劉先菊，劉安，姜金鑄

（中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所/中藥鑒定與安全性評估北京市重點實驗室，北京 100700）

白藜蘆醇（Resveratrol，Res），是一種存在于葡萄、虎杖等植物中含有二苯乙烯結(jié)構(gòu)的多酚化合物[1]。因著名的“法國悖論”（French Paradox）的流傳，白藜蘆醇的保健與藥用價值逐漸引起廣泛關(guān)注。之后眾多藥理研究揭示其具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒和抗氧化等多種活性[2-3]。然而葡萄中白藜蘆醇含量普遍較低，常規(guī)條件下通過提取葡萄材料獲取白藜蘆醇無法滿足市場需求[4]。為提高葡萄中白藜蘆醇含量，科研人員對白藜蘆醇生物合成的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了大量研究，期望通過分子遺傳改良方法獲得白藜蘆醇含量高的葡萄品種[5]。前期研究表明，葡萄中極可能存在一個以MYB、WRKY轉(zhuǎn)錄因子為主體，通過蛋白相互作用調(diào)控白藜蘆醇生物合成的精細(xì)網(wǎng)絡(luò)[6]，除轉(zhuǎn)錄因子外，其他蛋白參與白藜蘆醇生物合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究則相對較少，僅VqSnRK2.4/2.6與VqMAPKKK38激酶通過磷酸化參與其中[7-8]。

VQ蛋白（Valine-glutamine motif containing proteins）是一類蛋白結(jié)構(gòu)具有保守FxxhVQxhTG殘基的植物特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控輔助因子[9]，在植物生長發(fā)育以及響應(yīng)生物與非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用。如擬南芥AtVQ29在種子發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用[10]，同時AtVQ12和AtVQ29蛋白在植株防御灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用[11]。研究表明，VQ蛋白可通過與WRKY轉(zhuǎn)錄因子或絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）蛋白互作參與植物生長發(fā)育以及響應(yīng)生物與非生物脅迫[12]，如擬南芥AtVQ23和AtVQ16（SIB1/2）蛋白通過與AtWRKY33互作參與植物生物脅迫防御[13]，而AtVQ9蛋白通過與AtWRKY8互作維持AtWRKY8介導(dǎo)的鹽脅迫耐受通路[14]。然而現(xiàn)階段對于VQ蛋白參與次生代謝產(chǎn)物生物合成的報道還相對較少。

葡萄VQ蛋白相關(guān)研究主要集中于家族成員鑒定及表達(dá)量分析，尚未有具體基因功能研究?；诂F(xiàn)有基因組信息，葡萄中共存在18個VQ家族成員，其中16個成員分布在10條染色體，另2個成員分布于未組裝染色體區(qū)段[15]。利用已公開的葡萄各組織器官不同發(fā)育時期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對葡萄VQ家族成員基因表達(dá)情況進(jìn)行分析，并利用RT-qPCR方法驗證它們在干旱、白粉病感染和激素（水楊酸、乙烯）處理下的表達(dá)情況，結(jié)果顯示葡萄VQ家族成員可能在葡萄響應(yīng)不同逆境脅迫時發(fā)揮重要作用[15]。

本文通過分析已公開的紫外、傷害與霜霉菌（Plasmopara viticola）侵染逆境處理后葡萄葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中葡萄VQ家族成員表達(dá)量，篩選可能參與逆境調(diào)控葡萄白藜蘆醇類成分生物合成的VQ家族成員，并通過遺傳轉(zhuǎn)化與分子生物學(xué)實驗揭示其功能，為未來更全面地解析各種環(huán)境因素對葡萄白藜蘆醇生物合成的調(diào)控機(jī)制提供信息。

1 材料與方法

1.1 植物材料

選取歐亞葡萄品種‘紅巴拉多’成熟葉片（莖基部向上第7、8片葉）作為基因擴(kuò)增試驗材料。選取山葡萄（V. amurensisRupr.）組培苗幼嫩葉片作為基因本源瞬時試驗材料，組培苗培養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱，溫度：25 ℃/18 ℃，光周期：16 h/8 h。

1.2 VQ家族成員及其不同逆境表達(dá)水平信息獲取

根據(jù)Wang等[15]發(fā)表的葡萄VQ基因家族鑒定文章獲得各成員基因的相關(guān)信息。之后根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中紫外、傷害與霜霉菌侵染處理24 h和48 h后歐亞種葡萄‘黑比諾’葉圓片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（GSE37743）[16]提取VQ基因家族成員不同逆境條件下的表達(dá)量。

1.3 VvVQ10引物設(shè)計、基因克隆及入門載體構(gòu)建

使用E.Z.N.A.? Plant RNA Kit試劑盒（Omega bio-tek，R6733）提取葡萄葉片總RNA，之后使用HiScript? III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）試劑盒（諾維贊，R312）合成一鏈cDNA。利用歐亞種葡萄‘黑比諾’參考基因組中VvVQ10CDS序列信息設(shè)計5'端添加Gateway attB接頭的基因全長引物，VvVQ10-F：ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaATG AAGAAACAAGGGAAAAGCAGAAG；VvVQ10-R：ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgTCACACCCCATCA AGCCTTCTC。使用PrimeSTAR?Max DNA聚合酶（TaKaRa，R045）擴(kuò)增VvVQ10基因全長。反應(yīng)程序為：98 ℃變性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸10 s，35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后重組到pDONR221入門載體后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。菌落PCR陽性克隆送北京博邁德基因技術(shù)有限公司測序。

1.4 葡萄葉片瞬時遺傳轉(zhuǎn)化

葡萄葉片瞬時遺傳轉(zhuǎn)化參照西北農(nóng)林科技大學(xué)徐炎團(tuán)隊方法[17]進(jìn)行。將VvVQ10重組到雙元表達(dá)載體pK7GWIWG2(II)載體中，轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101獲得陽性菌落。之后28 ℃液體震蕩培養(yǎng)至OD600值1.0，5000 r·min-1離心5 min，棄上清，等體積侵染緩沖液（10 mmol·L-1MgCl2；10 mmol·L-1MES，pH5.6；乙酰丁香酮150 μmol·L-1；蔗糖2%）重懸菌體，28 ℃靜置4 h。山葡萄組培苗完全浸沒于重懸菌液中，保持負(fù)壓環(huán)境直至所有葡萄葉片呈現(xiàn)水浸狀。去除重懸菌液后組培苗正常光照條件培養(yǎng)3 d，葉片液氮速凍保存。

1.5 葡萄白藜蘆醇及其糖苷提取及含量測定

白藜蘆醇提取參照Xi等[18]方法進(jìn)行，并加以改進(jìn)。準(zhǔn)確稱取1 g速凍葉片粉末，料液比1∶15加入甲醇/乙酸乙酯等體積混合液，室溫避光靜置24 h后高速離心收集上清液。加入提取液重懸沉淀并再次離心收集上清液，兩次提取液合并后旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，2 mL質(zhì)譜級甲醇重新溶解后0.22 μm尼龍膜過濾。吸取1 μL注入UPLCQQQ-MS系統(tǒng)（1290 Infinity Ⅱ-6470，Agilent）進(jìn)行含量測定。色譜柱選用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（Waters，粒徑1.7 μm，內(nèi)徑2.1 mm×150 mm）。流動相選用水（A相）和乙腈（B相），梯度洗脫程序為：0 min，10% B相；8 min，18% B相；14 min，22%B相；19 min，33% B相；22 min，90% B相；26 min，90% B相；27 min，10% B相；30 min，10% B相，流速0.3 mL·min-1。質(zhì)譜條件為電噴霧離子源（ESI源）；鞘氣溫度300 ℃；鞘氣流速 11 L·min-1；噴嘴電壓500 V；霧化器壓力35 psi；毛細(xì)管電壓3500 V；干燥氣溫度320 ℃；干燥氣流量8 L·min-1。數(shù)據(jù)采集模式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，參數(shù)見表1。采用外標(biāo)法定量：精確稱取反式白藜蘆醇及其糖苷形式（反式虎杖苷）標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)譜級甲醇溶解并精確定容。之后取部分溶液進(jìn)行紫外照射，根據(jù)殘存反式白藜蘆醇及反式虎杖苷含量計算順式白藜蘆醇及順式虎杖苷含量。將四種標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行不同比例稀釋后進(jìn)行質(zhì)譜檢測，根據(jù)溶液濃度與相應(yīng)峰面積繪制各自標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 質(zhì)譜MRM模式下白藜蘆醇及虎杖苷參數(shù)Table 1 Parameters of resveratrol and piceid in MRM mode

1.6 酵母雙雜交

將VvVQ10與前期鑒定負(fù)調(diào)控葡萄白藜蘆醇生物合成的轉(zhuǎn)錄因子VvWRKY8[6]分別重組到pGADT7與pGBKT7載體中，PEG/LiAc法共同轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母細(xì)胞，SD/-Trp/-Leu固體培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)，之后菌落稀釋后利用SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal固體培養(yǎng)基觀察生長及顯色情況。

1.7 VvVQ10蛋白磷酸化位點預(yù)測

VvVQ10蛋白序列導(dǎo)入GPS 5.0在線分析軟件（http://gps.biocuckoo.cn/）中進(jìn)行磷酸化位點預(yù)測，除類型參數(shù)選擇全部外其余全部采用默認(rèn)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 各種逆境脅迫下葡萄VQ家族基因表達(dá)量

利用NCBI數(shù)據(jù)庫中紫外、傷害與霜霉菌侵染等逆境脅迫下葡萄轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對葡萄VQ家族基因在各種逆境中的表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果如圖1所示，葡萄VQ家族成員中VvVQ10在正常生長狀況下呈高表達(dá)，紫外光處理輕度上調(diào)后迅速恢復(fù)，而傷害與霜霉菌侵染處理顯著下調(diào)，推測VvVQ10可能在葡萄應(yīng)答逆境脅迫中起到重要作用。

圖1 葡萄VQ家族成員不同逆境表達(dá)量分析Figure 1 Expression pattern analysis of grape VQ family members under different stress

2.2 葡萄葉片瞬時遺傳轉(zhuǎn)化探究VvVQ10基因功能

為探究VvVQ10基因功能，將VvVQ10連入沉默載體pK7GWIWG2(II)載體后，轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101。通過負(fù)壓滲透方法瞬時轉(zhuǎn)化葡萄葉片，避光培養(yǎng)3 d后收集葉片，利用UPLC-QQQ-MS檢測白藜蘆醇及虎杖苷含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VvVQ10沉默后白藜蘆醇及虎杖苷含量均顯著升高（圖2）。

圖2 葡萄葉片瞬時沉默VvVQ10白藜蘆醇及虎杖苷含量Figure 2 The resveratrol and piceid contents in grape leaves after transient silencing VvVQ10

2.3 VvVQ10與VvWRKY8蛋白互作分析

為探究VvVQ10負(fù)調(diào)控白藜蘆醇生物合成的機(jī)理，通過酵母雙雜交實驗探究其與作者前期鑒定同樣具有負(fù)調(diào)控白藜蘆醇生物合成功能的VvWRKY8是否存在蛋白互作關(guān)系。將前期鑒定在酵母中不具有激活活性的VvWRKY8與pGBKT7載體的Gal4 DNA結(jié)合區(qū)進(jìn)行融合表達(dá)，VvVQ10與pGADT7載體的Gal4激活區(qū)進(jìn)行融合表達(dá)，兩種重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化到酵母Y2HGold細(xì)胞中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在SD/-Leu/-Trp（DDO）培養(yǎng)基上所有酵母均生長良好，但在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal(QDO/X)培養(yǎng)基上只有同時轉(zhuǎn)化pGADT7-T和pGBKT7-p53的陽性對照和同時轉(zhuǎn)化pGADT7-VvVQ10和pGBKT7-VvWRKY8的菌株能正常生長，且表現(xiàn)出α-半乳糖苷酶活性使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，其余組合與陰性對照表現(xiàn)一致，均不能生長（圖3）。

圖3 酵母雙雜交檢測VvVQ10與VvWRKY8蛋白互作Figure 3 Detection of protein interaction between VvVQ10 and VvWRKY8 by yeast two hybrid

2.4 VvVQ10與VvWRKY8蛋白互作區(qū)段分析

為進(jìn)一步明確互作機(jī)理，將VvWRKY8蛋白分為N段與C段（圖4A）分別構(gòu)建到pGBKT7載體中，分別與pGADT7-VvVQ10共同轉(zhuǎn)化Y2H Gold酵母菌株后檢測互作情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VvVQ10與VvWRKY8的N段、C段均存在互作關(guān)系（圖4B）。

圖4 酵母雙雜交檢測VvVQ10與VvWRKY8蛋白互作區(qū)段Figure 4 Detection of protein interaction between VvVQ10 and VvWRKY8 segments by yeast 2 hybrid

2.5 VvVQ10磷酸化位點預(yù)測

為探究VvVQ10是否存在磷酸化修飾可能，利用GPS 5.0在線分析軟件對VvVQ10的氨基酸序列進(jìn)行磷酸化位點分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其具有多個潛在磷酸化位點（圖5）。

圖5 VvVQ10磷酸化位點預(yù)測Figure 5 Phosphorylation site prediction of VvVQ10

3 討論

葡萄中白藜蘆醇生物合成主要通過苯丙氨酸代謝途徑在一系列酶促反應(yīng)下合成，其中芪合酶（Stilbene synthase，STS）催化底物4-香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A反應(yīng)生成白藜蘆醇，之后在3-O-β-糖基轉(zhuǎn)移酶（3-O-GT）的催化下進(jìn)一步生成虎杖苷[16]。值得注意的是4-香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A同樣可在查爾酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）的催化下進(jìn)入類黃酮合成途徑[19]。因此芪合酶是將反應(yīng)底物競爭性引入二苯乙烯合成途徑的關(guān)鍵酶，其表達(dá)量決定了葡萄中白藜蘆醇及其糖苷含量[20-21]。眾多研究表明，生物及非生物脅迫可通過各種轉(zhuǎn)錄因子直接或間接調(diào)控STS表達(dá)水平，進(jìn)而誘導(dǎo)白藜蘆醇及其糖苷含量顯著升高。MYB類轉(zhuǎn)錄因子VvMYB14/15最先被鑒定可通過激活下游STS基因表達(dá)正調(diào)控白藜蘆醇合成[22]，之后刺葡萄（V. davidii）VdMYB1和毛葡萄（V. quinquangularis）VqMYB154也被鑒定具有直接激活下游STS基因表達(dá)的功能[23-24]。然而單純操縱MYB轉(zhuǎn)錄因子無法實現(xiàn)葡萄中白藜蘆醇及其糖苷的大量積累[5]。2019年，作者研究發(fā)現(xiàn)VvWRKY8通過與VvMYB14 蛋白互作負(fù)調(diào)控VvSTS15/21的表達(dá)，進(jìn)而減弱白藜蘆醇生物合成[6]。之后西北農(nóng)林科技大學(xué)王躍進(jìn)團(tuán)隊研究發(fā)現(xiàn)，VqbZIP1通過與ABA信號關(guān)鍵成員VqSnRK2.4/2.6蛋白互作正調(diào)控VqSTS6/16/20的表達(dá)[5]；VqERF114可通過與VqMYB35蛋白互作進(jìn)而促進(jìn)VqSTS15/28/42/46表達(dá)[25]；VvWRKY53同樣可與VvMYB14/15蛋白互作進(jìn)而調(diào)控VqSTS9/16/32/41啟動子活性[26]。這些研究表明，葡萄存在一個以MYB轉(zhuǎn)錄因子為核心，其他轉(zhuǎn)錄因子及激酶通過蛋白復(fù)合體形式共同參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究發(fā)現(xiàn)，輔助因子VvVQ10可與VvWRKY8蛋白互作，進(jìn)一步擴(kuò)展了白藜蘆醇調(diào)控網(wǎng)絡(luò)成員類型，證實輔助因子也參與白藜蘆醇生物合成調(diào)控，為后續(xù)改造葡萄種質(zhì)進(jìn)而提升白藜蘆醇含量提供了新思路。

與WRKY及MAPK家族成員相互作用是VQ蛋白較為常見行使功能的方式[9]。作為植物界最大的轉(zhuǎn)錄因子家族，部分WRKY家族成員可通過與VQ蛋白中保守的VQ殘基相互作用來調(diào)節(jié)植物生理過程并響應(yīng)各種生物和非生物脅迫[27]，例如擬南芥SIB1（AtVQ16）和SIB2（AtVQ23）通過識別和結(jié)合WRKY33的C端結(jié)構(gòu)域來調(diào)節(jié)WRKY33的DNA結(jié)合活性[13]。另外，VQ蛋白可作為MAPKs的下游底物，MPK3、MPK4和MPK6是與VQ蛋白相互作用的三種最常見激酶[28]。多項研究表明，VQ蛋白似乎具有橋接MAPK和WRKY以形成三元復(fù)合物（WRKY-VQMAPK）的能力[9]，例如MKS1（AtVQ21）被鑒定為AtMPK4的下游底物并被磷酸化，同時WRKY25和WRKY33也與AtVQ21和AtMPK4相互作用[28-29]。本研究中VvVQ10被證實除與VvWRKY8的DNA結(jié)合區(qū)（C段）互作外，還可與N段結(jié)合，這種多互作位點的模式是否具有特殊意義值得進(jìn)一步探究。同時，對VvVQ10的蛋白序列進(jìn)行磷酸化位點預(yù)測發(fā)現(xiàn)其具有多個潛在磷酸化位點，VvVQ10除與VvWRKY8存在蛋白互作外，是否與MAPK家族成員具有蛋白互作關(guān)系同樣值得進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

綜上所述，VvVQ10通過其表達(dá)量差異響應(yīng)不同環(huán)境脅迫，進(jìn)而通過與VvWRKY8的N端和C端互作負(fù)調(diào)控葡萄白藜蘆醇的生物合成。