黃淑敏 廖曉倩 范星宇 王梓儀 胡思遠(yuǎn) 胡志希

〔摘要〕 目的 構(gòu)建異丙腎上腺素（isoprenaline， ISO）誘導(dǎo)的慢性心力衰竭（chronic heart failure， CHF）大鼠模型，運(yùn)用以方測(cè)證法反推其中醫(yī)證型。方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將SD大鼠分為正常組及ISO低、中、高劑量組。制備CHF大鼠模型，將成模大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組：模型組、參附組、丹紅組、參麥組、黃芪組、普萘組。分別于造模結(jié)束后、給藥15 d后，檢測(cè)各組大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)及左心室質(zhì)量指數(shù)；超聲心電圖檢測(cè)各組大鼠心功能；ELISA法檢測(cè)大鼠氨基末端腦鈉肽前體（N-terminal pro brain natriuretic peptide， NT-pro BNP）；HE及Masson 染色方法觀察大鼠心臟組織病理形態(tài)以及纖維化狀態(tài)改變。結(jié)果 不同劑量ISO誘導(dǎo)CHF大鼠模型的制備：與正常組比較，ISO低劑量組各方面均無(wú)明顯改變；ISO中、高劑量組大鼠左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular fraction shortening， LVEF）、左室短軸縮短率（left ventricular fraction shortening， LVFS）、體質(zhì)量降低（P＜0.01），左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular internal dimension diamete， LVIDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular internal systolic dimension， LVISD）、NT-pro BNP、心臟質(zhì)量指數(shù)、左心室質(zhì)量指數(shù)明顯升高（P＜0.01），但I(xiàn)SO高劑量組死亡率低、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化程度更高?；凇耙苑綔y(cè)證”理論探討ISO誘導(dǎo)CHF大鼠中醫(yī)證型：與模型組比較，參附組LVEF、LVFS、體質(zhì)量升高，LVIDD、LVISD、NT-pro BNP、心臟質(zhì)量指數(shù)及左心室質(zhì)量指數(shù)降低（P＜0.05，或P＜0.01）；纖維結(jié)締組織增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，膠原纖維沉積減輕，僅見(jiàn)少量膠原纖維。其余組各項(xiàng)指標(biāo)均有改善，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 ISO中、高劑量均能制備CHF大鼠模型，但I(xiàn)SO高劑量更優(yōu)。ISO誘導(dǎo)CHF大鼠模型可能屬于心陽(yáng)虛證。

〔關(guān)鍵詞〕 以方測(cè)證；慢性心力衰竭；異丙腎上腺素；動(dòng)物模型；大鼠；證型

〔中圖分類號(hào)〕R256.2 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.03.002

Preparation of a rat model of chronic heart failure induced by isoprenaline based on

"inferring pattern by the formula" and its pattern types

HUANG Shumin1，2， LIAO Xiaoqian1， FAN Xingyu1， WANG Ziyi1， HU Siyuan1*， HU Zhixi1*

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The Second People's Hospital Affiliated to

Fujian University of Chinese Medicine， Fuzhou， Fujian 350003， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To construct a rat model of chronic heart failure （chronic heart failure， CHF） induced by isoprenaline （ISO） and to infer its TCM pattern types based on "inferring pathogenesis by the formula". Methods SD rats were randomly divided into normal group and low-， medium-， and high-dose ISO groups. The prepared CHF rat models were divided into six groups with the random number table method： model group， Shenfu group， Danhong group， Shenmai group， Huangqi group， and propranolol group. The cardiac mass index and left ventricular mass index of each group were respectively detected after modeling， and 15 d after administration. Echocardiogram was used to detect the cardiac function in each group; ELISA was adopted to detect N-terminal pro brain natriuretic peptide （NT-pro BNP）; HE and Masson staining were used to observe the histopathological morphology and fibrotic state of rat hearts. Results Preparation of ISO-induced CHF rat models with different doses： Compared with the normal ISO group， there was no significant changes in all aspects of the low-dose ISO group. In medium- and high-dose ISO dosage group， there was decrease in left ventricular fraction shortening （LVEF）， left ventricular fraction shortening （LVFS）， and body mass （P<0.01）. However， there was significant higher left ventricular end-diastolic internal dimension diameter （LVIDD）， left ventricular internal systolic dimension （LVISD）， NT-pro BNP， cardiac mass index， and left ventricular mass index （P<0.01）. The high-dose ISO group had lower mortality， but higher inflammatory cell infiltration and higher degree of fibrosis. TCM pattern type analysis of CHF rats induced by ISO based on "inferring pathogenesis by the formula"： Compared with model group， the LVEF， LVFS， and body mass of the Shenfu group increased， and the LVIDD， LVISD， NT-pro BNP， cardiac mass index and left ventricular mass index decreased （P<0.05， or P<0.01）; fibrous connective tissue hyperplasia and inflammatory cell infiltration were significantly reduced; collagen fiber deposition decreased， and only a small amount of collagen fibers was seen. All the remaining groups showed improvement without statistically significance （P>0.05）. Conclusion Both medium- and high-dose ISO can be used to prepare CHF rat model， but high-dose ISO can do better. The CHF rats induced by ISO may be categorized into the heart yang deficiency pattern.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 inferring patterns by the formula; chronic heart failure; isoprenaline; animal models; rats; pattern types

慢性心力衰竭（chronic heart failure， CHF）是由于多種原因?qū)е滦呐K結(jié)構(gòu)和（或）功能的異常改變，心室收縮或舒張功能不全的臨床綜合征，是一種嚴(yán)重的心臟疾病，發(fā)病率與病程、年齡相關(guān)且有地區(qū)差異[1-4]。CHF動(dòng)物模型的建立可以很好地模擬人類CHF的病理過(guò)程，為CHF的診治提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)?！耙苑綔y(cè)證”是在中醫(yī)辨證論治的原則下，依據(jù)“有是證，用是方”的對(duì)應(yīng)關(guān)系而提出的，是中醫(yī)學(xué)認(rèn)識(shí)疾病辨別證候的研究方法之一，被廣泛運(yùn)用在病證結(jié)合動(dòng)物模型的研究中。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CHF動(dòng)物模型存在證型的差異且與造模方法有關(guān)[5-8]，通過(guò)“以方測(cè)證”法可對(duì)不同造模方法建立的CHF動(dòng)物模型的中醫(yī)證型進(jìn)行有效辨析。

異丙腎上腺素（isoprenaline， ISO）誘導(dǎo)CHF大鼠模型有操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，是CHF研究的理想動(dòng)物模型之一，但由于不同批動(dòng)物、藥物及給藥途徑的不同，模型的復(fù)制成功率也不同[9-10]。本研究通過(guò)對(duì)不同劑量ISO制備CHF大鼠的心功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，再基于“方證對(duì)應(yīng)”理論，分析參麥注射液（益氣養(yǎng)陰）、參附注射液（益氣溫陽(yáng)）、黃芪注射液（益氣養(yǎng)元）和丹紅注射液（活血化瘀）4種中藥注射液干預(yù)后的療效反應(yīng)，探討ISO誘導(dǎo)的CHF大鼠可能出現(xiàn)的中醫(yī)證型，為構(gòu)建CHF病證結(jié)合動(dòng)物模型奠定基礎(chǔ)，為臨床辨證分型提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 ?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠106只，體質(zhì)量（180±20） g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（湘）2019-0004，動(dòng)物合格證號(hào)：4307272111030871，在湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)。研究方案經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)LLBH-202105180001。

1.2 ?藥物

鹽酸ISO（MedChemExpress，批號(hào)：HY-B0468/CS-2582）；參附注射液（華潤(rùn)三九雅安藥業(yè)有限公司，批號(hào)：201106AK05），丹紅注射液（山東丹紅制藥有限公司，批號(hào)：21032003），參麥注射液（正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號(hào)：2012108），黃芪注射液（正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號(hào)：2001081），普萘洛爾（山西云鵬制藥有限公司，批號(hào)：D191101）；烏拉坦（阿拉丁試劑有限公司，批號(hào)：U299635-100）。

1.3 ?試劑

氨基末端腦鈉肽前體（N-terminal pro brain natriuretic peptide， NT-pro BNP）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，批號(hào)：G28032936、I15035213）；石蠟（Sigma）、中性樹(shù)膠（Sigma）；蘇木素（Wellbio）、PBS（7.2-7.6）（Wellbio）、伊紅（Wellbio）、Masson染色試劑盒（Wellbio）。

1.4 ?儀器

便攜式小動(dòng)物超聲（北京益仁恒業(yè)科技有限公司，型號(hào)：6 LAB）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司，型號(hào)：H1650R）；全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，型號(hào)：PW-812）；多功能酶標(biāo)分析儀（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，型號(hào)：MB-530）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司，型號(hào)：DHP-500）；切片機(jī)（浙江金華益迪試驗(yàn)器材，型號(hào)：YD-315）；包埋機(jī)（常州中威電子儀器，型號(hào)：BMJ-A）。

1.5 ?造模方法和模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

采用ISO注射制備CHF大鼠模型[9]。CHF大鼠成模標(biāo)準(zhǔn)：超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心功能及ELISA檢查大鼠血清NT-pro BNP的水平，與正常組大鼠比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則確認(rèn)CHF大鼠模型制備成功[11]。

1.6 ?分組與給藥

1.6.1 ?不同劑量ISO誘導(dǎo)CHF大鼠模型的制備 ?依據(jù)文獻(xiàn)中提及較常用的ISO誘導(dǎo)大鼠CHF方案[9]，選擇了3種劑量造模方案。采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只SD大鼠隨機(jī)分為正常組及ISO低、中、高劑量4組。詳見(jiàn)表1。

1.6.2 ?ISO誘導(dǎo)CHF大鼠中醫(yī)證型的研究 ?采用隨機(jī)數(shù)字表法將66只大鼠隨機(jī)選6只作為正常組。剩余60只將大鼠依據(jù)前期實(shí)驗(yàn)（不同劑量ISO誘導(dǎo)CHF大鼠模型的制備）得到的最終結(jié)果（5 mg/kg×7 d后適應(yīng)性喂養(yǎng)14 d），制備ISO CHF大鼠模型。21 d后經(jīng)眼眶取血檢測(cè)NT-pro BNP、超聲心動(dòng)圖等確認(rèn)CHF成模，最終死亡18只，未成模6只，成功造模36只，隨機(jī)分為6組。通過(guò)換算人與動(dòng)物等效劑量[14]，確定給藥方式（詳見(jiàn)表2）。因研究選用的中藥注射液不宜久用，參照本課題組前期給藥方法，確定給藥時(shí)間15 d[5-7]。

1.7 ?觀察指標(biāo)與方法

1.7.1 ?心功能檢測(cè) ?將大鼠用烏拉坦（20%，6.5 mL/kg）腹腔注射麻醉后，應(yīng)用小動(dòng)物超聲系統(tǒng)，測(cè)量左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular internal dimension diamete， LVIDD）、收縮末期內(nèi)徑（left ventricular internal systolic dimension， LVISD）、左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular fraction shortening， LVEF）、及左室短軸縮短率（left ventricular fraction shortening， LVFS）。

1.7.2 ?ELISA測(cè)定血清NT-pro BNP水平 ?大鼠采用烏拉坦麻醉后，腹主動(dòng)脈采血5 mL，離心機(jī)以3000 r/min運(yùn)行15 min后（離心半徑為17.8 cm），保留上清液，運(yùn)用ELISA法測(cè)定NT-pro BNP含量。嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作。

1.7.3 ?大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)及左心室質(zhì)量指數(shù)測(cè)定 ?大鼠稱取體質(zhì)量，腹主動(dòng)脈取血后迅速解剖心臟組織，用生理鹽水洗去殘留血液，濾紙吸干后稱量全心濕重量，沿冠狀溝走行分離左心室并稱量，計(jì)算心臟質(zhì)量指數(shù)和左心室質(zhì)量指數(shù)。

1.7.4 ?病理組織學(xué)觀察 ?大鼠腹主動(dòng)脈取血后迅速解剖心臟組織，洗去殘留血液，切取心尖組織，放置于4%多聚甲醛固定，行常規(guī)HE染色和 Masson染色。

1.8 ?統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以“ｘ±s”表示。組間比較用單因素方差分析，若方差齊采用LSD法，方差不齊采用Games-Howell法，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用GraphPad Prism 8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 ?不同劑量ISO誘導(dǎo)CHF大鼠模型的制備

2.1.1 ?大鼠一般情況和存活率

2.1.1.1 ?一般情況 ?ISO中、高劑量組大鼠在注射ISO后出現(xiàn)活躍、興奮，呼吸加快，飲水量增多的表現(xiàn)。造模結(jié)束后ISO中、高劑量組大鼠出現(xiàn)毛色發(fā)黃，活動(dòng)量減少，不欲飲食，體質(zhì)量增加緩慢，小便量增多的表現(xiàn)，ISO高劑量組部分大鼠出現(xiàn)腹水、便溏及不耐運(yùn)動(dòng)等表現(xiàn)。

2.1.1.2 ?存活率 ?ISO低劑量組無(wú)死亡，存活率100%；ISO中劑量組分別于第1天、第9天、第12天各死亡1只大鼠，存活率70%；ISO高劑量組分別于第1天、第3天各死亡1只大鼠，存活率80%。在本次研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠死亡主要發(fā)生于ISO注射后30 min，考慮原因?yàn)椋篒SO為β1受體激動(dòng)劑，可使心肌、血管強(qiáng)烈收縮，導(dǎo)致心功能障礙，易引起惡性心律失常或急性心肌梗死。

2.1.2 ?大鼠超聲心動(dòng)圖分析 ?造模結(jié)束后，與正常組比較，ISO中、高劑量組大鼠LVEF、LVFS顯著下降（P<0.01），LVIDD與LVISD明顯上升（P<0.01）；ISO低劑量組LVIDD與LVISD有所上升（P<0.01），但LVEF、LVFS無(wú)明顯變化（P＞0.05）。詳見(jiàn)圖1—2。

2.1.3 ?血清NT-pro BNP表達(dá) ?造模結(jié)束后，與正常組比較，ISO中、高劑量組大鼠血清NT-pro BNP顯著上升（P<0.01）；ISO低劑量組無(wú)明顯變化（P＞0.05）。詳見(jiàn)表3。

2.1.4 ?大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)及左心室質(zhì)量指數(shù)分析 ?造模結(jié)束后，與正常組比較，ISO中、高劑量組大鼠體質(zhì)量下降，心臟質(zhì)量指數(shù)及左心室質(zhì)量指數(shù)升高（P<0.01）；ISO低劑量組體質(zhì)量、心臟質(zhì)量指數(shù)及左心室質(zhì)量指數(shù)無(wú)明顯變化（P＞0.05）。詳見(jiàn)表4。

2.1.5 ?心肌組織病理檢測(cè) ?HE病理檢查提示：與正常組比較，ISO高劑量組大鼠心肌細(xì)胞體積縮小，結(jié)構(gòu)模糊，間質(zhì)可見(jiàn)明顯纖維結(jié)締組織增生并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；ISO中劑量組出現(xiàn)部分纖維結(jié)締組織增生并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，程度較輕；ISO低劑量組無(wú)明顯改變。詳見(jiàn)圖3。

Masson檢查提示：與正常組比較，ISO高劑量組大鼠心肌細(xì)胞中有大量的膠原蛋白沉積，心肌纖維化程度較重；ISO中劑量組出現(xiàn)部分膠原纖維沉積，心肌纖維化程度較ISO高劑量組輕；ISO低劑量組出現(xiàn)少量膠原纖維沉積，心肌纖維化程度最輕。詳見(jiàn)圖4。

2.2 ?ISO誘導(dǎo)CHF大鼠中醫(yī)證型的研究

2.2.1 ?大鼠存活率情況 ?造模期間第1天死亡8只大鼠，第2天死亡5只大鼠，第3天死亡3只大鼠，第4天、第5天各死亡1只大鼠，共計(jì)死亡18只大鼠，存活率70.0%。成模后大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，經(jīng)藥物干預(yù)15 d后，各組大鼠均無(wú)死亡。

2.2.2 ?大鼠超聲心動(dòng)圖分析 ?藥物干預(yù)結(jié)束后，與正常組比較，模型組大鼠LVEF、LVFS顯著下降（P<0.01），LVIDD與LVISD明顯上升（P<0.01）；與模型組比較，參附組大鼠LVEF、LVFS上升，LVIDD、LVISD下降，普萘組LVEF、LVFS上升，LVISD下降（P<0.05，P<0.01），其余各組心功能指數(shù)無(wú)明顯變化（P＞0.05）。詳見(jiàn)圖5—6。

2.2.3 ?血清NT-pro BNP表達(dá) ?藥物干預(yù)結(jié)束后，與正常組比較，模型組大鼠血清NT-pro BNP顯著上升（P<0.01）；與模型組比較，參附組NT-pro BNP顯著下降（P<0.01），參麥組輕微上升，黃芪組、丹紅組、普萘組有所下降，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見(jiàn)表5。

2.2.4 ?大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)及左心室質(zhì)量指數(shù)分析 ?藥物干預(yù)結(jié)束后，與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量下降，心臟質(zhì)量指數(shù)及左心室質(zhì)量指數(shù)增大（P<0.01）；與模型組比較，參附組及普萘組體質(zhì)量上升（P<0.01），參附組心臟質(zhì)量指數(shù)及左心室質(zhì)量指數(shù)降低（P<0.01或P<0.05）；其余各組體質(zhì)量、心臟質(zhì)量指數(shù)及左心室質(zhì)量指數(shù)有改善但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。詳見(jiàn)表6。

2.2.5 ?心肌組織病理觀察 ?藥物干預(yù)結(jié)束后，HE病理檢查提示：正常組心肌細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)變性、壞死及間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)明顯纖維組織增生；與正常組相比，模型組大鼠心肌細(xì)胞體積縮小，結(jié)構(gòu)模糊，間質(zhì)可見(jiàn)明顯纖維結(jié)締組織增生并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；參附組的間質(zhì)纖維結(jié)締組織增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)相比模型組明顯減少，普萘組、丹紅組、參麥組、黃芪組仍有較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)纖維結(jié)締組織增生明顯。詳見(jiàn)圖7。

Masson染色檢測(cè)提示：正常組的心肌組織中未見(jiàn)明顯膠原蛋白沉積，與正常組相比，模型組心肌組織中有大量的膠原蛋白沉積，心肌纖維化程度較重；與模型組相比，參附組心肌組織中的膠原蛋白明顯減少，纖維化程度明顯減輕，普萘組、丹紅組、參麥組、黃芪組仍有較多膠原沉積。詳見(jiàn)圖8。

3 討論

CHF是各種心臟疾病的最終階段，動(dòng)物模型是基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的重要組成部分，能夠很好地為科研工作服務(wù)，促進(jìn)該疾病相關(guān)機(jī)制及藥物防治研究的發(fā)展，其中，最常見(jiàn)的動(dòng)物是大鼠、小鼠[15]?，F(xiàn)階段大部分疾病在中醫(yī)研究中缺乏公認(rèn)的病證結(jié)合動(dòng)物模型制備方法，因此，疾病的證候本質(zhì)研究受到阻礙。故當(dāng)前建立符合中西醫(yī)特點(diǎn)的病證結(jié)合動(dòng)物模型是本團(tuán)隊(duì)努力的方向。

通過(guò)皮下多點(diǎn)注射ISO可誘導(dǎo)心臟抑制型CHF大鼠模型的建立[16]。ISO是β受體激動(dòng)劑，可使心率加快，心肌收縮力增強(qiáng)，心肌耗氧量增加，從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞壞死、纖維化，使心臟負(fù)荷增加，導(dǎo)致CHF發(fā)生。此方法具有操作簡(jiǎn)單，模型穩(wěn)定性、重復(fù)性高，能較好地反映CHF的病理發(fā)展過(guò)程，與臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)吻合度較高的優(yōu)點(diǎn)[15]。但其仍然存在問(wèn)題：不同批次、類型的模型動(dòng)物對(duì)于ISO的耐受不同，不同廠家批號(hào)的ISO也對(duì)造模結(jié)果有影響。目前，ISO誘導(dǎo)制備CHF大鼠模型的劑量尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)參考文獻(xiàn)[12，17-18]，本研究分別選擇3種不同劑量ISO制備CHF大鼠模型，以期選擇出最佳造模劑量。在CHF動(dòng)物模型評(píng)價(jià)中，LVIDD、LVISD、LVEF、LVFS及血清NT-pro BNP是評(píng)價(jià)和衡量CHF模型是否制備成功的重要指標(biāo)[9]。研究顯示，干預(yù)結(jié)束后ISO低劑量組大鼠無(wú)死亡，ISO中劑量組大鼠死亡率最高，考慮原因可能為ISO長(zhǎng)期使用相較于短期大劑量使用更容易引起大鼠惡性心律失常。超聲心動(dòng)圖提示：ISO中、高劑量組大鼠LVEF、LVFS均下降，LVIDD、LVISD增加，ISO低劑量組LVIDD、LVISD增加，但LVEF、LVFS與正常組比較無(wú)意義，考慮與心臟功能處于代償期有關(guān)。血清NT-pro BNP提示：隨著ISO劑量增加，各組大鼠血清NT-pro BNP水平逐漸上升。病理染色提示：ISO高劑量組出現(xiàn)明顯纖維結(jié)締組織增生并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌纖維化程度最重。綜上所述，本次研究發(fā)現(xiàn)ISO中、高劑量組均能成功誘導(dǎo)CHF大鼠模型，但I(xiàn)SO高劑量組死亡率較低，病理檢測(cè)效果最為理想，故ISO誘導(dǎo)CHF大鼠模型最優(yōu)方法為：5 mg/kg×7 d后適應(yīng)性喂養(yǎng)14 d。

“以方測(cè)證”是中醫(yī)辨證論治的常用方法，是中醫(yī)認(rèn)識(shí)疾病的一種手段，更是中醫(yī)方證現(xiàn)代研究的重要邏輯依據(jù)。其主要原理為依據(jù)藥物構(gòu)成的屬性及功效來(lái)觀察服用該方劑后的反應(yīng)，從而反向推測(cè)其中醫(yī)證型，現(xiàn)已在中醫(yī)證本質(zhì)及病證結(jié)合動(dòng)物模型的研究中廣泛應(yīng)用[19-20]。課題組前期運(yùn)用“以方測(cè)證”法對(duì)不同造模方法誘導(dǎo)CHF大鼠的中醫(yī)證型進(jìn)行了推測(cè)，成功對(duì)3種經(jīng)典CHF大鼠模型的中醫(yī)證型及其證候的生物學(xué)基礎(chǔ)進(jìn)行了研究。本研究也采用“以方測(cè)證”的方法，成功運(yùn)用ISO誘導(dǎo)復(fù)制了CHF大鼠模型，并在課題組前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良：（1）依據(jù)《慢性心力衰竭中西醫(yī)結(jié)合診療專家共識(shí)》[21]。CHF本以氣虛為主，標(biāo)以血瘀為主，隨著病情逐漸發(fā)展可兼有陽(yáng)虛和陰虛，故在方藥選擇上選用益氣、溫陽(yáng)、養(yǎng)陰、活血四類代表方劑；（2）選用中藥注射液。中藥注射劑具有藥力專、藥性穩(wěn)定、療效明確的優(yōu)點(diǎn)，可避免傳統(tǒng)湯劑因中藥劑量、質(zhì)量、炮制、熬制等差別而引發(fā)的誤差。（3）結(jié)合現(xiàn)代生物學(xué)指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證。

在本次研究中，藥物分別選用黃芪注射液、參附注射液、參麥注射液和丹紅注射液。從藥物組成來(lái)看，黃芪注射液由黃芪提取而成，主要功效為益氣養(yǎng)元，養(yǎng)心通脈；參附注射液由人參、附子提取而成，主要功效為回陽(yáng)救逆、益氣固脫；參麥注射液由人參和麥冬提取而成，主要功效為益氣固脫、養(yǎng)陰生津；丹紅注射液由丹參、紅花提取而成，主要功效為活血化瘀。4種注射液臨床上均廣泛用于治療心力衰竭、冠心病、心絞痛等疾病。本研究中黃芪注射液對(duì)應(yīng)心氣虛證，參附注射液對(duì)應(yīng)心陽(yáng)虛證，參麥注射液對(duì)應(yīng)心氣陰兩虛證，丹紅注射液對(duì)應(yīng)心血瘀阻證。依據(jù)《慢性心力衰竭中西醫(yī)結(jié)合診療專家共識(shí)》中提及這4種證型是CHF的基本證型，故對(duì)比觀察這4種中藥注射液改善心功能的作用效果，可明確CHF大鼠的基本中醫(yī)證候。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)4種中藥注射液干預(yù)后，參附組能有效改善大鼠超聲心動(dòng)圖的各項(xiàng)指標(biāo)，恢復(fù)心肌組織病變，改善心臟及左心室質(zhì)量指數(shù)，降低血清NT-pro BNP水平，其他3組注射液療效無(wú)明顯改變。由此，本研究證實(shí)益氣、養(yǎng)陰、活血法對(duì)ISO誘導(dǎo)的CHF模型大鼠無(wú)明顯改善作用，溫陽(yáng)法則表現(xiàn)出較好療效。

4 結(jié)論

以ISO（5 mg/kg）皮下注射7 d后適應(yīng)性喂養(yǎng)14 d制備CHF大鼠模型效果最為理想。依據(jù)“以方測(cè)證”理論，本團(tuán)隊(duì)推測(cè)：ISO誘導(dǎo)CHF大鼠模型可能屬于心陽(yáng)虛證。

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〔收稿日期〕2022-11-17

〔基金項(xiàng)目〕國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（82274412）；湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2020JJ4062，2020JJ5408）；廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)項(xiàng)目（2020B1111100001）；湖南省教育廳項(xiàng)目（21A0230，21B0361）；湖南省學(xué)位與研究生教育教改項(xiàng)目（2020JGZX012）；湖南省教育改革課題（HNJG-2021-0594）；湖南省研究生培養(yǎng)創(chuàng)新基地（2019-45）；湖南省學(xué)位辦研究生導(dǎo)師團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2019-111）；湖南省學(xué)位辦中醫(yī)診斷研究生案例庫(kù)建設(shè)項(xiàng)目。

〔第一作者〕黃淑敏，女，博士，研究方向：心血管疾病本質(zhì)與生物學(xué)基礎(chǔ)研究。

〔通信作者〕*胡志希，男，醫(yī)學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：515800272@qq.com；胡思遠(yuǎn)，男，博士，講師，E-mail：6484808@qq.com。