朱智顯 張小琴 蔡虎志 別明珂 曾昭文 歐陽過 陳新宇

〔摘要〕 目的 分析天牛止眩膠囊對自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織lncRNA MEG3/miR-21/PTEN信號通路的影響及作用機制。方法 選取10只7周齡大鼠為正常對照組，隨機將30只7周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠分為模型對照組、天牛止眩組及依那普利組，每組10只，予以相應(yīng)藥物或蒸餾水灌胃8周。每周固定時間測量大鼠收縮壓，直至第8周末處死大鼠，稱量左心室質(zhì)量（left ventricular mass， LVM），計算左心室質(zhì)量指數(shù)（left ventricular mass index， LVMI），采用實時熒光定量PCR法檢測心肌組織lncRNA MEG3、miR-21基因的表達水平，Western blot檢測PTEN蛋白的表達水平。結(jié)果 治療結(jié)束后，與正常對照組比較，模型對照組收縮壓、LVM、LVMI和miR-21基因表達均升高（P＜0.05，P＜0.01），lncRNA MEG3基因、PTEN蛋白表達均降低（P＜0.01）；與模型對照組比較，天牛止眩組和依那普利組收縮壓、LVM、LVMI和miR-21基因表達均降低（P<0.01），lncRNA MEG3基因、PTEN蛋白表達均升高（P<0.01）；與依那普利組比較，天牛止眩組lncRNA MEG3基因、PTEN蛋白表達均升高（P<0.01），miR-21基因表達降低（P<0.01）。結(jié)論 天牛止眩膠囊能上調(diào)大鼠心肌組織lncRNA MEG3表達，使miR-21表達下降，進而升高PTEN蛋白水平，這可能是該藥降低血壓及減輕靶器官損傷重要機制之一。

〔關(guān)鍵詞〕 高血壓；左心室肥厚；天牛止眩膠囊；lncRNA MEG3；miR-21；PTEN

〔中圖分類號〕R256.29 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.03.011

Effects of Tianniu Zhixuan Capsule on left ventricular hypertrophy induced by PTEN

regulated by lncRNA MEG3/miR-21 in spontaneously hypertensive rats

ZHU Zhixian， ZHANG Xiaoqin， CAI Huzhi， BIE Mingke， ZENG Zhaowen， OUYANG Guo， CHEN Xinyu*

The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To analyze the effects and mechanism of Tianniu Zhixuan Capsule （TNZXC） on the left ventricular hypertrophy induced by lncRNA MEG3/miR-21/PTEN in spontaneously hypertensive rats. Methods Ten rats aged 7 weeks were chosen as the normal control group， while 30 male spontaneously hypertensive rats were randomly divided into three groups （10 rats in each group）： model control group， TNZXC group， and enalapril group， among which the rats were infused with corresponding drugs or distilled water for 8 weeks. The systolic blood pressure of the rats was measured at a fixed time every week. At the end of 8th week， the rats were sacrificed， and the left ventricular mass （LVM） was weighed to calculate the left ventricular mass index （LVMI）. Then the expression of lncRNA MEG3 and miR-21 gene in myocardial tissue as well as PTEN protein expression were detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blot respectively. Results After treatment， compared with the normal control group， the systolic blood pressure， LVM， LVMI and miR-21 gene expression in the model control group increased （P<0.05， P<0.01）， while the expression of lncRNA MEG3 gene and PTEN protein was reduced （P<0.01）. Compared with the model control group， the systolic blood pressure， LVM， LVMI and miR-21 gene expression in the TNZXC and enalapril groups were reduced （P<0.01）， while the expression of lncRNA MEG3 gene and PTEN protein increased （P<0.01）. Compared with the enalapril group， the expression of ?lncRNA MEG3 gene and PTEN protein in the TNZXC group increased （P<0.01）， while the expression of miR-21 was reduced （P<0.01）. Conclusion TNZXC can up-regulate the expression of lncRNA MEG3 in myocardial tissue of rats， reducing the expression of miR-21to increase the level of PTEN protein in spontaneously hypertensive rats， which may be one of the most significant mechanisms of the drug to lower blood pressure and alleviate target organ damage.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 hypertension; left ventricular hypertrophy; Tianniu Zhixuan Capsule; lncRNA MEG3; miR-21; PTEN

原發(fā)性高血壓是常見的心血管病之一，是以體循環(huán)動脈血壓升高為主的一種心血管綜合征，患病率高，《中國心血管健康與疾病報告2019》顯示我國高血壓患病人數(shù)已達2.45億人[1]。長期血壓升高會導(dǎo)致一系列繼發(fā)性靶器官損害，其中，心臟是損傷最常見、最嚴重的靶器官之一，主要表現(xiàn)為左心室肥厚（left ventricular hypertrophy， LVH）[2-3]。LVH是心血管疾病發(fā)病和致死的獨立危險因素，給患者家庭和社會帶來了沉重的負擔(dān)，早期的診斷和治療尤為重要[4-7]。臨床常將降壓治療作為逆轉(zhuǎn)LVH的基礎(chǔ)，首選血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑在降壓的同時改善LVH[8]。近年來，越來越多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥在防治高血壓靶器官損害方面具有多靶點干預(yù)的優(yōu)勢，尤其是方便服用、依從性較高、易于質(zhì)控的中成藥。本實驗選用陳新宇教授自創(chuàng)的天牛止眩膠囊（原名血壓平膠囊）[9-11]，通過與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑類藥物依那普利對自發(fā)性高血壓大鼠血壓、左心室質(zhì)量（left ventricular mass， LVM）、左心室質(zhì)量指數(shù)（left ventricular mass index， LVMI）、lncRNA MEG3、miRNA-21、PTEN指標的影響作對比，探討天牛止眩膠囊治療高血壓及LVH的作用機制。

1 材料與方法

1.1 ?實驗動物

研究顯示，自發(fā)性高血壓大鼠出生后交感活性增高，血壓隨鼠齡不斷升高，4周齡時已出現(xiàn)心臟質(zhì)量增加，6周齡時血壓已開始明顯升高[12]，故本研究選用30只雄性7周齡自發(fā)性高血壓大鼠為研究對象，10只同品同系7周齡WKY大鼠為對照，兩者均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。動物合格許可證號：SCXK（京）2016-0006，動物倫理編號：HN-LL-LW-2022-033。動物實驗室：湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級實驗動物中心。飼養(yǎng)條件：自由飲食、12 h光照/12 h黑暗、背景噪聲（40±10） dB、溫度（20±2） ℃、濕度40%～60%。

1.2 ?主要藥物與試劑

天牛止眩膠囊（成分包括天麻、防己、酸棗仁、牛膝、菊花等，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，批號：201908）；馬來酸依那普利片（揚子江藥業(yè)集團江蘇制藥股份有限公司，批號：18061651）。

三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸、甲叉雙丙烯酰胺（美國Sigma公司，批號分別為V900483、V900144、0172）；總RNA抽提試劑（美國Thermo Fisher公司，批號：15596026）；過硫酸銨、吐溫-20、麗春紅均購自國藥集團上海有限公司（批號分別為10002618、30189328、71033942）；十二烷基硫酸鈉、乙二胺四乙酸均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司（批號分別為MB2479、MB2514）；四甲基乙二胺（上海阿拉丁試劑有限公司，批號：T105497）；丙烯酰胺、蛋白酶抑制劑均購自北京金泰宏達生物科技有限公司（批號分別為0341、583794）；脫脂奶粉、蛋白磷酸酶抑制劑、核酸染料均購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司（批號分別為P1622、P1260、PB11141）；RIPA裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0013B）；Super ECL Plus超敏發(fā)光液（美國Advansta公司，K-12045-D50）；顯影液、定影液均購自上海佳信物流有限公司（批號分別為BW-61、BW-62）；上樣緩沖液、mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DM2000 Plus DNA標記均購自北京康為世紀生物科技有限公司（批號分別為CW0610、CW2569、CW2141、CW0632）。

1.3 ?主要儀器

搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號：TS-1）；臺式冷凍離心機（湖南湘儀科教儀器有限公司，型號：H1650R）；熒光定量RCP儀（美國賽默飛世爾科技公司，型號：qubit4.0）；電泳儀、電泳槽、水平瓊脂糖電泳槽均購自北京六一生物科技有限公司（型號分別為DYY-6C、DYCZ-24DN、DYCZ-40D）；電子天平（美國雙杰公司，型號：JJ224BC）；生物樣品均質(zhì)儀（杭州奧盛儀器有限公司，型號：BioPrep-24）；智能無創(chuàng)血壓計（北京軟隆科技有限責(zé)任公司，型號：BP-2010A）等。

1.4 ?動物分組

適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，測量大鼠尾動脈血壓，連續(xù)3 d，取平均值作為大鼠基礎(chǔ)血壓。10只WKY大鼠設(shè)為正常對照組，30只自發(fā)性高血壓大鼠隨機分為依那普利組、天牛止眩組、模型對照組，每組10只。

1.5 ?給藥方法

參照《藥理實驗方法學(xué)》[13]，采用人鼠體表面積換算法，折合大鼠等效劑量（折算成人體質(zhì)量為60 kg），正常對照組、模型對照組每只以10 mL/kg蒸餾水灌胃，每天灌胃3次，共8周；天牛止眩組按照677 mg/（kg·d）給藥，用蒸餾水配制成濃度為22.6 mg/mL的天牛止眩膠囊藥物溶液，每只以10 mL/kg劑量灌胃，每天灌胃3次，共8周；依那普利組按照1.07 mg/（kg·d）給藥，用蒸餾水配制成濃度為0.11 mg/mL的依那普利藥物溶液，每只以10 mL/kg依那普利藥物溶液灌胃1次，10 mL/kg蒸餾水灌胃2次，共8周。

1.6 ?樣本采集及檢測

1.6.1 ?大鼠收縮壓測定 ?每周日清晨對大鼠常規(guī)測量體質(zhì)量之后再測量血壓。測量血壓時，保持室內(nèi)溫暖安靜，用鼠袋固定大鼠身體，同時暴露大鼠尾巴，并將尾動脈無創(chuàng)血壓測量儀的脈搏換能器和氣囊套一起套在尾根部，加熱使鼠尾血管擴張。將血壓測量儀與電腦連接，待電腦顯示波形平穩(wěn)時，按充氣按鈕，電腦會顯示規(guī)則且由低到高再到低的規(guī)則波形，直到完全放氣減壓后，讀出血壓值，連續(xù)測量3次后取平均值即為最終血壓值。

1.6.2 ?LVMI測定 ?8周后，對實驗大鼠常規(guī)稱量得到大鼠體質(zhì)量。麻醉起效后，打開胸腔、取出心臟，用眼科剪依次剪去左右心房、右心室游離壁及脂肪血管等多余組織，保留左心室及室間隔，充分沖洗后用濾紙吸干水分，天平秤稱取LVM，以LVW與體質(zhì)量（body mass， BW）之比計算LVMI（LVMI=LVW/BW），將心室組織切成小塊后放置在-80 ℃冰箱中保存，用于后續(xù)檢測。

1.6.3 ?實時熒光定量PCR法檢測心肌lncRNA MEG3及miR-21基因表達水平 ?配制0.1%焦碳酸二乙酯水，浸泡所有提取RNA需要的器材，浸泡結(jié)束后濕熱滅菌并烘干備用；Trizol提取組織總RNA，取5 μL提取RNA與上樣緩沖液混勻，并進行瓊脂糖凝膠電泳。RNA反轉(zhuǎn)錄以總mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成互補DNA，25 ℃反應(yīng)10 min，42 ℃反應(yīng)50 min，85 ℃反應(yīng)5 min。反應(yīng)結(jié)束后，取2 μL PCR產(chǎn)物稀釋50倍，作為qPCR的模板。qPCR反應(yīng)條件為：95 ℃反應(yīng)10 min，1個循環(huán)；95 ℃反應(yīng)15 s，60 ℃反應(yīng)30 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，導(dǎo)出各孔Ct值。GAPDH和5S作為內(nèi)參基因。采用2-ΔΔCt法進行組間miRNA和lncRNA表達的差異分析。引物設(shè)計詳見表1。

1.6.4 ?Western blot檢測心肌PTEN蛋白表達水平

剪取0.02 g組織充分沖洗后加入裂解液反復(fù)研磨心肌組織后置于冰上裂解10 min，離心后分裝備用；制膠、樣品準備、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯色。

1.7 ?統(tǒng)計學(xué)處理方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 21.0軟件，計量資料用“ｘ±s”表示，各組數(shù)據(jù)若滿足正態(tài)分布和方差齊時，組間比較采用方差分析，方差不齊則用秩和檢驗，同組比較采用成組t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?各組大鼠治療前后收縮壓的變化

治療前、4周后、6周后、8周后，與正常對照組比較，模型對照組收縮壓均升高（P＜0.01）。6周后、8周后，與模型對照組比較，天牛止眩組、依那普利組收縮壓均降低（P＜0.01）。詳見表2。

2.2 ?天牛止眩膠囊對自發(fā)性高血壓大鼠LVM、LVMI的影響

與正常對照組比較，模型對照組LVM、LVMI均升高（P＜0.05，P＜0.01）。與模型對照組比較，天牛止眩組、依那普利組LVM、LVMI均降低（P＜0.01）。天牛止眩組與依那普利組間LVM、LVMI比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表3。

2.3 ?各組大鼠心肌lncRNA MEG3、miR-21基因表達的情況

與正常對照組比較，模型對照組lncRNA MEG3基因表達降低（P＜0.01），miR-21基因表達升高（P＜0.01）。與模型對照組比較，天牛止眩組、依那普利組lncRNA MEG3基因表達均升高（P＜0.01），miR-21基因表達均降低（P＜0.01）。與依那普利組比較，天牛止眩組lncRNA MEG3基因表達升高（P＜0.01），miR-21基因表達降低（P＜0.01）。詳見表4。

2.4 ?各組大鼠心肌PTEN蛋白的表達情況

與正常對照組比較，模型對照組PTEN蛋白表達水平降低（P＜0.01）。與模型對照組比較，天牛止眩組、依那普利組PTEN蛋白表達水平均升高（P＜0.01）。與依那普利組比較，天牛止眩組PTEN蛋白表達水平升高（P＜0.01）。詳見表5、圖1。

3 討論

高血壓LVH是機體對長期增加的血液動力學(xué)負荷的一種適應(yīng)性改變，主要表現(xiàn)為心室壁的增厚，多因心肌細胞肥大和凋亡、心肌間質(zhì)增加、心肌纖維化、心肌重構(gòu)等引起[14-15]。其形成機制錯綜復(fù)雜，主要與血流動力學(xué)[16-17]、細胞因子[18]、神經(jīng)體液[19]、基因與遺傳[20]等因素相關(guān)，其中，基因與遺傳相關(guān)性越來越受到重視。特別是對非編碼RNA研究的不斷深入，越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)，曾經(jīng)被視為“無效基因”的lncRNA可以與其他RNA轉(zhuǎn)錄本競爭，作為競爭性內(nèi)源性RNA（competitive endogenous RNA， ceRNA）結(jié)合相同的miRNA，從而實現(xiàn)對多種生物學(xué)過程的調(diào)控[21-22]。研究表明，lncRNA MEG3可以作為一種ceRNA抑制miR-21的表達，調(diào)控細胞增殖和凋亡，從而達到抑制腫瘤增殖目的[23-25]。近年來，lncRNA MEG3在心臟發(fā)育及心血管疾病中的作用逐漸被揭示[26]。PICCOLI等[27]發(fā)現(xiàn)心肌成纖維細胞中l(wèi)ncRNA MEG3具有保護心臟、阻礙心肌肥厚的作用。UCHIDA[28]在此基礎(chǔ)上進一步研究發(fā)現(xiàn)，心肌lncRNA MEG3在延緩心室重構(gòu)中發(fā)揮重要作用。WU等[29]發(fā)現(xiàn)與正常人比較，心血管疾病患者體內(nèi)的lncRNA MEG3表達水平明顯下調(diào)，進一步研究證實，過表達MEG3通過抑制miR-21的表達，從而減少膠原蛋白聚集和抑制內(nèi)皮細胞增殖以保護心臟。

PTEN是1997年發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，PTEN能調(diào)控細胞的生長、分化、凋亡、增殖和遷移等過程[30-35]，其主要通過控制細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮生物學(xué)功能。具有磷酸酶活性的PTEN能抵抗磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase， PI3K）的作用，使3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇脫磷酸形成磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸，從而下調(diào)3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇水平。3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇能激活原癌基因產(chǎn)物絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（serine-theonine

kinase， Akt），從而參與細胞的生長和生存。PTEN/PI3K/Akt信號通路可調(diào)控心肌細胞生長、增殖、凋亡及血管再生等過程，故與心肌細胞功能調(diào)節(jié)密切相關(guān)[36]。PI3K/Akt信號通路的短暫激活，可調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子介導(dǎo)血管生成，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞遷移來減緩心臟功能障礙的速度，但Akt長期活化，會造成血管生成異常、心肌病理性肥大、心肌細胞增殖、心肌纖維化等[37]。PTEN是通過負性調(diào)控PI3K/Akt信號通路發(fā)揮保護心臟的作用，一方面能抑制Akt的活性而控制細胞的生長延緩心肌肥厚，一方面也可抑制心臟成纖維細胞的增殖和遷移，進而延緩心肌纖維化[33，38]。高血壓時，在心臟負荷增加和局部促肥大因子的作用下，心肌細胞PTEN表達水平下調(diào)，對PI3K/Akt途徑的抑制作用解除，下游激酶及轉(zhuǎn)錄因子活性改變，從而啟動心肌肥厚和心肌纖維化過程。PTEN是miR-21的直接靶分子，miR-21水平升高可抑制PTEN基因表達，從而調(diào)控PI3K/Akt信號通路誘導(dǎo)心室肥厚[39-41]。ZHU等[42]發(fā)現(xiàn)lncRNA MEG3表達下調(diào)，通過使miR-21表達增加以抑制PTEN的活性，誘導(dǎo)心臟成纖維細胞的增殖和遷移，證實lncRNA MEG3/miR-21對PTEN調(diào)控作用在高血壓LVH的形成過程中非常重要。

天牛止眩膠囊，原名血壓平膠囊，由天麻、牛膝、酸棗仁、菊花、防己等組成。天麻，歸肝經(jīng)，其性甘、平，有平肝息風(fēng)止痙之功效。酸棗仁，與天麻共為君藥，歸心、肝二經(jīng)，其性甘、平，有寧心安神、滋陰柔肝之功效。菊花為臣藥，質(zhì)地輕清，性味甘潤，歸肝、腎經(jīng)，有清肝平肝、滋養(yǎng)肝腎之功效，且有明目定眩之功。防己，歸腎、膀胱經(jīng)，有利水以瀉心火、堅腎陰之效；牛膝與防已共為佐使藥，歸肝、腎二經(jīng)，有補肝腎、強筋骨之功效。該方重在治肝腎，兼顧于心，共奏養(yǎng)肝滋腎，平肝潛陽，利尿定眩之功，臨床用于原發(fā)性高血壓患者具有較好的降壓作用，對于陰虛陽亢型眩暈、頭痛、失眠等療效甚佳，臨床運用較為廣泛[9-11]。課題組成員在前期研究發(fā)現(xiàn)，天牛止眩膠囊可以通過抑制血管緊張素Ⅱ降低血壓及逆轉(zhuǎn)血管重塑，下調(diào)心肌組織Toll樣受體4、Toll樣受體2、髓樣分化因子的表達，從而抑制核因子-κB信號通路的表達，改善靶器官損害，且其作用明顯優(yōu)于陽性藥物依那普利[43-44]。

本實驗從lncRNA MEG3/miR-21/PTEN信號通路入手，通過動物實驗比較天牛止眩膠囊和依那普利片控制血壓及改善心室肥厚的作用及其可能的機制。結(jié)果表明，天牛止眩膠囊具有與依那普利相似的降壓和改善LVH作用，這與課題組前期的研究結(jié)果一致[43-44]。天牛止眩膠囊為純中藥制劑，在服用的安全性、耐藥性、依從性等方面優(yōu)于依那普利，因此，臨床運用前景更廣[43]。此外，實驗表明，天牛止眩膠囊與依那普利均能使lncRNA MEG3表達水平上調(diào)，miR-21表達水平下調(diào)，PTEN蛋白水平升高，而且天牛止眩膠囊調(diào)節(jié)作用更強。由此可見，天牛止眩膠囊可能通過調(diào)控lncRNA MEG3/miR-21的表達水平、促進PTEN表達來發(fā)揮控制血壓及延緩LVH的作用。這也從基因調(diào)控的層面論證了天牛止眩膠囊的作用機制，為今后進一步臨床研究奠定了基礎(chǔ)。

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〔收稿日期〕2022-07-18

〔基金項目〕全國名老中醫(yī)藥專家陳新宇傳承工作室建設(shè)項目（國中醫(yī)藥人教函〔2022〕75號）；湖南省創(chuàng)新性省份建設(shè)專項抗擊新冠肺炎項目（2020SK3009） ；湖南省科學(xué)技術(shù)廳重點領(lǐng)域研發(fā)計劃（2019SK2321）；湖南省科技人才托舉工程項目（2020TJ-N01）；湖南省發(fā)改委創(chuàng)新引導(dǎo)專項（湘發(fā)改投資2019-412號）；心病“四時調(diào)陽”重點研究室建設(shè)專項（湘中醫(yī)藥函〔2020〕51號）；“四時調(diào)陽”治未病湖南省工程研究中心（湘發(fā)改高技〔2020〕1006號）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)一流學(xué)科開放基金（2022ZYX01，2022ZYX11，2021ZYX41）。

〔第一作者〕朱智顯，男，博士研究生，醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥防治心血管疾病。

〔通信作者〕*陳新宇，男，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：chenxinyuchen@163.com。