馬佳睿 徐芳芷 左惠演 滿永 張曦月 竇琳 唐蔚青 劉進(jìn) 黃秀清 黎健

100730 北京醫(yī)院 國家衛(wèi)生健康委北京老年醫(yī)學(xué)研究所 國家衛(wèi)生健康委北京老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家老年醫(yī)學(xué)中心 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究院(馬佳睿、徐芳芷、左惠演、滿永、張曦月、竇琳、唐蔚青、劉進(jìn)、黃秀清、黎健);100875 北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院抗性基因資源與分子發(fā)育北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(劉進(jìn))

目前,我國心血管病發(fā)病率持續(xù)增高,心血管病死亡占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位[1]。巨噬細(xì)胞是天然免疫的關(guān)鍵群體,正常情況下巨噬細(xì)胞呈靜息狀態(tài),當(dāng)機(jī)體受到不同刺激后巨噬細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為M1經(jīng)典活化型或M2交替活化型[2]。巨噬細(xì)胞的M1極化及所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)除發(fā)揮抗感染作用外,也與多種心血管病發(fā)病機(jī)制關(guān)系密切,如動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病和心肌缺血等[2-3]。鑒于巨噬細(xì)胞在健康和疾病中的重要性,闡明巨噬細(xì)胞M1極化的機(jī)制具有重要意義。

早期研究中,對巨噬細(xì)胞M1極化的調(diào)控多集中于各種轉(zhuǎn)錄因子,如核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)、STATs和KLFs家族成員等對炎癥因子的調(diào)控[4]。此外,MAPKs家族成員如P38、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)等,也參與到M1極化調(diào)控中[5-7]。近期研究發(fā)現(xiàn),糖代謝重編程可能對巨噬細(xì)胞極化十分重要[8-9]。諾貝爾獎(jiǎng)得主Otto Warburg發(fā)現(xiàn),與大部分細(xì)胞在有氧環(huán)境中優(yōu)先通過氧化磷酸化供能的方式不同,腫瘤細(xì)胞即使在有氧條件下,也優(yōu)先利用糖酵解來獲取大部分能量,這種糖代謝方式的改變即稱為Warburg效應(yīng)[8-9]。Warburg效應(yīng)最初被認(rèn)為僅在腫瘤細(xì)胞中發(fā)生,近期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)M1極化的巨噬細(xì)胞也出現(xiàn)與腫瘤細(xì)胞相似的Warburg效應(yīng)[10]。使用己糖激酶抑制劑2-脫氧-D-葡萄糖(2-Deoxy-D-Glucose,2-DG)抑制糖酵解過程,可以抑制巨噬細(xì)胞M1極化過程中特征性炎癥因子的產(chǎn)生[11],表明糖酵解在巨噬細(xì)胞極化及炎癥發(fā)生中起重要的調(diào)控作用。

盡管學(xué)術(shù)界已認(rèn)識到糖代謝轉(zhuǎn)化與巨噬細(xì)胞命運(yùn)密切相關(guān),但其調(diào)控機(jī)制仍有許多未知之處。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B,PI3K/AKT)信號通路是機(jī)體內(nèi)重要的調(diào)控通路之一,可由胰島素、多種生長和存活因子激活,并參與調(diào)控了眾多生物學(xué)過程如凋亡、存活調(diào)控和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等。近期PI3K/AKT信號通路在糖代謝重編程中的作用備受關(guān)注,然而在巨噬細(xì)胞中,PI3K/AKT信號通路是否可以通過調(diào)控糖代謝重編程,進(jìn)而影響其M1極化過程,目前研究較少。本研究以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)建立巨噬細(xì)胞M1極化模型,從代謝重編程的角度探討PI3K/AKT通路在M1極化中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞總RNA提取試劑Trizol和H-DMEM培養(yǎng)基均購自Invitrogen公司;胎牛血清購自Gibco公司;LPS、2-DG及LY29400購自Sigma公司;反轉(zhuǎn)錄酶MMLV購自NEB公司;Q-PCR試劑盒SYRB Green、dNTP(10 mM)和通用引物oligo dT均購自TaKaRa公司;p-mTOR、mTOR、p-p38、p38、p-ERK、ERK、p-AKT、AKT、actin、p-p65、p65和IkB抗體購自CST公司;一抗稀釋液購自Invitrogen公司;HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗購自中杉金橋公司;化學(xué)發(fā)光試劑盒ECL購自Millipore公司;Seahorse XF糖酵解速率測定試劑盒購自Agilent公司。

1.2 RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)及藥物處理

小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫。細(xì)胞使用H-DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%雙抗)于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo公司)內(nèi)培養(yǎng)。使用1 μg/ml LPS于無血清培養(yǎng)基中處理細(xì)胞6 h[12];使用2-DG抑制糖酵解[13]時(shí),將5 mM 2-DG與LPS共處理6 h;使用LY294002抑制PI3K/AKT[14]時(shí),將20 μM LY294002預(yù)處理細(xì)胞18 h后,加入LPS共同處理6 h。

1.3 糖酵解水平的檢測

使用Seahorse XF糖酵解速率測定試劑盒(103344-100)測定細(xì)胞外酸化率(extracellular acidification rate,ECAR),將細(xì)胞接種在XF24微孔板中,并進(jìn)行相應(yīng)的藥物處理。根據(jù)試劑盒說明,在無CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h,在3次基線ECAR測量后,依次向細(xì)胞添加Rot/AA(0.5 μmol/L)和2-DG(50 mmol/L),并使用Seahorse-XF 24細(xì)胞外通量分析儀(Seahorse Bioscient)收集數(shù)據(jù)及進(jìn)行分析。

1.4 炎癥因子和糖酵解相關(guān)基因mRNA水平檢測

使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA,使用MMLV反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照SYBR Green說明書配制PCR反應(yīng)液,使用Thermo公司熒光定量PCR儀器檢測收集數(shù)據(jù)。采用2-ΔΔCt法處理所得數(shù)據(jù),計(jì)算各個(gè)基因相對表達(dá)量。PCR引物序列如表1所示。

表1 q-PCR引物序列

1.5 Western blot檢測

收集處理完畢的細(xì)胞,使用細(xì)胞裂解液RIPA(索萊寶公司)提取總蛋白,取15 μg總蛋白以12% SDS-PAGE電泳分離蛋白,300 mA恒流轉(zhuǎn)印PVDF膜(Milliproe公司),于10%脫脂牛奶(配制于TBST)室溫孵育2 h,用1:1 000一抗(配制于一抗稀釋液)于4℃孵育過夜,TBST洗膜3次每次15 min;使用1:5 000 HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(配制于TBST)室溫孵育2 h;TBST洗膜3次每次15 min;使用化學(xué)發(fā)光液檢測條帶。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞發(fā)生M1極化

使用1 μg/ml LPS處理RAW264.7細(xì)胞6 h,檢測巨噬細(xì)胞MAPK和NF-κB信號通路極化及其M1極化標(biāo)志物的mRNA水平。結(jié)果顯示,與對照組(1 μl/ml生理鹽水處理)相比,LPS處理組細(xì)胞中,MAPK(圖1A、1B)和NF-κB信號通路激活(圖1C、1D)。即p-p38和p-ERK水平升高;p-p65水平升高,IκB水平降低;M1極化標(biāo)志物iNOS(圖1E)及TNF-α、IL-6和IL-1β(圖1F)mRNA水平升高。表明LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M1極化模型構(gòu)建成功。

A:Western blot檢測MAPK信號通路(n=3);B:MAPK信號通路的統(tǒng)計(jì)結(jié)果;C:Western blot檢測NF-κB信號通路(n=3);D:NF-κB信號通路的統(tǒng)計(jì)結(jié)果;E、F:q-PCR檢測M1極化標(biāo)記物(n=6)。與對照組比較,aP<0.05,bP<0.01

2.2 糖酵解調(diào)控LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M1極化過程

為檢測巨噬細(xì)胞M1極化模型中糖代謝重編程的情況,我們使用Seahorse XF糖酵解速率測定試劑盒檢測LPS處理后細(xì)胞糖酵解水平,ECAR值顯示LPS引起細(xì)胞體外酸化增加(圖2A),q-PCR結(jié)果顯示葡萄糖酵解相關(guān)基因(Glut1、HK2、Idha和Aldoa)mRNA水平升高(圖2B),表明LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞發(fā)生M1極化模型中,細(xì)胞發(fā)生明顯的糖代謝重編程。

A:Seahorse XF糖酵解速率測定試劑盒檢測LPS處理后糖酵解水平(n=5);B:q-PCR檢測糖酵解相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平(n=6);C:Seahorse XF糖酵解速率測定試劑盒檢測2-DG處理后糖酵解水平(n=5);D:q-PCR檢測2-DG處理后M1極化標(biāo)記物(n=6)。與LPS組比較,aP<0.05,bP<0.01

為驗(yàn)證糖酵解在巨噬細(xì)胞M1極化中的作用,我們使用己糖激酶抑制劑2-DG抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞糖酵解過程。結(jié)果顯示,2-DG顯著抑制LPS誘導(dǎo)的ECAR值升高(圖2C)。隨著2-DG對糖酵解的抑制,巨噬細(xì)胞M1極化相關(guān)因子TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平也顯著下降(圖2D)。表明糖酵解調(diào)控LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M1極化過程。

2.3 抑制PI3K/AKT信號通路逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞糖代謝重編程及M1極化

為驗(yàn)證PI3K/AKT信號通路在LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞糖代謝重編程及M1極化中的作用,我們首先檢測了LPS處理后PI3K/AKT的活化。結(jié)果顯示,LPS顯著增加了p-AKT的水平(圖3A、3B)。進(jìn)一步使用LY294002抑制PI3K/AKT激活。Western blot結(jié)果顯示,LY294002顯著抑制p-AKT的水平(圖3C、3D)。接著使用Seahorse XF糖酵解速率測定試劑盒檢測PI3K/AKT抑制對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞糖酵解水平的影響,ECAR值顯示PI3K/AKT抑制顯著降低了LPS引起細(xì)胞糖酵解水平升高(圖3E)。伴隨著PI3K/AKT活性的抑制,葡萄糖酵解相關(guān)基因(Glut1、HK2、Idha和Aldoa)(圖3F)和M1極化相關(guān)因子iNOS、TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平也顯著降低(圖3G、3H),表明抑制PI3K/AKT信號通路可逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞糖代謝重編程和M1極化。

A、C:Western blot檢測AKT激活(n=3);B、D:AKT激活的統(tǒng)計(jì)圖;E:Seahorse XF糖酵解速率測定試劑盒檢測LY294002處理后糖酵解水平(n=5);F:q-PCR檢測LY294002處理后糖酵解相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平(n=6);G、H:q-PCR檢測LY294002處理后M1極化標(biāo)記物(n=6)。與對照組或LPS+ LY294002-組比較,aP<0.05,bP<0.01

2.4 PI3K/AKT可能通過對mTOR通路的調(diào)節(jié)參與巨噬細(xì)胞代謝重編程和M1極化的調(diào)控

mTOR/HIF-1α是LPS誘導(dǎo)糖酵解中的核心調(diào)控通路,我們進(jìn)一步檢測PI3K/AKT信號是否通過對mTOR/HIF-1α通路的調(diào)節(jié)進(jìn)而影響糖酵解和M1極化過程。與以往結(jié)果一致,LPS處理后mTOR信號迅速激活,表現(xiàn)為p-mTOR水平及HIF-1α蛋白水平升高(圖4A～C)。進(jìn)一步使用LY294002檢測PI3K/AKT活性對mTOR信號通路的影響。Western blot結(jié)果顯示,LY294002抑制p-AKT的水平后,除抑制NF-κB信號通路的激活外(圖4G、4H),也顯著降低p-mTOR和HIF-1α水平(圖4D～F)。表明PI3K/AKT信號通路可能是通過mTOR信號參與LPS誘導(dǎo)的糖代謝重編程和M1極化的調(diào)控。

A、D:Western印跡檢測mTOR的激活及HIF-1α的表達(dá)(n=3);B、E:mTOR激活的統(tǒng)計(jì)圖;C、F:HIF-1α的統(tǒng)計(jì)圖。與Con組或LPS+LY-組比較,aP<0.05,bP<0.01

3 討論

在本實(shí)驗(yàn)中,我們初步證實(shí)了PI3K/AKT信號通過激活mTOR/HIF-1α信號軸,調(diào)節(jié)糖酵解,進(jìn)而影響巨噬細(xì)胞M1極化進(jìn)程。本研究從代謝重編程的角度闡述巨噬細(xì)胞M1極化中的機(jī)制,擴(kuò)展了對巨噬細(xì)胞M1極化調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識。

巨噬細(xì)胞M1極化過程中產(chǎn)生的大量致炎因子,是機(jī)體對抗感染的重要武器,也與多種急慢性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。早期研究顯示,轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控對巨噬細(xì)胞極化表型十分重要,目前已經(jīng)鑒定出多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[4]。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,在LPS誘導(dǎo)的M1極化中,很多M1極化基因如iNOS、MCP-1等的啟動(dòng)子區(qū)域都包含NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)。LPS結(jié)合其配體后,經(jīng)由Toll樣受體4激活NF-κB信號,從而促進(jìn)多種M1極化相關(guān)的細(xì)胞因子產(chǎn)生[4]。此外,MAPKs家族成員介導(dǎo)的炎癥因子產(chǎn)生也是促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1極化的重要途徑[5-7]。本研究以LPS處理巨噬細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)多個(gè)轉(zhuǎn)錄通路激活,M1極化標(biāo)志物升高,表明模型構(gòu)建成功。

近年來,代謝重編程在巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換中的作用越發(fā)顯著[15]。1970年,研究者在LPS刺激的M1型極化巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了供能方式的改變,出現(xiàn)與腫瘤細(xì)胞相似的Warburg效應(yīng),即以糖酵解代替氧化磷酸化作為細(xì)胞主要的供能方式[10]。隨后研究顯示,糖代謝功能方式的轉(zhuǎn)換不僅可以為巨噬細(xì)胞快速供給能量,還可以為M1極化過程中快速大量炎癥因子產(chǎn)生過程提供所需的大量底物,是巨噬細(xì)胞M1極化的新干預(yù)靶點(diǎn)[8]。Seahorse XF糖酵解速率測定試劑盒是一種新興的可準(zhǔn)確可靠地評估糖酵解通量關(guān)鍵參數(shù)的方法。XF儀器直接實(shí)時(shí)測量細(xì)胞外酸化率ECAR值,反映糖酵解壓力的變化。與以往研究結(jié)果一致,在LPS誘導(dǎo)的M1極化模型中,q-PCR結(jié)果顯示糖酵解相關(guān)基因表達(dá)水平升高,Seahorse實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LPS誘導(dǎo)糖酵解水平升高,表明M1極化過程中確實(shí)發(fā)生糖代謝重編程。而使用己糖激酶抑制劑2-DG抑制糖酵解過程,抑制了巨噬細(xì)胞M1相關(guān)炎癥因子的產(chǎn)生,表明這種代謝方式改變在巨噬細(xì)胞促炎表型轉(zhuǎn)化中起重要作用。

在巨噬細(xì)胞糖代謝重編程中,mTOR/HIF-1α通路是調(diào)控巨噬細(xì)胞糖酵解過程的重要機(jī)制。mTOR復(fù)合物作為調(diào)控細(xì)胞代謝的核心信號具有重要的地位,在細(xì)胞內(nèi)有兩種不同蛋白復(fù)合物,稱為mTORC1和mTORC2[16]。研究顯示,mTORC1是調(diào)節(jié)糖酵解過程的核心蛋白復(fù)合物,由mTOR、Raptor和mLST8組成[17]。M1型巨噬細(xì)胞極化時(shí),LPS激活mTOR,通過促進(jìn)含有5’-末端寡嘧啶信號的mRNA翻譯,增加HIF-1α的表達(dá)。HIF-1α是調(diào)控糖酵解代謝的關(guān)鍵蛋白[18],它能上調(diào)糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶——HK和Glut的表達(dá)[17]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示了LPS可以誘導(dǎo)mTOR/HIF-1α軸的激活。

PI3K/AKT信號通路作為機(jī)體內(nèi)重要的調(diào)控通路之一,可被多種刺激因素激活,在巨噬細(xì)胞M1極化過程中發(fā)揮重要作用。本研究顯示,在LPS誘導(dǎo)的M1極化模型中,AKT活性顯著升高,使用LY294002抑制PI3K/AKT活性,顯著抑制LPS引起的糖酵解和M1極化過程,表明PI3K/AKT參與了LPS誘導(dǎo)的糖酵解的調(diào)控。以往研究提示,PI3K/AKT信號是mTOR通路的重要上游調(diào)控者[19],如PI3K/AKT激活mTOR信號促進(jìn)巨噬細(xì)胞泡沫化的產(chǎn)生[20],我們進(jìn)一步檢測PI3K/AKT抑制對mTOR/HIF-1α信號通路的影響,以明確PI3K/AKT信號通路是否可通過調(diào)控mTOR/HIF-1α信號通路參與糖代謝重編程。正如我們所預(yù)期,PI3K/AKT抑制降低了mTOR/HIF-1α軸的激活以及相應(yīng)的糖酵解過程。表明PI3K/AKT很可能是通過對mTOR/HIF-1α的調(diào)控參與LPS誘導(dǎo)糖酵解過程,進(jìn)而參與M1極化的調(diào)控。

總之,巨噬細(xì)胞M1極化過程與多種心血管病發(fā)病機(jī)制及進(jìn)程密切相關(guān)[21],我們的研究證實(shí)了PI3K/AKT信號通路在巨噬細(xì)胞糖酵解和M1極化中的重要調(diào)控作用,從代謝重編程的角度豐富了M1極化調(diào)控機(jī)制網(wǎng)絡(luò),這些研究結(jié)果將為心血管病的防治提供新的線索和思路。

利益沖突：無