施生玲 ，郭星晨 ，馬金璞 ，楊雪妍 ，宋禮，高丹丹

1.西北民族大學生命科學與工程學院（蘭州 730124）；2.西北民族大學生物醫(yī)學研究中心，中國-馬來西亞國家聯(lián)合實驗室（蘭州 730030）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）又稱哌叮酸[1]，是一種天然的非蛋白質氨基酸，具有改善糖尿病、降血壓、免疫調節(jié)、舒緩疲勞、改善睡眠和癲癇等[2-4]多種功能，被廣泛用于醫(yī)藥、食品等領域。GABA可通過微生物發(fā)酵法制備，該方法具有發(fā)酵產量的優(yōu)勢。有研究發(fā)現，乳酸菌具有產GABA的能力，主要包括短乳桿菌（Lactobacillus brevis）[5]、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）[6]、布氏乳桿菌（Lactobacillus brucei）[7]、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）[8]等。由于乳酸菌獨特的益生特性和安全性，采用乳酸菌生產GABA成為當前研究熱點，不僅具有極大的市場應用前景，還具有很高的學術研究價值。

試驗從甘肅本地牧民家中自制牦牛酸奶篩選出產GABA的乳酸菌，通過對比不同接種量、碳源、氮源、pH和發(fā)酵時間，探究乳酸菌產GABA的最佳條件，利用Box-Behnken響應面分析法優(yōu)化乳酸菌產GABA的發(fā)酵工藝條件，分析發(fā)酵產物的抗氧化活性，為產GABA乳酸菌功能性產品的開發(fā)提供一定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸奶（甘肅省甘南藏族自治州牧民自制牦牛酸奶）；DPPH、γ-氨基丁酸（色譜純，美國Sigma公司）；L-谷氨酸鈉（L-Glu，BR，索萊寶化學試劑有限公司）；其余試劑均為國產分析純試劑。

1.2 主要儀器設備

ZWYR-2401恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；L3S可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；SG2-FK便攜式pH計（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；GNP-9050恒溫培養(yǎng)箱（湖南波儀爾科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 產GABA乳酸菌的篩選鑒定

1.3.1.1 乳酸菌菌株的篩選

將適量酸奶接種于MRS液體培養(yǎng)基，于37 ℃進行擴大培養(yǎng)24 h，將菌液進行10倍梯度稀釋至10-3~10-8，在MRS固體培養(yǎng)基上進行涂布法接種，接種量為100 μL，于37 ℃培養(yǎng)48 h。挑取有溶解圈的菌落，在固體培養(yǎng)基上進行劃線接種，直至產生單一菌落，將菌株于4 ℃條件儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 乳酸菌菌株的鑒定

將純化的1.3.1所述的菌落形態(tài)的產GABA的菌株按照革蘭染色試劑盒說明書進行染色，用光學顯微鏡觀察其細胞特征。

1.3.1.3 培養(yǎng)液產GABA的定性和定量的分析

采用紙層析法定性測定GABA。參考萬玉蓮[9]方法操作并加以修改，展開劑為正丁醇-冰醋酸-水4∶1∶3（V/V），其中加入0.4%的茚三酮[10]。采用Berthelot比色法定量分析GABA[11]。

1.3.2 產GABA乳酸菌發(fā)酵工藝優(yōu)化

1.3.2.1 單因素試驗設計

以MRS液體發(fā)酵培養(yǎng)基（含L-谷氨酸鈉）為基礎，以GABA產量為指標，考察不同接種量（1.5%，2.0%，2.5%，3.0%和3.5%）、不同碳源（可溶性淀粉，麥芽糖，乳糖，葡萄糖和蔗糖）、不同pH（4.5，5.0，5.5，6.0和6.5）、不同時間（24，36，48，60和72 h）對乳酸菌GABA產量的影響。每組試驗重復3次，最終結果取平均值。

1.3.2.2 響應面試驗設計

綜合單因素試驗結果，以GABA產量（Y）為響應值，pH（A）、接種量（B）和時間（C）為自變量，設計三因素三水平試驗，運用Box-Behnken進行響應面試驗設計。響應面試驗設計因素和水平見表1。

表1 響應面設計因素水平表

表2 4株菌株菌落形態(tài)描述

1.3.3 GABA抗氧化活性的測定

1.3.3.1 羥自由基清除率測定

參考陳嘉佳等[12]的方法操作并加以修改，羥自由基的清除率按式（1）計算。

式中：P為羥自由基清除率，%；A0為空白組吸光度；A1為試驗組吸光度；A2為對照組吸光度。

1.3.3.2 DPPH自由基清除率的測定

參考陳明[13]的方法操作并加以修改。DPPH自由基清除率按式（1）計算。

1.3.3.3 超氧陰離子自由基清除率測定

參考李丹丹[14]的方法測定超氧陰離子自由基的清除率，按式（2）計算。

式中：P為超氧陰離子自由基清除率，%；A0為空白組吸光度；A1為試驗組吸光度。

1.3.4 數據分析

采用Origin 9.0、Design-Expert 8.0軟件進行數據統(tǒng)計分析，每次試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 產GABA乳酸菌的篩選鑒定

2.1.1 乳酸菌菌株的分離純化

將乳酸菌菌株接種在MRS固體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)48 h后，培養(yǎng)基中出現明顯的碳酸鈣溶解圈（圖1），挑選單一菌落進行培養(yǎng)，菌落形態(tài)如圖1所示，乳酸菌菌落形態(tài)為菌落呈圓形，乳白色不透明，濕潤，邊緣整齊。

圖1 菌株形態(tài)圖

2.1.2 乳酸菌菌株的鑒定

對菌株XBMU436-1、XBMU436-2、XBMU436-3和XBMU436-4進行革蘭染色，革蘭染色結果呈現藍色，均為革蘭陽性菌，菌株呈短桿狀，如圖2所示。

圖2 革蘭染色結果圖

2.1.3 培養(yǎng)液產GABA的定性和定量分析

2.1.3.1 層析法定性測定GABA

從圖3可以看出：初篩出的4株菌株XBMU436-1、XBMU436-2、XBMU436-3和XBMU436-4都產有與標準品GABA相同的Rf值，說明4株菌株都產GABA，菌株XBMU436-2顏色最深，說明菌株XBMU436-2產生的GABA含量最高，因此，以菌株XBMU436-2為試驗菌株。

圖3 紙層析法試驗結果圖

2.1.3.2 Berthelot比色法定量分析GABA

試驗采用Berthelot比色法檢測GABA含量，試驗得到線性關系Y=0.742 4X+0.012 8（R2=0.999）。試驗菌株測定結果如圖4所示。菌株XBMU436-2的培養(yǎng)液產的GABA含量最高，其產量為1.80 g/L。

圖4 初篩菌GABA含量測定圖

2.2 高產GABA乳酸菌發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗結果

2.2.1.1 接種量、碳源、pH、發(fā)酵時間對乳酸菌GABA產量的影響

如圖5（a）所示，接種量1.5%~2.5%時，GABA含量呈上升趨勢，接種量2.5%時，GABA含量最高，為3.51 g/L，接種量大于3.0%時，GABA含量開始下降。因此，選用接種量2.5%為菌體生長中的最佳接種量。

圖5 接種量、碳源、pH和發(fā)酵時間對乳酸菌GABA含量的影響

如圖5（b）所示：菌株對不同碳源的利用程度具有一定差異性，測得以葡萄糖為唯一碳源時乳酸菌產GABA最多，為5.44 g/L，即菌株對葡萄糖的利用程度較好，其原因是可溶性淀粉、麥芽糖、乳糖和蔗糖為多糖，多糖為微生物提供能量則需要先分解，而葡萄糖是單糖，單糖與其他麥芽糖等多糖比起來，可直接為微生物提供營養(yǎng)物質。因此，選擇葡萄糖作為菌體生長中的最佳碳源。

如圖5（c）所示：在pH 5.0~6.0時，GABA含量呈上升趨勢，pH 6.0時，GABA含量最高，為3.14 g/L，但超過pH 6.0時，GABA含量開始減少，呈現直線下降趨勢。培養(yǎng)基pH對微生物的影響很大，pH的大小會引起細胞滲透性的變化和各種酶的活性，從而影響微生物的生長和對營養(yǎng)物質的利用程度，使得乳酸菌產GABA的產量不同。因此，選用pH 6.0為菌株生長的最佳pH。

如圖5（d）所示：培養(yǎng)時間為24~48 h時，GABA含量呈現上升趨勢，48 h時，GABA產量最高，為5.19 g/L，60 h以后GABA含量開始呈現下降趨勢，因此，選用48 h為菌體生長中的最佳培養(yǎng)時間。

2.2.2 響應面分析法優(yōu)化發(fā)酵工藝

2.2.2.1 回歸模型的建立和方差分析

在單因素試驗基礎上，選取pH、接種量和時間這3個因素，進行三因素三水平試驗設計，用響應面分析法優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，根據中心Box-Behnken組合原理設計17組試驗，其中，5組為重復試驗，結果如表3所示。

表3 Box-Behnken試驗設計與結果

利用軟件Design-Expert 8.0，對表3結果進行一系列回歸分析，對pH、接種量和時間3個單因素進行回歸擬合，得到以GABA產量（A）為響應值的回歸方程：Y=3.91-0.16A+0.38B+0.31C-0.12AB-0.19AC+0.063BC-0.55A2-0.59B2-0.67C2。

回歸方差分析如表4所示。

表4 回歸方差分析和結果

試驗結果如表4所示，顯著性檢驗表明該回歸模型的擬合極顯著（P＜0.01），失擬項（P＞0.05）不顯著。模型與實際擬合較好（R2=0.968 6，Radj2=0.927 2），表明模型擬合度可靠性強，觀察值與預測值之間的相關性良好，該模型可用于優(yōu)化GABA發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.2.2.2 響應面分析及優(yōu)化

圖6是單因素pH、接種量和時間交互作用3D響應面和等高線圖，2個因變量相互作用對GABA產量的影響在3D響應面圖中均表現為光滑的彎曲面，彎曲度越大，證明兩變量之間相互作用越強。如圖6（a）所示，在pH一定時，隨著接種量的增加，培養(yǎng)液中GABA產量先增加后減少，響應曲面彎曲度較小；如圖6（b）所示，pH一定時，隨著培養(yǎng)時間的增加，培養(yǎng)液中GABA產量先增加后減少，響應面曲面彎曲度較?。蝗鐖D6（c）所示，接種量一定時，隨著培養(yǎng)時間的增加，培養(yǎng)液中GABA產量先增加后減少，響應面曲面彎曲度較小。

圖6 pH、時間和接種量交互作用對GABA含量的影響及等高線圖

2.3 GABA抗氧化活性的研究

2.3.1 羥自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基清除率的測定

如圖7所示：發(fā)酵液質量濃度分別為0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 mg/mL時，發(fā)酵液對羥自由基、DPPH、超氧陰離子自由基的清除率逐漸增大，三種自由基的清除率在發(fā)酵液質量濃度為0.5 mg/mL時最大。圖7（a）顯示，菌液對羥自由基清除率為80.64%±0.39%，IC50=0.12 mg/mL，同等條件下，VC的清除率為92.85%±0.30%，IC50=0.03 mg/mL；圖7（b）顯示，菌液對DPPH自由基清除率為57.55%±0.54%，IC50=0.52 mg/mL，同等條件下，VC對超氧陰離子清除率為85.44%±0.34%，IC50=0.10 mg/mL；圖7（c）顯示，菌液對超氧陰離子自由基清除率為83.83%±0.20%，IC50=0.20 mg/mL，同等條件下，VC對自由基的清除率為88.59%±0.15%，IC50=0.14 mg/mL。以VC為標準，GABA對羥自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基有一定清除能力。

圖7 羥自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基清除率的測定結果

3 結論

試驗從牦牛酸奶中篩選出4株產GABA乳酸菌，菌株XBMU436-2產GABA最多，在單因素試驗的基礎上，采用響應面分析法優(yōu)化其工藝發(fā)酵條件，最終確定發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)條件：以葡萄糖為唯一碳源、pH 6.0、接種量2.5%、時間36 h，經過優(yōu)化后GABA產量達4.11 g/L，相比于優(yōu)化前有很大提升，證明響應面分析法可有效優(yōu)化乳酸菌產GABA的工藝條件。通過對培養(yǎng)液抗氧化活性的研究，其培養(yǎng)液對羥自由基、DPPH自由基和超氧陰離子的IC50分別為0.12，0.52和0.20 mg/mL，同等條件下，VC對羥自由基、DPPH自由基、超氧陰離子的IC50為0.03，0.52和0.14 mg/mL，證明培養(yǎng)液具有一定的抗氧化能力。試驗結果為產GABA乳酸菌功能性產品開發(fā)提供一定基礎。