丁冰倩，徐琳琳，王雪嫄，趙欣，王艷，傅金英，2

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450002；2.河南省中醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450053

圍絕經(jīng)期是婦女自生育期的規(guī)律月經(jīng)過渡到絕經(jīng)的時(shí)期，此期主要表現(xiàn)為月經(jīng)不規(guī)則、生殖器官萎縮、烘熱汗出、情緒不穩(wěn)定、血壓易波動(dòng)等，這些臨床表現(xiàn)被稱為圍絕經(jīng)期綜合征（perimenopausal syndrome, PMS）[1]。隨著我國(guó)老齡化社會(huì)的到來(lái)，人口平均壽命的增加，大部分女性絕經(jīng)后還要生存很長(zhǎng)一段時(shí)間，她們絕經(jīng)后的身心健康和生存質(zhì)量值得引起廣泛關(guān)注。

腸道菌群是人體最重要、最龐大的微生態(tài)系統(tǒng)，其基因組總和比人類多100倍[2-3]，機(jī)體的胃腸道中定植著大量的菌群，腸道菌群在機(jī)體代謝過程中起著重要作用，被稱為“代謝器官”[4]。腸道菌群與機(jī)體互利共生，參與機(jī)體的脂質(zhì)代謝以及機(jī)體免疫，并且腸道菌群的改變能夠影響脂質(zhì)和膽固醇的代謝，進(jìn)而影響機(jī)體疾病的發(fā)生發(fā)展[5]。作為人體組成部分之一的腸道菌群，與PMS關(guān)系密切，可能和腸道有益菌群與腐敗菌群比例發(fā)生變化有關(guān)[6]。

本研究旨在從去卵巢大鼠模型出發(fā)，通過去卵巢大鼠模型模擬圍絕經(jīng)期女性，探討圍絕經(jīng)期大鼠與正常大鼠腸道菌群的差異，為臨床認(rèn)識(shí)及治療PMS提供參考價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 材料 12 只8 周齡SPF級(jí)SD雌性大鼠，購(gòu)自華興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)[動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK（豫）2019-0002]，飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室；麻醉用品：水合氯醛（天津大茂化學(xué)試劑廠）；造模術(shù)后抗感染藥物：注射用青霉素鈉（160萬(wàn)IU，國(guó)藥準(zhǔn)字：H13020655，華北制藥股份有限公司）。ELISA試劑盒；全自動(dòng)生化分析儀（深圳雷杜生命科技，設(shè)備型號(hào)：chemray240）；核酸電泳儀（北京六一儀器廠，設(shè)備型號(hào)：DYCP-32C型瓊脂糖水平電泳儀）。Covaris超聲波破碎儀（Massachusetts，美國(guó)；設(shè)備型號(hào)：Covaris S2 system）。Qubit Fluorometric Quantification（Life Technologies，CA，美國(guó)；設(shè)備型號(hào)：Qubit 2.0）。生物分析儀（美國(guó)安捷倫公司；設(shè)備型號(hào)：Agilent 2100）。PCR儀（Bio-Rad，美國(guó)；設(shè)備型號(hào)：T100PCR）。測(cè)序儀（Illumina，San Diego，CA，美國(guó)；設(shè)備型號(hào)：Novaseq 6000）。

1.2 造模方法 12只SPF級(jí)SD雌性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，術(shù)前禁食不禁水12 h，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，沿大鼠下腹正中切開，沿Y形子宮找卵巢，隨機(jī)摘除6只大鼠雙側(cè)卵巢并止血，將子宮、輸卵管等放回腹腔，縫合。術(shù)后腹腔注射青霉素鈉每天20萬(wàn)IU/只，連續(xù)3 d。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處置符合河南中醫(yī)藥大學(xué)頒布的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)（審查編號(hào)：PZHNSZYY-2021-032）。模型復(fù)制成功后，將12只大鼠分為2組，對(duì)照組（未做任何處理）和模型組（去除雙側(cè)卵巢）置于同一實(shí)驗(yàn)環(huán)境中喂養(yǎng)3周。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 實(shí)驗(yàn)大鼠體質(zhì)量：將2組實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行3周的喂養(yǎng)，每日稱體質(zhì)量，并計(jì)算造模前1天和造模3周后的體質(zhì)量，對(duì)比2組間有無(wú)差異。

1.3.2 糞便標(biāo)本采集及腸道菌群的檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng)3 周，活體進(jìn)行大鼠糞便的采集。采集糞便時(shí)先進(jìn)行大鼠肛周消毒，輕輕擠壓大鼠尾巴根部直腸末端，待糞便排出收集于無(wú)菌EP管中，-80 ℃保存。16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)和宏基因測(cè)序技術(shù)對(duì)樣本菌群組成進(jìn)行分析。測(cè)序技術(shù)均由深圳微科盟科技集團(tuán)有限公司提供。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)大鼠血清指標(biāo)檢測(cè)：將實(shí)驗(yàn)大鼠喂養(yǎng)3周后，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，解剖實(shí)驗(yàn)大鼠，進(jìn)行大鼠腹主動(dòng)脈采血，分離血清，采用ELISA試劑盒檢測(cè)卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone, FSH）、雌二醇（estradiol, E2）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS27.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料采用±s表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，腸道菌群采用秩和檢驗(yàn)、Permanova分析等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠體質(zhì)量 造模前，模型組和對(duì)照組大鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（208.8±4.5）gvs.（208.2±6.2）g，t=-0.212，P=0.836]。造模術(shù)后7 d內(nèi)模型組體質(zhì)量低于對(duì)照組，之后模型組體質(zhì)量逐漸增加，術(shù)后第3周模型組大鼠體質(zhì)量明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（267.3±16.6）gvs.（305.2±24.6）g，t=3.120，P=0.011]。見圖1。

圖1 兩組大鼠體質(zhì)量對(duì)比

2.2 實(shí)驗(yàn)大鼠FSH、E2水平 與對(duì)照組比，模型組大鼠血清FSH水平顯著升高[（12.57±4.88）IU/Lvs.（38.03±6.40）IU/L，t=7.752，P＜0.001]，E2水平顯著降低[（16.17±4.67）pmol/Lvs.（7.31±4.05）pmol/L，t=-3.511，P=0.006]。

2.3 基于16s rRNA對(duì)大鼠腸道菌群分析

2.3.1 大鼠腸道菌群共有物種分析：在樣本中，根據(jù)物種是否存在來(lái)尋找分組之間的特有或共有的物種，我們繪制韋恩圖分析不同樣品組之間特有或共有的物種，通過對(duì)兩組符合檢測(cè)要求的樣品的腸道菌群進(jìn)行16S rDNA分析，兩組共有物種為518個(gè)操作分類單位（operational taxonomic units, OTU），對(duì)照組特有物種為972個(gè)OTU，模型組特有物種為1 411個(gè)OTU。

2.3.2 Alpha多樣性指數(shù)稀釋性曲線：曲線以橫坐標(biāo)代表樣本數(shù)目，縱坐標(biāo)代表測(cè)序深度，物種累積曲線可以對(duì)測(cè)序深度是否充足進(jìn)行判斷，箱形圖位置急劇上升表明是測(cè)序深度不夠，需要增加測(cè)序深度，可以發(fā)現(xiàn)更高物種多樣性；箱形圖位置趨于平穩(wěn)，則表示測(cè)序深度足夠，可以進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。如圖2結(jié)果顯示，曲線末端上升趨勢(shì)趨于平緩，說明本研究測(cè)序深度充足，足以涵蓋整個(gè)群落結(jié)構(gòu)。

圖2 Alpha多樣性指數(shù)稀釋性曲線

2.3.3 Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析：Alpha多樣性指數(shù)通常用chao1、Observed_OTUs、Shannon、simpson等指數(shù)來(lái)評(píng)估樣本的物種多樣性，指數(shù)越高，表明樣本的多樣性越復(fù)雜。從對(duì)照組到模型組，物種多樣性呈下降態(tài)勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明組內(nèi)腸道菌群的物種組成差異不大，見圖3。

圖3 Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析

2.3.4 Beta多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析：主成分分析（principal component analysis, PCoA）見圖4，PC1：PC2表示對(duì)總體方差解釋的百分比（21.1%：15.7%），組間Permanova差異分析顯示，對(duì)照組和模型組間的物種結(jié)構(gòu)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002），說明去卵巢前后腸道菌群物種結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化。

圖4 樣本Beta多樣性指數(shù)分析

2.4 基于宏基因?qū)δc道菌群物種多樣性觀察

2.4.1 對(duì)腸道菌群種水平的觀察：在種水平，對(duì)照組與模型組相比，兩組間豐度前20 物種在羅伊氏乳桿菌（Limosilactobacillus reuteri，對(duì)照組9.7%，模型組1.9%，Z=-2.082，P=0.037）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，對(duì)照組4.7%，模型組0.04%，Z=-2.562，P=0.010）、未分類普雷沃氏菌（unculturedPrevotellasp.，對(duì)照組4.6%，模型組0.03%，Z=-2.882，P=0.004）種差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 種水平上腸道菌群相對(duì)豐度（前20的物種）

2.4.2 功能數(shù)據(jù)庫(kù)注釋（KEGG）

2.4.2.1 功能相對(duì)豐度概況：在KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫(kù)中，Level 1 層級(jí)中兩組沒有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的功能（P＞0.05），見圖6A。在level 2層級(jí)上，碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism）、氨基酸代謝（Amino acid metabolism）通路中的功能基因表達(dá)較高，見圖6B。

圖6 不同層級(jí)功能相對(duì)豐度概況

2.4.2.2 功能相對(duì)豐度差異性分析：在Level 3水平（見圖7），基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，我們通過線性判別分析法（LEfSe，LDA＞2，P＜0.05）確定了兩組中代謝通路的差異豐度，每橫向柱代表一個(gè)通路，柱形的顏色對(duì)應(yīng)分組的特征代謝通路ID，柱形的長(zhǎng)度對(duì)應(yīng)LDA值[8]。兩組間共鑒定出27個(gè)豐度相對(duì)較高的代謝通路。模型組顯著富集在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成（map00400）、脂多糖生物合成（map00540）、泛酸鹽和輔酶A生物合成（map00770）、新生霉素生物合成（map00401）、果糖和甘露糖代謝（map00051）、細(xì)胞凋亡（map04210）等通路。對(duì)照組顯著富集在酮體的合成與降解（map00072）、牛磺酸和低?；撬岽x（map00430）、萘降解（map00626）、脂肪酸降解（map00071）、芳香族化合物的降解（map01220）等通路。

圖7 KEGG的基本代謝通路LEfSe分析LDA柱形圖

KO（KEGG Orthologous groups）LefSe組間差異比較結(jié)果顯示，模型組在脂多糖生物合成通路中顯著富集，說明注釋到的功能基因在這通路中占據(jù)優(yōu)勢(shì)。脂多糖生物合成通路中模型組lpxA、lpxK和kdsB特征基因大部分來(lái)自Bacteroides vulgatus、Akkermansia muciniphila、Bacteroides dorei、Bacteroides massiliensis、Parabacteroidesdistasonis、Alistipes senegalensis，lpxA、lpxK也來(lái)源于Bacteroides xylanisolvens，kdsB也來(lái)源于Escherichia coli。見圖8。

圖8 特征基因分層柱狀圖

3 討論

圍絕經(jīng)期是女性由中年步入老年的必經(jīng)階段，在此期間，由于卵巢功能衰退，體內(nèi)雌激素水平急劇下降，導(dǎo)致糖脂代謝紊亂，從而增加了代謝綜合征（metabolism syndrome，MS）的發(fā)生率[9-10]。MS可顯著增加心血管疾病和糖尿病的患病風(fēng)險(xiǎn)[11]。吳立等[12]研究發(fā)現(xiàn)，圍絕經(jīng)期的女性容易發(fā)生糖脂代謝紊亂。本課題組前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)，圍絕經(jīng)期易出現(xiàn)體質(zhì)量增加、脂代謝紊亂等問題[13-14]，但其作用機(jī)制尚不明確。

腸道菌群是宿主代謝的重要調(diào)節(jié)因子之一，宿主和腸道菌群可以相互作用。研究顯示[15]，腸道菌群的變化與人體衰老相關(guān)，而在圍絕經(jīng)期這一由中年至老年的過渡時(shí)期，無(wú)論圍絕經(jīng)期女性是否有明顯自覺不適癥狀，均需對(duì)她們的健康進(jìn)行科學(xué)管理，以杜絕和減緩未來(lái)危害生命和生存質(zhì)量的重大疾病的發(fā)生率。本研究通過模型組大鼠體質(zhì)量顯著高于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)大鼠血清學(xué)結(jié)果，來(lái)證明本實(shí)驗(yàn)造模方法的可行性?；?6S rDNA對(duì)大鼠腸道菌群進(jìn)行分析，韋恩圖顯示兩組間物種組成差異較大，但是模型組較對(duì)照組特有物種多，這一結(jié)果有待后續(xù)進(jìn)一步研究。腸道菌群物種多樣性觀察中，Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析顯示去卵巢前后腸道菌群的物種組成差異不大。Beta多樣性指數(shù)基于Bray Curtis距離來(lái)進(jìn)行PCoA分析，兩組間的物種組成差異較大；然后對(duì)組間菌群進(jìn)行Permanova分析，表明去卵巢前后大鼠的腸道菌群多樣性存在顯著差異。

宏基因技術(shù)將腸道菌群注釋到種水平，與對(duì)照組相比，模型組Limosilactobacillus reuteri、Lactobacillus acidophilus和unculturedPrevotellasp.豐度顯著下降。相關(guān)研究顯示[16-20]，Limosilactobacillus reuteri可以增加能量消耗、預(yù)防肥胖，并且可以降脂、降糖、抗炎、增強(qiáng)胰島素敏感性。Prevotella為普雷沃氏菌，其豐度與脂多糖呈負(fù)相關(guān)，肥胖患者腸道中其物種豐度較低[21]。

MS與氧化應(yīng)激升高之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性。氧化應(yīng)激是指機(jī)體在缺血、缺氧等不利因素的作用下，因活性氧濃度過高而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和組織損傷的病理生理反應(yīng)，是心血管疾病、MS、心肌缺血和心肌梗死等一系列疾病的危險(xiǎn)因素[22]。乳桿菌可以提高總抗氧化能力，并與胰島素敏感性負(fù)相關(guān)[23]，且與葡萄糖、總膽固醇和甘油三酯呈負(fù)相關(guān)，可抑制代謝炎癥和促進(jìn)能量消耗[24-25]。本研究結(jié)果顯示，在種水平，絕經(jīng)前大鼠腸道菌群較絕經(jīng)后大鼠相比具有顯著差異，這不僅為模型組大鼠體質(zhì)量顯著增加提供依據(jù)，還可通過研究絕經(jīng)后大鼠的腸道菌群變化，為后期預(yù)防絕經(jīng)后女性所引發(fā)的MS提供研究基礎(chǔ)。通過觀察兩組大鼠在種水平腸道菌群的物種組成上的差異，推測(cè)這種腸道菌群特征的差異性也是絕經(jīng)前和絕經(jīng)后人群在生理和病理上出現(xiàn)一系列差異的原因之一。

對(duì)照組和模型組腸道菌群構(gòu)成在一定程度上存在差異，這種差異是如何進(jìn)一步導(dǎo)致了疾病的發(fā)生，就需要從功能的角度進(jìn)一步研究。通過2組大鼠腸道菌群宏基因組的KEGG功能注釋，在level 3層級(jí)上，脂多糖生物合成信號(hào)通路在模型組中顯著富集。脂多糖生物合成途徑被認(rèn)為是對(duì)抗多重耐藥革蘭氏陰性菌的藥物靶標(biāo)，lpxA是脂多糖生物合成第一步催化酶的編碼基因，可抑制革蘭氏陰性菌的抗菌活性，可作為新的抗菌靶點(diǎn)[26]。脂多糖是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的特有成分，主要由類脂A、核心多糖和O-抗原組成，它為細(xì)菌提供了基本的滲透屏障功能，是賦予細(xì)菌抗生素抗性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[27]。脂多糖位于革蘭氏陰性菌表面，負(fù)責(zé)維持外膜穩(wěn)定性，這是細(xì)胞存活的先決條件[28]。此外，它是抵御有害環(huán)境因素的重要屏障。類脂A合成基因的缺失或抑制會(huì)明顯影響細(xì)菌的正常生長(zhǎng)。lpxK是類脂A生成途徑中的第六種酶，另外，kdsB也參與脂多糖生物合成[28]。脂多糖是全身性低度炎癥的主要原因之一，也被認(rèn)為是西方飲食、炎癥、肥胖和代謝紊亂之間的關(guān)鍵紐帶[29]。腸道菌群作為人類的一大“能量代謝器官”也參與了MS的形成。由于腸道菌群發(fā)生紊亂，腸黏膜通透性增加，大量脂多糖通過與乳糜微粒結(jié)合或自然滲透入血引起內(nèi)毒素血癥。循環(huán)中脂多糖與脂多糖結(jié)合蛋白結(jié)合后傳遞信號(hào)給巨噬細(xì)胞表面的CD14分子從而激活Toll樣受體（TLR4），引起免疫應(yīng)答[30]，釋放大量的炎性因子，從而引起機(jī)體慢性炎性反應(yīng)。圍絕經(jīng)期引起糖脂代謝紊亂可增加MS的發(fā)病，免疫學(xué)說認(rèn)為炎癥細(xì)胞因子水平可能在PMS發(fā)生發(fā)展中起重要作用[31]?？梢姡嗵巧锖铣赏分懈哓S度的lpxA、lpxK、kdsB的表達(dá)與PMS相關(guān)。

綜上所述，與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠腸道菌群顯著減少，通過16S rDNA和宏基因測(cè)序技術(shù)，將物種水平鑒定到種水平，主要集中在Limosilactobacillus reuteri、Lactobacillus acidophilus和unculturedPrevotellasp.，兩組大鼠腸道菌群的組成發(fā)生變化，可能是導(dǎo)致圍絕經(jīng)期前后出現(xiàn)生理病理學(xué)差異的作用機(jī)制。另外通過KEGG功能注釋，模型組脂多糖生物合成信號(hào)通路為特征通路，提示與PMS密切相關(guān)。腸道菌群作為一個(gè)龐大且復(fù)雜的微生物群體，菌種間有著復(fù)雜的相互影響，在未來(lái)探索每個(gè)細(xì)菌種類具體的生理作用機(jī)制的同時(shí)，要從腸道菌群整體出發(fā)，將各種微生物的功能聯(lián)系起來(lái)，才有可能闡明腸道菌群與絕經(jīng)前后的關(guān)系。該研究為進(jìn)一步采用敲除lpxA、lpxK和kdsB基因法驗(yàn)證PMS的研究奠定了基礎(chǔ)。