朱祥平，高增鴻，馬若騖，汪瑾，劉穎，郭雅彬

肺癌作為全球最常見的癌癥之一，是癌癥相關(guān)死亡的主要原因。據(jù)估計(jì)，每年約新增200 萬(wàn)病例及176 萬(wàn)死亡病例［1］。肺癌分為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）兩大類，其中前者約占85%［2］。非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）包括腺癌（adenocarcinoma）和鱗癌（squamous cell carcinoma）［2］。肺腺癌中最常見的突變發(fā)生于KRAS 基因和EGFR基因，這兩個(gè)基因突變約占總突變的45%，同時(shí)約40%的腺癌及20%的鱗癌相關(guān)基因突變?nèi)蕴幱谖粗獱顟B(tài)［3-5］。近幾年關(guān)于肺癌成因的研究不斷深入，但仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足，因此篩選肺癌相關(guān)基因具有重大意義，有助于為肺癌的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)和思路。為研究肺癌發(fā)生的遺傳學(xué)機(jī)制，我們選用John Minna 教授實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的HBEC細(xì)胞（human bronchial epithelial cells）作為模型［6］。HBEC 源于人支氣管腺細(xì)胞，先后轉(zhuǎn)入了TERT 基因和CDK4 基因并敲低了P53 基因，使之成為永生化細(xì)胞。HBEC 不能在普通培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，需添加人表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）和牛垂體提取物。用于制造突變的睡美人轉(zhuǎn)座子（Sleeping Beauty，SB）轉(zhuǎn)座子經(jīng)過(guò)改造，在兩端反向重復(fù)序列（inverted repeat，IR）之間為Gene Trap盒子的結(jié)構(gòu)［7］。盒子的兩端各有一個(gè)剪接受體（splicing acceptor，SA）和一個(gè)poly A 位點(diǎn)。兩端的轉(zhuǎn)錄本都能與之拼接造成轉(zhuǎn)錄提前終止。盒子的中部為鼠干細(xì)胞病毒（mouse stem cell virus，MSCV）的5′-LTR，其本身是一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子且具有增強(qiáng)子的作用，下游為剪接供體（splicing donor，SD）。它們啟動(dòng)的轉(zhuǎn)錄可以和下游的外顯子拼接，造成基因的過(guò)表達(dá)。Gene Trap 與其兩端的IR 一起合稱為T2/Onc 盒子（T2/Onc cassette）［8］，是轉(zhuǎn)座子誘變中最常用的設(shè)計(jì)，既能引起基因的失活，又能引起基因的激活。近年來(lái)涌現(xiàn)出許多使用SB 轉(zhuǎn)座子篩選癌癥相關(guān)基因的研究，篩選的方法不斷更新，篩選體系不僅有轉(zhuǎn)基因動(dòng)物［6］，也有細(xì)胞系，包括鼠細(xì)胞系及人細(xì)胞系［9］，所研究的癌癥類型包括了肝癌、胰腺癌、白血病、結(jié)腸癌、骨肉瘤、子宮平滑肌肉瘤等多種惡性腫瘤［10-12］。與此同時(shí)，SB轉(zhuǎn)座酶也被不斷改造，活性越來(lái)越高。2009 年，Izsvak 團(tuán)隊(duì)開發(fā)出轉(zhuǎn)座活性超強(qiáng)的SB100X 轉(zhuǎn)座酶，大大提高了轉(zhuǎn)座效率［13］。本研究采用Sleeping Beauty 轉(zhuǎn)座子插入誘變HBEC（human bronchial epithelial cells）的模型，篩選肺癌相關(guān)基因，并對(duì)關(guān)鍵候選基因開展了初步研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

HBEC、NCI-H460、NCI-H1299、NCI-H23、NCIH358、293T細(xì)胞由本課題組保存。DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI-1640 培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自Biological Industries 公司。Keratinocyte SFM 完全培養(yǎng)基、牛垂體提取物（bovine pituitary extract）、重組人表皮生長(zhǎng)因子購(gòu)自Invitrogen公司。0.25%胰酶、青霉素/鏈霉素雙抗、順鉑、Lipo8000 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自上海碧云天公司。CCK-8 試劑購(gòu)自Apexbio 公司。FastPure Cell/Tissue DNA Isolation Mini Kit 購(gòu) 自Vazyme 公司。96 孔 板、Transwell 小 室 購(gòu) 自Corning 公 司。Anti-COL11A1 抗體購(gòu)自Abcam 公司，anti-GAPDH、anti-E-Cadherin、anti-N-Cadherin、anti-Vimentin、anti-SNAI1 抗體購(gòu)自Proteintech 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用Keratinocyte SFM 完全培養(yǎng)基（含10%FBS，1%青霉素-鏈霉素雙抗，并添加牛垂體提取物至50 μg/mL 及重組人表皮生長(zhǎng)因子至5 ng/mL）培養(yǎng)HBEC；采用RPMI-1640 完全培養(yǎng)基（含10% FBS，1%青霉素-鏈霉素雙抗）培養(yǎng)NCI-H460、NCI-H1299、NCI-H23、NCI-H358；采用DMEM 高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)293T 細(xì)胞。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。

1.2.2 軟瓊脂半固體培養(yǎng)基克隆形成實(shí)驗(yàn) 在培養(yǎng)皿的底部先鋪一層含0.5%瓊脂糖的培養(yǎng)基，凝固后再將細(xì)胞懸浮液與含0.3%瓊脂糖的培養(yǎng)基混合均勻，加到預(yù)鋪的培養(yǎng)基上。每隔2～3 天用低倍鏡檢查克隆形成情況，并適量添加液體培養(yǎng)基以防半固體培養(yǎng)基變干。在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)條件下觀察4～6 周。

1.2.3 睡美人轉(zhuǎn)座子插入誘變 采用電轉(zhuǎn)（電壓：1.8 kV，時(shí)間：4.0 msec）將帶有T2/Onc 盒子及表達(dá)SB100X 轉(zhuǎn)座酶的質(zhì)粒（比例為10∶1）共轉(zhuǎn)染至HBEC 細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染后的HBEC 細(xì)胞接種于軟瓊脂半固體培養(yǎng)基，觀察克隆形成，挑選克隆挑并擴(kuò)大培養(yǎng)，構(gòu)建轉(zhuǎn)化細(xì)胞庫(kù)。

1.2.4 轉(zhuǎn)化細(xì)胞基因組DNA 提取 收集細(xì)胞，使用商品化的試劑盒（FastPure Cell/Tissue DNA Isolation Mini Kit，Vazyme），并按試劑盒說(shuō)明書提取基因組DNA。產(chǎn)物用NanoDrop 分光光度計(jì)測(cè)定濃度以及OD260/OD280、OD260/OD230 比值。

1.2.5 二代測(cè)序檢測(cè)T2/Onc 的整合位點(diǎn) 采用連接反應(yīng)介導(dǎo)的PCR（ligation-mediated PCR，LMPCR）制備轉(zhuǎn)座子整合位點(diǎn)文庫(kù)［13］。簡(jiǎn)要過(guò)程為：①使用BfaI 限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA；②純化后連接接頭DNA；③用匹配于SB 末端和接頭分子的引物做PCR；④巢式PCR 放大信號(hào)；⑤純化產(chǎn)物，Illumina 測(cè)序。巢式引物帶有Illumina 測(cè)序所需標(biāo)簽（tag）和條形碼（barcode）序列。barcode 序列由計(jì)算機(jī)程序生成，每個(gè)barcode 含8 位核苷酸，并滿足：①相同的核苷酸不能連續(xù)出現(xiàn)（即不出現(xiàn)AA、GG、TT、CC）；②任何兩個(gè)barcode之間必須至少有4個(gè)位置不同，即任何一個(gè)barcode即使在測(cè)序中出現(xiàn)3 個(gè)錯(cuò)誤也不會(huì)被誤以為是其他barcode。

1.2.6 二代測(cè)序結(jié)果生物信息學(xué)分析方法 主要包括使用通用軟件及自行編程。Illumina 序列的篩選以及一些后續(xù)的分析程序采用發(fā)表于Cancer Research 文獻(xiàn)中所用的程序［9］，并根據(jù)本次篩選的具體情況更新、升級(jí)。序列與基因組的比對(duì)采用Bowtie/Bowtie2 軟件［14］。分析將主要在孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心的高性能計(jì)算服務(wù)器上完成，該服務(wù)器具有超高的運(yùn)算能力和海量的存儲(chǔ)空間。

1.2.7 質(zhì)粒構(gòu)建及慢病毒包裝 將靶點(diǎn)序列克隆至pLKO.1-TRC cloning Vector 慢病毒載體，使用Lipo8000 轉(zhuǎn)染試劑（碧云天）將該載體與輔助質(zhì)粒psPAX2 及pMD2.G 共轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞（1∶1∶1），12 h 后換液，隨后收集換液后24 h 及48 h 的病毒上清并感染細(xì)胞。

表1 shNC 及shCOL11A1 序列

1.2.8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑（Apexbio，K1018）檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。將NCI-H1299（1×103/100 μL/孔）鋪在96 孔板中，在第0、1、2、4、5 天分別于每孔加入10 μL CCK-8 試劑，避光孵育1 h，隨后用酶標(biāo)儀（450nm）檢測(cè)OD 值。

1.2.9 Transwell 遷移、侵襲實(shí)驗(yàn) 對(duì)于細(xì)胞遷移能力測(cè)定，在24 孔板中加入700 μL 含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，用200 μL 無(wú)血清培養(yǎng)基重懸5×105個(gè)細(xì)胞（NCI-H1299）并加入上室。37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后取出小室，棄培養(yǎng)基，4% 多聚甲醛固定，0.1% 結(jié)晶紫溶液染色，清水漂洗，擦拭小室內(nèi)面，晾干后拍照、計(jì)數(shù)。對(duì)于細(xì)胞侵襲能力測(cè)定，使用涂有基質(zhì)膠的Transwell 小室，將1×106個(gè)細(xì)胞（NCI-H1299）細(xì)胞接種到上室中，其余操作同上。

1.2.10 蛋白免疫印跡（Western Blot，WB） 使用加入蛋白酶、磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液（強(qiáng)）（康為世紀(jì)）提取細(xì)胞總蛋白，隨后使用BCA 蛋白定量試劑盒（康維世紀(jì)，中國(guó)）檢測(cè)以及配平蛋白濃度后，加入SDS 蛋白上樣緩沖液（雅酶）煮沸5 min 使蛋白變性。使用10%SDS-PAGE 凝膠電泳分離，保證每條泳道上樣量均為30 μg，PVDF 膜濕法轉(zhuǎn)膜。5%BSA室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜。抗體濃度分別為COL11A1（1∶1000，ab166606，abcam）、GAPDH（1∶3000，60004-1-Ig，Proteintech）、Vimentin（1∶5000，10366-1-AP，Proteintech）、E-cadherin（1∶5000，20874-1-AP，Proteintech）、N-cadherin（1∶3000，22018-1-AP，Proteintech）、SNAI1（1∶1000，13099-1-AP，Proteintech）。TBST 洗膜后用相應(yīng)二抗室溫孵育1h。再次洗膜后加入ECL 發(fā)光液（abclonal）顯色曝光，于凝膠成像儀中檢測(cè)蛋白條帶，Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.2.11 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR） 使用RNA 快速提取試劑盒（RN001）并按照說(shuō)明書提取RNA 并使用Vazyme 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（R323）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將cDNA 于-30 ℃中保存。采用Vazyme 高靈敏性染料法定量PCR 檢測(cè)試劑盒（Q711），冰上解凍并配置反應(yīng)體系，反應(yīng)結(jié)束后導(dǎo)出數(shù)據(jù)，采用ΔΔCT 法進(jìn)行分析。本研究所用的qPCR 引物如表2 所示。

表2 ACTINB 及COL11A1 qPCR 引物序列

表3 核心基因Degree 值

1.2.12 生物信息學(xué)方法 使用TCGA 數(shù)據(jù)端cBio Portal（https：//www.cbioportal.org/）、ICGC（https：//dcc.icgc.org/）等分析基因在不同癌組織中的擴(kuò)增、刪除、突變與表達(dá)情況，使用Gene Ontology 分析基因功能，使用DAVID、GeneMania 程序包分析信號(hào)網(wǎng)絡(luò)等等。除以上提到的分析之外，其余所有的生物信息學(xué)程序均用Perl、Python 和R 語(yǔ)言編寫。K-means 聚類和Circos 圖繪制均使用R 語(yǔ)言中的軟件包完成。

1.2.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)自至少3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用Graphpad Prism 9.0 進(jìn)行，并用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本Student′st-test 分析檢驗(yàn)，三組之間比較采用oneway ANOVA 分析檢驗(yàn)，事后檢驗(yàn)采用Bonferroni 法比較，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 體外SB 轉(zhuǎn)座子誘變系統(tǒng)的建立及肺癌相關(guān)基因篩選

使用電轉(zhuǎn)給HBEC 細(xì)胞共轉(zhuǎn)染SB100X 轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒及T2/Onc 質(zhì)粒（比例為1∶10）。將轉(zhuǎn)染后的HBEC 細(xì)胞接種于軟瓊脂半固體培養(yǎng)基，4 ～6 周后，一些球形的細(xì)胞克隆長(zhǎng)出，而HBEC 親本細(xì)胞無(wú)法形成克?。▓D1-A）。挑選克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，部分克隆能夠在不含EGF 的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而HBEC親本細(xì)胞只能在含有EGF 的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。這些結(jié)果說(shuō)明通過(guò)T2/Onc 的誘變，HBEC 細(xì)胞具備了惡性潛能。

對(duì)上述細(xì)胞克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，成功培養(yǎng)304個(gè)細(xì)胞克隆進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。經(jīng)提取基因組DNA（genomic DNA，gDNA），構(gòu)建含有諸多突變的文庫(kù)（library）。gDNA 經(jīng)過(guò)連接介導(dǎo)的PCR（LM-PCR）擴(kuò)增出轉(zhuǎn)座子整合位點(diǎn)的序列，再通過(guò)巢式PCR（nested PCR）富集，產(chǎn)物經(jīng)純化后送到測(cè)序公司進(jìn)行Illumina 測(cè)序。巢式PCR 的引物5′端帶有“條形碼序列”（barcode），便于區(qū)分不同文庫(kù)。二代測(cè)序（Illumina）得到1.6 億對(duì)序列。經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析，鑒定出8300 多萬(wàn)個(gè)單點(diǎn)匹配，合并后得到4 萬(wàn)多個(gè)非冗余整合位點(diǎn)（non-redundant），即T2/Onc插入位點(diǎn)（圖1-B）。

T2/Onc 插入位點(diǎn)幾乎遍布基因組的各個(gè)位置（圖1-C），但這些位置對(duì)癌癥的發(fā)生并非同等重要。通過(guò)比較不同克隆中的插入位點(diǎn)，我們找出在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著密集的部位，即共同插入位點(diǎn)（common insertion sites，CIS）［5］。CIS 涵蓋的基因或某些相鄰的基因的突變或表達(dá)改變可能在癌癥的發(fā)生中起到一定的作用，即候選（candidate）基因。圖1-D 顯示了每個(gè)文庫(kù)中T2/Onc 插入位點(diǎn)涉及的基因（Reference Sequence，RefSeq）數(shù)，平均每個(gè)文庫(kù)對(duì)應(yīng)99 個(gè)基因。圖1-E 顯示的是每個(gè)文庫(kù)中對(duì)應(yīng)的CIS 數(shù)，平均數(shù)約為22。使用轉(zhuǎn)座子篩選中通用的蒙特卡洛模擬法（Monte Carlo Simulation）確定CIS［9，10，15］，以P＜0.05 為界，共找到252 個(gè)CIS，包含了675 個(gè)肺癌相關(guān)基因（候選基因）。

2.2 核心基因篩選

使用String（https：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上述675 個(gè)肺癌候選基因進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interactions，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析，并使用Cytoscape 軟件［16］刪除沒有相互作用的蛋白，通過(guò)cytoNCA 插件［17］進(jìn)行度數(shù)關(guān)聯(lián)度（Degree Correlation）算法，篩選出27 個(gè)Dgree≥20 的核心基因（圖2），核心基因Dgree 值如表1 所示。

圖2 Cytoscape 核心基因篩選

應(yīng) 用GEPIA2 平 臺(tái)（http：//gepia2.cancer-pku.cn/）對(duì)這些核心基因進(jìn)行差異表達(dá)分析，進(jìn)一步篩選出10 個(gè)同時(shí)在肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）及肺鱗癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）中具有顯著差異表達(dá)的基因。如圖3 所示，其中大部分基因在正常組織中高表達(dá)，提示其為抑癌基因，例如：PIK3R1、GRIA1、APOA1、PTPRD等；僅NDC80 及COL11A1 基因在腫瘤組織中高表達(dá)，提示其為促癌基因。通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，我們選擇Degree 值較大且具有差異表達(dá)的COL11A1 基因進(jìn)行后續(xù)研究。

圖3 在LUAD 和LUSC 中同時(shí)具有差異表達(dá)的核心基因

2.3 COL11A1 敲低細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建

通過(guò)Western Blot比較不同NSCLC細(xì)胞系NCIH460、NCI-H1299、NCI-H23、NCI-H358 中COL11A1的本底表達(dá)情況。結(jié)果顯示，NCI-H1299中COL11A1的表達(dá)顯著高于其他細(xì)胞系（P＜0.001）（圖4-A，B）。我們選擇高表達(dá)COL11A1 的NCI-H1299 細(xì)胞系用于構(gòu)建COL11A1 敲低細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株。

圖4 NCI-H1299 敲低COL11A1 穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建

使用慢病毒感染NSCLC 細(xì)胞系NCI-H1299，并通過(guò)qPCR 比較不同靶點(diǎn)的敲低效果，并選擇敲低效果最好的sh3 靶點(diǎn)用于后續(xù)研究（P＜0.001）（圖4-C）。隨后，我們通過(guò)Western Blot 進(jìn)一步檢測(cè)sh3 的敲低效果。結(jié)果顯示，與對(duì)照組NCI-H1299-shNC 細(xì) 胞 相 比，COL11A1 敲 低 組NCI-H1299-sh-COL11A1 細(xì)胞中COL11A1 的表達(dá)量明顯下降（P＜0.001）（圖4-D，E）。

2.4 敲低COL11A1 抑制NCI-H1299 細(xì)胞增殖并增加其對(duì)順鉑的敏感性

平板克隆形成實(shí)驗(yàn)及CCK-8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)常用于評(píng)估細(xì)胞的增殖能力。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著時(shí)間增加，對(duì)照組NCI-H1299-shNC 細(xì)胞克隆斑明顯變大、增多，而COL11A1 敲低組NCIH1299-shCOL11A1 細(xì)胞克隆變化不明顯（P＜0.01）（圖5-A）。同樣，CCK-8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示，隨著時(shí)間增加，對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量明顯增多，COL11A1 敲低組細(xì)胞隨時(shí)間增加不明顯（P＜0.01）（圖5-B）。以上結(jié)果均表明敲低COL11A1 抑制了NCI-H1299細(xì)胞的增殖能力。

圖5 COL11A1 對(duì)NCI-H1299 細(xì)胞增殖及順鉑耐藥的影響

此外，順鉑（Cisplatin，DDP）是一種常用的化療藥物，廣泛運(yùn)用于腫瘤的治療中。在NCI-H1299 中敲低COL11A1 后，其IC50 值明顯下降（P＜0.001）（圖5-C），表明COL11A1 的下調(diào)增加了NCI-H1299對(duì)順鉑的敏感性，提示COL11A1與順鉑耐藥相關(guān)。

2.5 敲低COL11A1 抑制NCI-H1299 遷移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移是腫瘤治療失敗及復(fù)發(fā)的主要原因，Transwell 遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)是評(píng)估腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的主要方法。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，COL11A1 敲 低 組NCI-H1299-shCOL11A1 細(xì) 胞 的 遷移、侵襲數(shù)量明顯減少（P＜0.001）（圖6-A，B），表明COL11A1 的下調(diào)顯著抑制了NSCLC 細(xì)胞系NCIH1299 的遷移、侵襲能力。

圖6 COL11A1對(duì)NCI-H1299細(xì)胞遷移、侵襲及EMT的影響

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)特征的過(guò)程。在癌癥中，EMT 與腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥相關(guān)［18］。我們通過(guò)Western Blot 檢測(cè)EMT 標(biāo)志蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，COL11A1 敲低組中E-Cadherin 表達(dá)量上升，而NCadherin、Vimentin、SNAI1 表達(dá)量下降（圖6-C）。這些結(jié)果表明敲低COL11A1 后，部分逆轉(zhuǎn)了NSCLC 細(xì)胞EMT 過(guò)程。

3 討 論

肺癌是世界最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病人數(shù)居惡性腫瘤第二位，死亡人數(shù)位居惡性腫瘤首位［2］。隨著肺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的深入研究，出現(xiàn)了包括靶向治療、免疫治療和生物治療在內(nèi)的許多新治療法，但患者存活率仍未顯著提高［19］。

與發(fā)表于Cell 雜志［5］和Nature 雜志［4］的兩項(xiàng)研究相比，本研究篩選出的675 個(gè)肺癌相關(guān)基因有相當(dāng)大的重疊。與Cell 雜志的研究［5］相比，有442 個(gè)基因重疊；與Nature 雜志的研究［4］相比，有445 個(gè)基因重疊；與兩項(xiàng)研究同時(shí)相比，有394 個(gè)基因重疊。同時(shí)也找到了182 個(gè)此前未涉及的肺癌相關(guān)基因。

傳統(tǒng)的SB 轉(zhuǎn)座子篩選多采用SB 基因敲入小鼠［6］。SB 轉(zhuǎn)座酶的表達(dá)伴隨小鼠的一生，會(huì)不斷產(chǎn)生新的轉(zhuǎn)座子插入新的位點(diǎn)，造成很多“搭車”突變。此外，已經(jīng)整合的轉(zhuǎn)座子又有可能被轉(zhuǎn)座酶再次切下來(lái)，造成染色體斷裂，引入與轉(zhuǎn)座子整合無(wú)關(guān)的突變。這樣復(fù)雜的突變譜導(dǎo)致信噪比降低，單純通過(guò)生物信息學(xué)手段難以驅(qū)動(dòng)突變和搭車突變。而且這類方法易導(dǎo)致局部跳躍（local hopping）現(xiàn)象［7］，即轉(zhuǎn)基因小鼠T2/Onc 供體所在染色體上的整合位點(diǎn)多于其他部位，以致只能排除這條染色體上所有的候選基因。為了避免引入過(guò)多的無(wú)關(guān)突變，本研究采取質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法，一方面能夠避免局部跳躍現(xiàn)象；另一方面轉(zhuǎn)座酶的活性維持時(shí)間較短，不會(huì)持續(xù)引入新的突變，可顯著提高數(shù)據(jù)的信噪比。此外，本研究采用人工轉(zhuǎn)化的人支氣管上皮細(xì)胞（HBEC）［6］作為模型，一方面比在小鼠或鼠細(xì)胞模型中篩選更接近人體情況；另一方面HBEC 細(xì)胞遺傳背景簡(jiǎn)單，能夠很好地模擬癌癥的多打擊模式；并且HBEC 細(xì)胞不同于其他人工構(gòu)建的永生化細(xì)胞，不會(huì)逐漸積累突變。因此，基于HBEC 模型的篩選結(jié)果更加客觀，偏向性更小。

本研究采用Sleeping Beauty 轉(zhuǎn)座子插入T2/Onc 盒子誘變HBEC 的模型，篩選出肺癌相關(guān)基因，并進(jìn)一步在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中探究了COL11A1 的功能。COL11A1 編碼XI 型膠原蛋白的三個(gè)α 鏈之一，這是一種主要在軟骨中表達(dá)的次要纖維膠原蛋白，在軟骨中，COL11A1 與COL11A2和COL2A1 形成異質(zhì)三聚體，以組裝型膠原蛋白XI［20，21］。COL11A1 基因的突變與Stickler 綜合征和Marshall 綜合征有關(guān)，COL11A1 基因中的單核苷酸多態(tài)性也與腰椎間盤突出癥易感性有關(guān)［22］。COL11A1 在正常組織中的表達(dá)非常低，但在多種癌癥中明顯上調(diào)，包括乳腺癌、結(jié)直腸癌、食管癌、膠質(zhì)瘤癌、胃癌、頭頸癌、肺癌、卵巢、胰腺癌，在這些癌癥中，COL11A1 的表達(dá)與腫瘤進(jìn)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)［23］。我們?cè)贜SCLC 細(xì)胞系NCIH1299 中敲低了COL11A1，并通過(guò)CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及Transwell 細(xì)胞遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)等證實(shí)了COL11A1 可以促進(jìn)NSCLC 細(xì)胞系的增殖、遷移、侵襲并介導(dǎo)順鉑耐藥及EMT。

以上數(shù)據(jù)充分說(shuō)明采用SB 轉(zhuǎn)座子插入T2/Onc 誘變HBEC 的模型適合用于肺癌相關(guān)基因的篩選。使用蒙特卡洛模擬法對(duì)測(cè)序結(jié)果系統(tǒng)而全面地分析將會(huì)加深我們對(duì)肺癌發(fā)生機(jī)制的理解。同時(shí)，對(duì)部分CIS 基因的深入研究，例如COL11A1，有助于發(fā)現(xiàn)新的肺癌相關(guān)基因，為未來(lái)的肺癌治療提供新的靶點(diǎn)和思路。