寶紫荊，王曦燁，席海山，許 良

（1.內(nèi)蒙古民族大學 化學與材料學院，內(nèi)蒙古通遼 028043；2.天然產(chǎn)物化學及功能分子合成自治區(qū)重點實驗室，內(nèi)蒙古 通遼 028043；3.內(nèi)蒙古民族大學 醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 通遼 028043）

蒺藜為蒺藜科植物蒺藜（Tribulus terrestrisL·）的干燥成熟果實。性苦、味辛、平，具有平肝、疏肝、祛風名目、散風止癢之功效，常用于治肝陽上亢之頭昏目眩、風熱目赤翳障、風疹瘙癢等癥狀[1］。對于蒺藜化學成分的研究表明，其主要含有皂甙類、黃酮類、生物堿、多糖類化合物，其他還包含甾醇類、氨基酸類、萜類、脂肪酸、無機鹽等成分[2］。據(jù)報道，作為蒺藜中的主要成分，目前，從蒺藜中共分離得到108種甾體皂苷[3］，其藥理學表明，皂苷對于抗炎[4］、抗腫瘤[5］、心腦血管疾病[6-7］、利尿及性功能[8］均有一定作用。凈蒺藜有毒，而中藥炮制理論認為藥材經(jīng)過適當?shù)呐谥坪罂蛇_到減毒增效的作用，因此，臨床上用于入藥的多為炒制后的蒺藜。炒制品蒺藜炮制方法為取凈蒺藜，炒至微黃色，碾去刺即可。蒺藜作為民間藥材歷史悠久，從記錄中最早的《五十二病房》中治療蝎螫傷到如今與其他藥材配伍用于治療眼疾、胸痹、通身浮腫等多種疾病，蒺藜發(fā)揮了其重要的藥用價值[9］。目前，對于蒺藜炮制后其藥效成分的變化報道較少，本實驗以凈、炒熟蒺藜為研究對象，通過UHPLC-MS 結合組學方法分析蒺藜炮制前后化學成分含量的變化，探討蒺藜炮制對其發(fā)揮藥效的機理。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UHPLC-QE Focus orbitrap 液質(zhì)聯(lián)用儀（Thermo Fisher公司，USA）；FW177中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；甲醇、甲酸為色譜純試劑（Thermo Fisher公司，USA）；水為超純水（Millipore Corp，USA）。

凈蒺藜與炒蒺藜均購于河北美康藥業(yè)公司。所有中藥飲片均由內(nèi)蒙古民族大學化學與材料學院許良鑒定。

1.2 供試品溶液的制備

取凈蒺藜與炒蒺藜，分別放置于FW177中草藥粉碎機中粉碎，過40目篩，得到凈蒺藜與炒蒺藜樣品粉末。分別稱取凈蒺藜與炒蒺藜粉末樣品各1 g，以95%乙醇回流3 h，抽濾后回收提取液，取提取液10 mL溶液定容至100 mL容量瓶中。量取1 mL溶液，吹干溶劑，加入1 mL甲醇后過0.45 μm微孔濾膜過濾，冷藏待測。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為Waters Acquity BEH C18 柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫40 ℃；流動相為含0.1%甲酸水溶液。二元線性梯度洗脫：0~0.5 min，2%甲醇；0.5~7.0 min，2%~95%甲醇；7~8 min，95%甲醇；8.0~8.1 min，95%~2%甲醇；8.1~10.0 min，2%甲醇；進樣量10 μL。

質(zhì)譜條件：ESI 離子源，采用正離子模式，掃描范圍：m/z 100～1 000，毛細管電壓3 000 V，毛細管溫度：320 ℃，蒸發(fā)溫度：350 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

峰檢測、峰對齊、歸一化由Compound Discoverer software 2.0（CD2.0）軟件來完成，并進行PCA、火山圖分析。通過與METLIN等精確質(zhì)量檢索數(shù)據(jù)庫進行比對，篩選出最有可能的化學標記物。

2 結果與分析

2.1 UHPLC-MS圖譜分析

凈蒺藜與炒蒺藜的總離子流色譜圖見圖1。由圖1可知，2幅圖對應位置的很多峰面積明顯不同，說明蒺藜化學成分經(jīng)炮制后發(fā)生了顯著變化，而這些發(fā)生變化的成分需要借助高級統(tǒng)計學方法才能得以鑒定。

圖1 凈蒺藜與炒蒺藜的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion flow chromatograms of Tribulus terrestris and stir-fried Tribulus terrestris

2.2 PCA與火山圖分析

PCA（主成分分析）是一種無監(jiān)督的降維識別模式，即從原始變量中導出少數(shù)幾個主成分，使它們盡可能多地保留原始變量的信息，且彼此間互不相關，反映了不同變量間的差異。將凈蒺藜與炒蒺藜的樣品進行PCA分析，結果見圖2（A）。由圖2（A）可知，炮制前后的凈蒺藜與炒蒺藜樣本間明顯分離，表明樣本炮制后多種成分的含量發(fā)生了顯著變化。火山圖可以方便直觀地展示2個樣本間成分差異表達的分布情況，差異分布大的成分分布在兩側，所以左上端與右上端的數(shù)據(jù)點更具有研究意義，見圖2（B）陰影部分。圖2（B）中設定閾值P>0.05，且含量變化在2倍以上的點存在具有統(tǒng)計學差異，其中，左側陰影部分為蒺藜炮制后含量減少的成分，右側陰影部分為炮制后含量增加的成分。

圖2 凈蒺藜與炒蒺藜主成分分析圖和火山圖Fig. 2 Principal component analysis diagram and volcano map of Tribulus terrestris and stir-fried Tribulas terrestris

2.3 蒺藜炮制前后化學標記物的分析

通過PCA與火山圖將具有統(tǒng)計學意義的化合物篩選出來，比對UHPLC-MS法測出來的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和METLIN等精確質(zhì)量檢索數(shù)據(jù)庫中蒺藜化學成分的分子量，并分析鑒定，共得到8種化學標記物，分別為青地霉酸（terrestric acid）、丁二酸（succinic acid）、異鼠李素（isorhamnetin）、苜蓿素（tricin）、吉托皂苷元（Gitogenin）、替告皂苷元（tigogenin）、地索苷（trillin）、酵母甾醇（zymostrol），其中，青地霉酸、吉托皂苷元經(jīng)炮制后含量有所下降，而替告皂苷元、丁二酸、異鼠李素、苜蓿素、地索苷、酵母甾醇經(jīng)炮制后含量增加。表1為凈蒺藜與炒蒺藜間化學標記物的信息。

表1 凈蒺藜與炒蒺藜間的化學標記物信息Tab. 1 Chemical marker information between Tribulus terrestris and stir-fried Tribulus terrestris

3 討論

蒺藜經(jīng)過炮制后，皂苷類成分中的替告皂苷元和黃酮類成分中異鼠李素、苜蓿素的含量增加。據(jù)相關報道，膽固醇偏高會對肝功能造成一定傷害，替告皂苷元通過抑制FXR（farnesoid X receptor）的激活，導致膽固醇轉化為膽汁酸的速率增加，改善膽固醇穩(wěn)態(tài)，進而減少對肝功能的損傷[10］。替告皂苷元是螺甾烷醇的衍生物，是合成甾體激素類藥物的醫(yī)藥中間體和重要原料，甾體皂苷在防治心腦血管疾病、抗腫瘤、降血糖等方面有顯著療效[11］；異鼠李素影響P38/PPAR-α通路，進而調(diào)控細胞凋亡和自噬相關蛋白的表達，降低血清肝酶和促炎細胞因子水平，揭示了異鼠李素可能是未來治療急性暴發(fā)性肝炎的一種潛在藥物[12］；苜蓿素具有廣泛的生物活性，抗炎作用明顯，主要通過抑制環(huán)氧酶、腫瘤壞死因子、前列腺素、白細胞介素、一氧化氮等炎癥介質(zhì)發(fā)揮抗炎作用[13］。因此，炒蒺藜中替告皂苷元等有效成分含量的增加使藥物對于肝病的療效明顯增強。中藥炮制前后藥效物質(zhì)的改變是引起炮制品藥性和功效改變的根本所在。因此，研究中藥炮制前后化學成分性質(zhì)和含量的變化是中藥炮制對藥效變化研究的重要內(nèi)容[14］。蒺藜炮制后其化學標記物的含量變化，表明了蒺藜經(jīng)炮制后由于其有效成分含量的增加而增強了藥效。

4 結論

筆者以凈、炒蒺藜為研究對象，通過UHPLC-MS結合組學方法分析蒺藜炮制前后化學成分含量的變化，探討蒺藜炮制后對其藥效增強的原因。研究發(fā)現(xiàn)，炮制后替告皂苷元、丁二酸、異鼠李素、苜蓿素、地索苷、酵母甾醇含量增加，說明這些化學成分的變化可能是其治療肝炎、炎癥、心血管等疾病療效增強的原因。該研究為蒺藜的炮制原理的解析及其臨床應用提供了實驗依據(jù)。