妥麻醉，股靜脈采血后處死，開腹剖取肝臟，每只均取肝臟右葉相同部位的組織一塊置入10%的甲醛，行常規(guī)石蠟切片，其余于液氮中保存肝組織，以備提取mRNA。

1.2.6 ?觀察指標(biāo)及檢測方法

（1）一般情況。觀察大鼠在實(shí)驗(yàn)期間的體質(zhì)量改變、攝食量、對外界的反應(yīng)、活動度的改變、毛發(fā)變化，同時(shí)記錄大鼠死亡情況及時(shí)間。

（2）實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。采用全自動生化儀檢測大鼠血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransaminase， AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase， ALT）、白蛋白（albumin， ALB）、總膽紅素（total bilirubin， TBIL）。

（3）HE染色觀察肝組織結(jié)構(gòu)及纖維增生。各組肝組織相同部位進(jìn)行石蠟切片并采用HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織結(jié)構(gòu)及纖維增生等。

（4）RT-PCR檢測甲胎蛋白（alpha fetoprotein， AFP）、ALB、細(xì)胞角蛋白18（cytokeratin 18， CK18）mRNA的表達(dá)。用Trizol提取肝組織總RNA，采用微量紫外光光度計(jì)測定其濃度及純度，逆轉(zhuǎn)為互補(bǔ)DNA。擴(kuò)增條件：ALB，94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；AFP，94 ℃ 45 s，51 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；CK18，94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；GAPDH，94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，33個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，引物設(shè)計(jì)詳見表1。

（5）Western blot檢測EGF、HGF蛋白的表達(dá)。取30 mg組織塊置于離心管中，加入200～400 μL裂解液，組織勻漿機(jī)勻漿后，4 ℃、12 000 r/min、半徑30 cm離心5 min，取上清液，采用BCA法測定蛋白含量。加入4倍蛋白上樣緩沖液，100 ℃變性5～10 min。80 V恒壓電泳約20 min，待樣品進(jìn)入分離膠層后，換用100 V恒壓電泳1～1.5 h；200 mA恒流轉(zhuǎn)膜60～90 min。用TBST配制8%脫脂奶粉作為封閉液，將膜放入封閉液中封閉3 h。按抗體說明書上的推薦比例使用封閉液將一抗進(jìn)行稀釋，將膜放入稀釋后的一抗中，于4 ℃孵育12 h。一抗孵育完成后，使用TBST洗膜3次，每次15 min。將膜放入按1∶3000比例稀釋的二抗中，于37 ℃孵育1 h，使用TBST洗膜3次，每次15 min，使用ECL顯色劑對膜進(jìn)行顯色，于凝膠成像儀中進(jìn)行曝光成像。

（6）肝組織冰凍切片及熒光拍照。新鮮肝臟組織固定液固定24 h以上，隨后組織放于15%的蔗糖溶液內(nèi)，4 ℃冰箱內(nèi)脫水沉底后轉(zhuǎn)入30%的蔗糖溶液內(nèi)，4 ℃冰箱內(nèi)脫水沉底。將脫好水的組織使用包埋劑進(jìn)行包埋，冰凍切片機(jī)切片，厚度8～10 μm，置于載玻片上，-20 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。然后將冰箱?nèi)的冰凍切片復(fù)溫，晾干水分于冷丙酮固定10 min，待丙酮完全干后于PBS（pH 7.4）中在搖床上晃動，洗滌3次，5 min/次。滴加4′，6-二脒基-2-苯基吲哚，避光室溫孵育10 min。充分洗脫4′，6-二脒基-2-苯基吲哚后，使用抗淬滅封片劑封片，于倒置熒光顯微鏡下拍照。

1.3 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料使以“ｘ±s”表示，多組樣本均數(shù)滿足正態(tài)分布，各組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?各組大鼠一般情況比較

A組大鼠行動自如靈活，皮毛光澤，飲食及大小便正常；B組從造模開始，活動飲食較前減少，皮毛雜亂且無光澤，體質(zhì)量下降，部分大鼠大便溏爛；C組大鼠的抵抗能力較B組增強(qiáng)；D組大鼠的進(jìn)食量明顯較之前增加；E組大鼠皮毛雜亂、體質(zhì)量下降、大便溏爛得到不同程度的緩解。

2.2 ?各組大鼠肝功能指標(biāo)變化

與A組比較，B組AST、ALT、TBIL明顯升高（P<0.05），ALB明顯降低（P<0.05）。與B組比較，C組、D組、E組AST、ALT、TBIL明顯降低（P<0.05），ALB明顯升高（P<0.05）。與E組比較，C組、D組AST、ALT、TBIL明顯升高（P<0.05），ALB明顯降低（P<0.05）。詳見表2。

2.3 ?各組大鼠病理情況比較

A組可見清晰結(jié)構(gòu)的肝小葉，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心，向四周呈現(xiàn)放射狀順序排列；B組正常肝小葉結(jié)構(gòu)被廣泛增生的纖維化組織分割并包繞成大小不等的圓形或類圓形肝細(xì)胞團(tuán)（即假小葉），肝細(xì)胞排列絮亂，可見壞死、變性及再生，再生的肝細(xì)胞核深染、體積變大，部分見雙核、中央靜脈消失。C組、D組、E組肝小葉結(jié)構(gòu)得到不同程度的恢復(fù)，浸潤在肝小葉的炎癥細(xì)胞較B組減少，膠原沉淀較B組減少，部分肝小葉條索纖維疏松變窄甚至消失，肝細(xì)胞變性、水腫得到不同程度的改善。詳見圖1。

2.4 ?各組大鼠肝組織AFP、ALB、CK18 mRNA的表達(dá)情況

與A組比較，B組AFP、ALB、CK18 mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.05）。與B組比較，C組、D組、E組AFP、ALB、CK18 mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.05）。與E組比較，C組、D組AFP、ALB、CK18 mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.05）。詳見表3。

2.5 ?各組大鼠肝組織中HGF、EGF蛋白的表達(dá)情況

與A組比較，B組HGF、EGF蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05）。與B組比較，C組、D組、E組HGF、EGF蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05）。與E組比較，C組、D組HGF、EGF蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05）。詳見圖2、表4。

2.6 ?各組大鼠肝組織BMMSC歸巢情況

E組肝臟內(nèi)攜帶綠色熒光蛋白數(shù)量明顯高于A組、D組。詳見圖3。

3 討論

目前，我國乙型肝炎病毒感染人數(shù)已經(jīng)居世界首位，每年有近50萬人死于乙型肝炎病毒相關(guān)性疾病，如肝硬化甚至肝癌，其中50%為肝硬化及其相關(guān)并發(fā)癥所致，致死率極高[13]。原位肝移植雖是終末期肝病較為理想的治療方法，但因肝臟供體的緊缺、嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng)及高昂的醫(yī)療費(fèi)用，接受肝移植的患者相對較少。BMMSC是一種多功能干細(xì)胞，來源充足，易于獲取，經(jīng)多次傳代具有穩(wěn)定的生物活性，故為理想的組織工程種子細(xì)胞，不僅可以在體內(nèi)分化為正常的肝細(xì)胞及膽管上皮細(xì)胞，還可以通過分泌多種促進(jìn)肝臟的生長因子，逆轉(zhuǎn)肝纖維化過程[14-15]。而CCl4誘導(dǎo)建立的肝纖維化模型在形態(tài)學(xué)、病理生理學(xué)等方面與人肝纖維化相似，已廣泛應(yīng)用于研究組織病理及相關(guān)藥物抗纖維化的藥效評價(jià)[16]。

BMMSC誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞可解決肝細(xì)胞的來源問題，為各種肝病治療提供了可能。HGF、EGF、轉(zhuǎn)化生長因子-β1、白介素-10、胰島素、去甲腎上腺素等在肝細(xì)胞再生過程中起重要作用[17-20]。其中，HGF主要在肝臟庫普弗細(xì)胞與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中產(chǎn)生，HGF對肝細(xì)胞有促進(jìn)有絲分裂作用[21]。HGF是作用于肝臟發(fā)育及肝再生的過程中最基本的細(xì)胞因子，參與胚肝發(fā)育及肝臟的發(fā)生、發(fā)展及肝再生的過程[22-24]。因此，HGF是體外誘導(dǎo)BMMSC向肝細(xì)胞方向分化的關(guān)鍵性細(xì)胞因子。EGF是表皮上生長家族的重要調(diào)節(jié)因子之一，是一種促有絲分裂因子，能促進(jìn)BMMSC增殖、分化。AWAN等[25]研究證實(shí)采用EGF治療慢性乙型病毒性肝炎患者，可顯著改善肝功能，刺激肝細(xì)胞DNA進(jìn)一步有效合成，促進(jìn)肝細(xì)胞再生。日本學(xué)者早在2000年通過RT-PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)新鮮分離的大鼠骨髓細(xì)胞中存在表達(dá)AFP的細(xì)胞[26]。經(jīng)不同濃度的HGF體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，可檢測到表達(dá)ALB、AFP mRNA的肝細(xì)胞樣細(xì)胞[27]。本研究中，壯肝逐瘀煎、BMMSC及兩者聯(lián)合干預(yù)大鼠肝纖維化，結(jié)果顯示3種方法肝組織中HGF、EGF均較B組明顯升高，3種方法大鼠的肝功能較B組明顯改善，且兩者聯(lián)合效果最為顯著。

王振常教授認(rèn)為濕熱瘀毒殘留難盡是肝炎肝纖維化或者肝硬化的啟動因子和持續(xù)因子，是其基本病機(jī)[28]。濕熱瘀毒所引起的人體各臟腑功能失調(diào)、氣血陰陽失和、肝脾失調(diào)、三焦氣化不利是生痰瘀之本，痰瘀阻絡(luò)，絡(luò)脈不通反過來影響氣道的通暢。所以王教授主張治療肝纖維化、肝硬化當(dāng)以壯肝逐瘀為要，壯肝即是扶正，該方通過扶助正氣為主，以達(dá)到“正氣尚存，邪不可干”的功效，逐瘀即是祛邪，主要以清熱化濕解毒、活血化瘀為主要功效，濕、熱、瘀、毒得化，則氣機(jī)升降可恢復(fù)，氣、血、津、液則運(yùn)行無暢，肝腎功能得以恢復(fù)?！罢龤獾贸洌皻獾萌ァ?，全方共奏“壯肝逐瘀”之效。用壯醫(yī)藥特色理論詮釋其方意，以生黃芪為主藥，補(bǔ)后天脾氣，又兼補(bǔ)肺健脾以通“氣道”，利水托邪毒外出，振奮后天中州脾土之氣，有“鼓舞脾臟之氣顧護(hù)中州，防止肝之邪毒向脾臟傳變”之意；以薏苡仁、澤蘭、虎杖為公藥，利水滲濕、散瘀止痛解毒以通調(diào)“水道”；黃精、枸杞子、生牡蠣、鱉甲為母藥，補(bǔ)氣養(yǎng)陰、滋補(bǔ)肝腎、益陰潛陽、軟堅(jiān)散結(jié)；雞內(nèi)金、橘紅共為幫藥，行氣消食健脾，兼補(bǔ)脾腎之精，通調(diào)“谷道”；大棗調(diào)和諸藥。諸藥合用，共奏攻毒補(bǔ)虛、壯肝逐瘀之效。壯肝即是恢復(fù)正氣，養(yǎng)肝陰、促進(jìn)肝組織氣血津液的恢復(fù)，保證BMMSC的歸巢、增殖、分化、再生、修復(fù)的功能。逐瘀即是活血化瘀，保證了氣血津液的暢通，達(dá)到“血和則經(jīng)脈通行”，為BMMSC在血液及肝臟中提供良好的運(yùn)行環(huán)境。行血是通過調(diào)整血脈的暢通，保障BMMSC在歸巢肝臟時(shí)暢利通行。祛瘀是通過解除肝臟組織血液運(yùn)行不暢、改善受損組織血液的瘀滯狀態(tài)，從而改善BMMSC遷移至肝臟的病理環(huán)境。

綜上所述，壯肝逐瘀煎聯(lián)合BMMSC移植能協(xié)同發(fā)揮作用，一方面發(fā)揮了改善肝纖維化的作用，另一方面通過壯肝逐瘀促進(jìn)BMMSC向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、促進(jìn)BMMSC歸巢于肝臟，共同發(fā)揮抗肝纖維化的作用，促進(jìn)肝臟迅速恢復(fù)。

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〔收稿日期〕2022-09-27

〔基金項(xiàng)目〕國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（81960910，81660745，81360598）。

〔第一作者〕羅藝徽，女，碩士，高級講師，研究方向：中醫(yī)藥防治脾胃肝病臨床教育與實(shí)驗(yàn)研究。

〔通信作者〕*王振常，男，教授，碩士，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：Wangzhenchang924@163.com。