張 童, 任 煜, 李 蕾, 裴 環(huán), 蒙 慧, 吳月瀅,2, 袁嘉麗,2*

(1.云南中醫(yī)藥大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院, 云南 昆明 650000; 2.云南中醫(yī)藥大學 云南省中醫(yī)藥學分子生物學重點實驗室 云南省中醫(yī)藥調(diào)節(jié)人體微生態(tài)創(chuàng)新團隊, 云南 昆明 650000)

0 引言

抑郁癥是常見的一種全球精神健康相關(guān)類的疾病,影響著全世界近3億人,主要表現(xiàn)為情緒低落、失眠、對外界事物及活動失去興趣等特征,嚴重患者甚至會自殺,我國抑郁癥發(fā)病率逐年上升且發(fā)病率呈年輕化趨勢[1,2].

持續(xù)性低度免疫炎癥反應(yīng)是重度抑郁癥患者的病理特征之一[3].多項研究表明,腸道屏障功能損傷與炎癥反應(yīng)息息相關(guān).腸道屏障主要有機械屏障、化學屏障、微生物屏障和免疫屏障四部分構(gòu)成[4],可以有效的防止腸內(nèi)有害物質(zhì)進入其它的組織和器官.但當腸道屏障完整性遭到破壞,腸屏障通透性增加,腸內(nèi)細菌移位,內(nèi)毒素增加,導致腸內(nèi)炎癥,進而誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)可能是引起抑郁癥的原因之一[5,6].目前臨床治療以五羥色胺再攝取抑制劑、三環(huán)類抗抑郁藥和四環(huán)類抗抑郁藥為主,但具有起效慢、服用周期長、副作用大等局限性[7].基于此,從中醫(yī)藥多靶點、多途徑等特點入手,尋求更為有效且安全的治療方法有極大的可行性.

玫瑰花,味甘微苦,溫,歸肝、脾二經(jīng),具有行氣解郁,和血散瘀之效[8].現(xiàn)代藥理研究表明,玫瑰花的主要活性成分有黃酮類、揮發(fā)油和芳香類、多糖類、多酚類、脂肪酸類及其他營養(yǎng)成分,具有抗抑郁、抗氧化、抑菌等作用[9].研究表明,玫瑰花顆粒可顯著增加血清中的5-HT含量.改善CUMS小鼠的抑郁樣行為[10].五味子,味酸、甘,性溫,歸肺、心、腎經(jīng),具有收斂固澀,益氣生津,補腎寧心[8].藥理研究表明五味子主要活性成分為木脂素、揮發(fā)油、多糖等,具有鎮(zhèn)靜催眠、抗抑郁、調(diào)節(jié)免疫、抑菌等作用[11].研究發(fā)現(xiàn)五味子提取物和五味子木脂素均可減輕LPS誘導模型小鼠中樞和外周的炎癥,同時顯著改善了模型小鼠的抑郁樣行為[12].玫瑰花行氣解郁,五味子補腎寧心,二藥合用,增強其抗抑郁、抗炎的作用.目前,動物實驗中多選擇鹽酸氟西汀作為陽性對照藥物,鹽酸氟西汀為5-HT再攝取抑制劑,通過結(jié)合5-HT受體來達到治療抑郁癥的作用,其作用部位為腦內(nèi).但本實驗意在探討藥物通過修復(fù)腸黏膜屏障減輕炎癥水平來緩解抑郁癥,主要強調(diào)了腸道在抑郁癥方面的作用靶點,因此未選擇陽性藥物作為對照.基于此,本實驗探究了五味子及玫瑰花能否通過修復(fù)腸黏膜屏障減輕炎癥從而改善小鼠抑郁樣行為,為以后開發(fā)抗抑郁相關(guān)的保健品以及臨床用藥提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6雄性小鼠36只,體重18～20 g,4～6周齡,購自成都達碩實驗動物有限公司,許可證編號:SYXK(滇)K2013-0007.小鼠飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學動物房,環(huán)境符合動物實驗研究相關(guān)倫理學要求,獨籠飼養(yǎng),自由進食進水,光照12 h,平均溫度(22±2) ℃.所有動物實驗均經(jīng)過云南中醫(yī)藥大學動物倫理實驗委員會批準并按照其指導進行,倫理表編號:R-062021084.

1.2 實驗藥物、試劑與儀器

1.2.1 實驗藥物及試劑

玫瑰花和五味子均購于云南中醫(yī)藥大學校醫(yī)院,五味子批次:20220201,玫瑰花批次:FY-MC820;五味子10 g,玫瑰花8 g,水煎劑.

小鼠IL-6 ELISA試劑盒(貨號:MB-2899)、小鼠IL-1β ELISA試劑盒(貨號:MB-2776)、小鼠TNF-α ELISA試劑盒(貨號:MB-2868)、小鼠LPS ELISA試劑盒(貨號:MB-3418)、小鼠5-HT ELISA試劑盒(貨號:MB-3179)、小鼠BDNF ELISA試劑盒(貨號:MB-2940),購自江蘇酶標生物科技有限公司;Anti-ZO-1兔抗小鼠一抗(貨號:GB111402)、Anti-Occludin兔抗小鼠一抗(貨號:GB111401)、Anti-claudin1兔抗小鼠一抗(貨號:GB112543),購自武漢賽維爾科技有限公司;山羊抗兔IgG HRP(批號:BL003A),Biosharp公司.

1.2.2 實驗儀器

VisuTrack高端動物行為學分析系統(tǒng)由上海欣軟信息科技有限公司提供;大小鼠曠場實驗箱 上海欣軟信息科技有限公司(型號:XR-XZ301);大小鼠強迫游泳實驗箱 上海欣軟信息科技有限公司(型號:XR-XQX202);小鼠束縛管自制;Synergy H1型多功能全波段酶標儀,Bio Tek 公司;臺式高速冷凍離心機(5430R),Eppendorf;組織研磨儀,Bullet Blender Storm;Quant Studio實時熒光定量PCR儀,Applied Biosystems公司;BOX-F3凝膠成像系統(tǒng),基因有限公司;GENE GNOME專業(yè)化學發(fā)光成像系統(tǒng),XRQ公司.

1.3 動物分組

按照隨機數(shù)字表法將36只C57BL/6雄性小鼠分成對照組(Control)、模型組(Model)、五味子及玫瑰花治療組(S+R),每組12只.

1.4 模型復(fù)制與藥物干預(yù)

除對照組外,模型組、五味子及玫瑰花治療組采用CUMS聯(lián)合孤養(yǎng)制備抑郁模型:應(yīng)激源包含禁食(12 h)、禁水(12 h)、濕籠(12 h)、傾籠(12 h)、夾尾(1 min)、束縛(1 h)、夜間照明(12 h)、配對居住(12 h)等,每天隨機采用2種應(yīng)激源,同一應(yīng)激源不得連續(xù)出現(xiàn),每種應(yīng)激源每周不超過2次.在造模第5周結(jié)束后進行行為學實驗以判斷是否造模成功,在造模第6周始給予五味子及玫瑰花(0.117 g/mL)進行灌胃干預(yù),按照小鼠體重(10 g/mL),對照組和模型組小鼠分別給予0.9%的生理鹽水灌胃,按照小鼠體重(10 g/mL),每天一次,連續(xù)灌胃14天.

1.5 檢測指標

1.5.1 行為學檢測小鼠行為學變化

造模期間每周測量小鼠的體重變化,造模結(jié)束后進行糖水偏好實驗,曠場實驗及強迫游泳實驗測定小鼠行為學變化.

(1)小鼠體重:每周檢測小鼠的體重變化.

(2)糖水偏好實驗:在適應(yīng)階段,稱取2瓶50 mL的1%的糖水置于鼠籠之上,自由飲水24 h.稱取1瓶50 mL的1%的糖水和50 mL的飲用水置于鼠籠之上,自由飲水24 h.開始正式實驗,小鼠禁食禁水24 h,將1瓶50 mL飲用水水瓶和1瓶50 mL 1%的糖水水瓶分別放于鼠籠,自由飲水3 h,3 h之后交換飲用水水瓶和糖水水瓶的位置,小鼠自由飲水3 h,最后拿下水瓶進行稱量其內(nèi)剩余量.

(3)曠場實驗:將小鼠放入曠場箱內(nèi),在VisuTrack高端動物行為學分析系統(tǒng)內(nèi)劃分為3×3的九宮格,記錄小鼠在曠場箱內(nèi)的總路程,穿梭格子次數(shù).

(4)強迫游泳實驗:將小鼠放入游泳桶內(nèi),強迫游泳6 min,采用分析系統(tǒng)記錄小鼠后4 min漂浮不動的時間.

1.5.2 Elisa檢測小鼠海馬內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量;血清內(nèi)炎癥因子表達水平

造模結(jié)束后,進行取材,斷頭去腦,分離海馬組織,取血,離心得到小鼠血清.使用試劑盒檢測海馬5-HT、BDNF水平、檢測血清IL-6、IL-1β、TNF-α和LPS水平,嚴格按照試劑盒說明書操作.

1.5.3 病理切片觀察結(jié)腸組織炎癥浸潤程度及黏膜損傷程度

造模結(jié)束后,取結(jié)腸組織,進行HE染色,觀察結(jié)腸組織炎癥浸潤程度及黏膜損傷程度.

1.5.4 Q-PCR檢測結(jié)腸組織炎癥水平

取0.05～0.06g結(jié)腸組織研磨后提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA文庫,在冰上配置SYBR Green預(yù)混液在實時PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)上根據(jù)說明書進行擴增.引物購于上海生工工程股份公司設(shè)計合成,序列見表1所示.

表1 LPS、IL-1β、TNF-α、IL-6引物序列

1.5.5 Western blot檢測結(jié)腸黏膜緊密連接蛋白

稱取0.06～0.07g結(jié)腸組織研磨,使用BCA蛋白測定法檢測蛋白含量,分別制備15%、12%、6%的膠,電泳、轉(zhuǎn)膜,封閉1 h,加入一抗4 ℃過夜,洗膜4次,二抗孵育1 h,再次洗膜4次,加ECL發(fā)光液拍照,分析圖像.

1.6 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果與討論

2.1 各組小鼠體重變化

與對照組相比,模型組小鼠體重在造模期間體重增長率呈下降趨勢;5周造模結(jié)束后,五味子及玫瑰花組與模型組相比,五味子及玫瑰花組小鼠體重無明顯變化(p>0.05),具體見表2所示.

表2 小鼠造模期間體質(zhì)量變化

2.2 各組小鼠行為學變化

本實驗采用CUMS聯(lián)合孤養(yǎng)復(fù)制抑郁模型,以此模擬社會復(fù)雜的應(yīng)激源,其發(fā)病機制和表現(xiàn)更符合人類的發(fā)病原因[13].本實驗采用糖水偏好實驗、曠場實驗、強迫游泳實驗以評價小鼠的快感、自主行為和探究行為、絕望狀態(tài)時間.

與對照組相比,模型組小鼠糖水偏好百分比,曠場實驗總路程、穿越格子數(shù)水平顯著降低(p<0.05);經(jīng)五味子及玫瑰花藥對治療后,糖水偏好百分比,曠場實驗總路程、穿越格子數(shù)水平顯著上升(p<0.05).與對照組相比,模型組小鼠強迫游泳實驗的漂浮時長顯著上升(p<0.01);而經(jīng)五味子及玫瑰花藥對治療后,漂浮時長顯著下降(p<0.01).以上行為學結(jié)果提示,本實驗復(fù)制模型成功,且五味子及玫瑰花藥對可改善抑郁模型小鼠的抑郁樣行為.因此,五味子及玫瑰花藥對具有一定的抗抑郁作用.具體見表3和圖1所示.

表3 各組小鼠行為學變化情況

圖1 各組小鼠行為學變化情況(模型組與對照組比較,*p<0.05,**p<0.01;治療組與模型組比較,#p<0.05,##p<0.01)

2.3 各組小鼠海馬組織5-HT、BDNF表達變化

研究表明,長期慢性應(yīng)激狀態(tài)下會導致下丘腦-垂體-腎上腺軸(Hypothalamic-PituitaryAdrenal axis,HPA)軸持續(xù)亢進,使海馬內(nèi)5-HT以及BDNF的含量下降,從而引發(fā)抑郁癥[14,15].

與對照組比較,模型組小鼠海馬內(nèi)5-HT、BDNF表達水平顯著降低(p<0.01);經(jīng)五味子及玫瑰花藥對治療后,海馬內(nèi)5-HT、BDNF表達水平顯著上升(p<0.01).以上結(jié)果提示,五味子及玫瑰花藥對可增加抑郁癥模型小鼠海馬內(nèi)5-HT、BNDF等神經(jīng)遞質(zhì)的表達.具體見表4和圖2所示.

表4 各組小鼠海馬內(nèi)5-HT、BDNF的表達

圖2 各組小鼠海馬內(nèi)5-HT、BDNF的含量變化情況(模型組與對照組比較,**p<0.01;治療組與模型組比較,##p<0.01)

2.4 各組小鼠結(jié)腸組織HE染色

腸黏膜屏障受損,其完整性遭到破壞,腸內(nèi)有害菌及其代謝物增多,腸源性LPS可透過受損的腸黏膜屏障入血,從而導致機體處于長期的慢性炎癥中[16].

與對照組相比,模型組小鼠腸黏膜絨毛缺損或斷裂,腸隱窩伴有炎細胞浸潤,黏膜肌層變薄;經(jīng)五味子及玫瑰花藥對治療后,腸黏膜腺體較完整,黏膜上皮細胞結(jié)構(gòu)較完整,腸隱窩結(jié)構(gòu)較清晰,炎細胞浸潤減少.以上結(jié)果提示,五味子及玫瑰花藥對對腸黏膜屏障完整性有一定的保護作用.具體見圖3所示.

圖3 小鼠結(jié)腸組織病理染色(HE染色,左列10×10,右列20×10)

2.5 各組小鼠結(jié)腸組織緊密連接蛋白變化

緊密連接蛋白Occludin、claudin1、ZO-1是腸黏膜機械屏障的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu),可維持其通透性.通過檢測Occludin、claudin1、ZO-1蛋白發(fā)現(xiàn),抑郁癥模型小鼠結(jié)腸組織Occludin、claudin1、ZO-1蛋白表達水平顯著降低(p<0.01);經(jīng)五味子及玫瑰花藥對治療后Occludin、claudin1、ZO-1蛋白表達水平顯著上升(p<0.05).以上結(jié)果提示,五味子及玫瑰花藥對可一定程度上修復(fù)腸黏膜屏障的損傷.具體見表5和圖4所示.

表5 Occludin、claudin1和ZO-1蛋白的相對表達水平

圖4 各組小鼠中結(jié)腸組織Occludin、claudin1和ZO-1蛋白相對表達水平(模型組與對照組比較,**p<0.01;治療組與模型組比較,#p<0.05,##p<0.01)

2.6 各組小鼠結(jié)腸組織IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化

長期慢性應(yīng)激可導致大量的兒茶酚胺進入循環(huán)系統(tǒng),引起腸黏膜的持續(xù)性損傷[17],腸黏膜完整性遭到破壞,腸源性內(nèi)毒素入血,形成“腸漏癥”[18],引起機體炎癥水平升高,甚至引起血腦屏障通透性發(fā)生改變,進而影響海馬內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的含量.

與對照組相比,抑郁癥模型小鼠結(jié)腸內(nèi)的IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(p<0.05);經(jīng)五味子及玫瑰花藥對治療后,IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著降低(p<0.05).以上結(jié)果提示,抑郁癥模型小鼠存在腸道炎癥,且五味子及玫瑰花藥對可緩解腸道炎癥.具體見表6和圖5所示.

表6 各組小鼠結(jié)腸內(nèi)IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平

圖5 各組小鼠結(jié)腸內(nèi)IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA的轉(zhuǎn)錄水平變化(模型組與對照組比較,*p<0.05,**p<0.01;治療組與模型組比較,#p<0.05,##p<0.01)

2.7 各組小鼠結(jié)腸組織LPS mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化

與對照組相比,抑郁癥模型小鼠結(jié)腸內(nèi)LPS mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(p<0.05);經(jīng)五味子及玫瑰花藥對治療后,LPS mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著下降(p<0.05).提示,由于腸道炎癥,導致腸源性內(nèi)毒素大量產(chǎn)生,且五味子及玫瑰花藥對可減少腸源性內(nèi)毒素的產(chǎn)生.具體見表7和圖6所示.

表7 各組小鼠結(jié)腸內(nèi)LPS mRNA轉(zhuǎn)錄水平

圖6 各組小鼠結(jié)腸內(nèi)LPS mRNA的轉(zhuǎn)錄水平變化(模型組與對照組比較,*p<0.05;治療組與模型組比較,#p<0.05)

2.8 各組小鼠LPS入血情況

與對照組比較,模型組小鼠血清內(nèi)LPS的表達水平顯著升高(p<0.01);經(jīng)五味子及玫瑰花藥對治療后,LPS的表達顯著下降(p<0.05).具體見表8和圖7所示.

表8 各組小鼠血中LPS的表達 (EU/L)

圖7 各組小鼠LPS入血表達情況(模型組與對照組比較,**p<0.01;治療組與模型組比較,#p<0.05)

2.9 各組小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α的水平變化

在抑郁癥的發(fā)生發(fā)展中,由于腸黏膜屏障的損傷,導致機體的慢性低度免疫炎癥反應(yīng)一直伴隨其存在,通過檢測IL-6、IL-1β、TNF-α的表達水平發(fā)現(xiàn),抑郁癥模型小鼠血清中的IL-6、IL-1β、TNF-α的表達水平顯著升高(p<0.01);經(jīng)五味子及玫瑰花藥對治療后,IL-6、IL-1β、TNF-α的表達水平顯著降低(p<0.05).具體見表9和圖8所示.

表9 各組小鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α的表達 (pg/mL)

圖8 各組小鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α的表達情況(模型組與對照組比較,**p<0.01;治療組與模型組比較,#p<0.05)

3 結(jié)論

該實驗結(jié)果顯示模型組小鼠結(jié)腸組織緊密連接蛋白表達水平下降,結(jié)腸內(nèi)炎癥水平升高,腸源性內(nèi)毒素入血引起全身炎癥水平升高,海馬內(nèi)5-HT和BDNF的含量下降,經(jīng)五味子及玫瑰花治療后以上現(xiàn)象得到明顯的改善,提示五味子及玫瑰花發(fā)揮抗抑郁作用的機制可能是通過修復(fù)腸黏膜屏障完整性,降低腸內(nèi)炎癥水平,減少腸源性內(nèi)毒素入血,減輕全身炎癥水平從而增加海馬內(nèi)5-HT和BDNF的含量.但腸黏膜屏障通透性改變往往伴隨著腸道菌群及其代謝物的變化,而本實驗中模型小鼠的腸道菌群及其代謝物的變化需進一步研究證實.

綜上所述,五味子及玫瑰花藥對具有抗抑郁作用,其作用機制可能與修復(fù)腸黏膜屏障,減少腸源性炎癥介質(zhì)的釋放,增加海馬內(nèi)5-HT和BDNF的含量有關(guān).