李晨虎 寧高楊 姜振錕

摘要 本文從降低煙葉煙堿含量的主要方式、微生物代謝煙堿的主要途徑、微生物及其酶降解煙堿的研究進展3個方面綜述了近年來國內(nèi)外對利用微生物及其酶降低煙葉煙堿的研究應(yīng)用成果，以期為煙葉生產(chǎn)提供參考。

關(guān)鍵詞 微生物；煙草；煙堿；降解

中圖分類號 S572? ?文獻標(biāo)識號 A

文章編號 1007-7731（2023）05-0022-05

煙堿，又名尼古丁，屬于吡啶族生物堿，在煙草總植物堿中含量占約90%以上[1]。煙堿含量是影響煙葉感官質(zhì)量的重要因素，含量過高或過低均會對煙葉的感官質(zhì)量造成不利影響[2-4]。而煙葉是支撐卷煙工業(yè)企業(yè)發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，從目前情況來看，國內(nèi)部分產(chǎn)區(qū)煙葉存在上部煙葉煙堿含量偏高的問題，致使這些產(chǎn)區(qū)上部煙葉進入卷煙葉組配方使用的難度較大，從而導(dǎo)致卷煙工業(yè)企業(yè)煙葉原料庫存積壓，一定程度上制約了煙草行業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。如何把煙草的總植物堿含量控制在期望范圍內(nèi)，一直是煙草科技工作者研究的熱點課題。

1 降低煙堿含量的方式

煙草作為一種經(jīng)濟作物，其煙堿含量既與品種、地域、氣候、施肥種類和施肥量等因素有關(guān)，也與后期的工藝處理過程及微生物的作用有關(guān)[5]。目前，降低煙草中的煙堿含量主要通過3種途徑來實現(xiàn)：①農(nóng)業(yè)種植方法：主要通過遺傳、生態(tài)、栽培等傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)手段進行控制[6]。通過該方法降低煙堿，含量效果最為直接，但有可能在一定程度上影響煙葉產(chǎn)量，煙農(nóng)接受度不高，實際推廣應(yīng)用難度較大。②化學(xué)方法：可將煙葉通過有機溶劑萃取和蒸汽蒸餾等處理方法將其中的煙堿脫掉[7]。使用化學(xué)方法雖然可以降低煙堿含量，卻可能導(dǎo)致煙葉外觀和感官質(zhì)量下降，降低煙葉的可用性。③微生物及酶法：分離、篩選出具有降解煙堿功能的微生物，將菌株或其所產(chǎn)酶制劑作用于煙葉上，可有效降低煙葉中的煙堿含量。因為酶具有專一性，能較好防止其余化學(xué)成分改變造成的煙葉質(zhì)量問題。因此，利用微生物及其酶降解煙堿的方式成為了現(xiàn)階段煙草行業(yè)的熱門研究課題和研究方向。

2 微生物代謝煙堿的主要途徑

為了弄清煙堿如何被微生物代謝，各國科技工作者已進行了諸多研究。目前已知的煙堿微生物代謝途徑主要有3種：①脫甲基途徑（Me pathway），該途徑主要是煙草植物和少數(shù)真菌降解煙堿的途徑。Leete等[8]對煙草使用放射性標(biāo)記的煙堿混合物處理，發(fā)現(xiàn)煙堿經(jīng)過脫甲基化得到去甲基煙堿，再由去甲基煙堿代謝為麥斯明，最后轉(zhuǎn)化為煙酸。關(guān)于該途徑各類反應(yīng)中的酶類和相關(guān)的基因描述很少，有待進一步研究。②吡啶途徑（Pyridine pathway），該途徑主要以節(jié)桿菌屬為主。Brandsch等[9]通過研究Arthrobacter oxidans說明了吡啶途徑的過程（圖1），吡啶途徑開始于煙堿的吡咯環(huán)經(jīng)過羥基化和氧化反應(yīng)后生成6-HMM（6-羥基-N-甲基麥斯明），6-HMM不穩(wěn)定自發(fā)水解形成6-HPON（6-羥基假氧化煙堿），接著吡咯環(huán)通過羥基化打開，再經(jīng)過側(cè)鏈裂解形成MGABA（γ-N-甲基丁酸辛酯）和2，6-DHP（2，6-二羥基吡啶），其中MGABA生成γ-氨基丁酸，2，6-DHP最后經(jīng)過催化和氧化后形成2，3，6-三羥基吡啶和馬來酸。③吡咯途徑（Pyrrolidine pathway），假單胞菌屬微生物主要通過此途徑降解煙堿。Chen等[10] 研究說明了Pseudomonas putida S16的吡咯途徑起始于煙堿的吡咯烷脫氫作用轉(zhuǎn)化為N-甲基麥斯明，接著是一步可逆反應(yīng)，N-甲基麥斯明水解生成假氧化煙堿，再通過NicA（煙堿氧化還原酶）生成甲胺和SP（3-琥珀酰吡啶），SP），再經(jīng)過6位羥基化反應(yīng)生成HSP（6-羥基-3-琥珀酰吡啶），最后反應(yīng)生成DHP （2，5-二羥基吡啶）和琥珀酸鹽（圖2）。而Ruan等[11]發(fā)現(xiàn)吡咯途徑具有代謝多樣性，如可將煙堿轉(zhuǎn)化成可替寧或者轉(zhuǎn)化為二烯煙堿、去甲基煙堿。

3 微生物及其酶降解煙堿的研究進展

國外對于利用微生物及其酶降解煙堿的研究較早，1942年，Bucherer[12]為了在降解煙堿的微生物中找到特殊的物質(zhì)和酶用來當(dāng)做人類和動物煙堿中毒的解毒劑，首次在接種細菌的營養(yǎng)培養(yǎng)基上進行了煙堿代謝產(chǎn)物研究，并分離得到3種嗜煙堿的細菌；20世紀50年代，Tabuchi[13]和Sguros[14]共發(fā)現(xiàn)了50多株能利用煙堿作為營養(yǎng)物質(zhì)的微生物，包括Pseudomonas、Alicaligenes、Acbromobacter、Bacteriun和Bacilllus等屬；1952年，F(xiàn)rankenburg等[15-17]從煙草種子表面分離出一種微生物，可將煙堿降解成甲酰胺、氨、草酸以及微量的丙二酸和琥珀酸。而像國外的一些大型煙草企業(yè)，為滿足部分低煙堿香煙的市場需求，很早便開始利用微生物對煙草中的煙堿進行降解[18]。Brown&Williamson煙草公司將白肋煙和烤煙的混合煙絲（1∶1）用假單胞桿菌進行處理，18 h后煙堿含量從2.00%降到了0.85%，并經(jīng)過煙氣分析發(fā)現(xiàn)煙堿含量從1.58 mg降至0.98 mg[19]。該公司還將篩選出的纖維單胞菌和假單胞菌兩種細菌在煙草-煙堿液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用培養(yǎng)后的菌液處理去梗的煙葉，經(jīng)過處理后的煙葉煙堿含量從3.50%降低到1.65%[20]。

截至目前，國內(nèi)外研究人員發(fā)現(xiàn)的能降解煙堿的微生物種類繁多（表1），而近年來，國內(nèi)在該領(lǐng)域的研究也逐漸增多。王書寧等[21-22]分離出一株煙堿降解菌株S16，發(fā)現(xiàn)其在培養(yǎng)基中煙堿耐受濃度可達3.0 g/L，借助NMR、FT-IR、GC-MS和HR-MS等方法對該菌株進行了代謝產(chǎn)物鑒定，測出菌株S16降解煙堿后的主要代謝產(chǎn)物為N-甲基麥思明、3-琥珀酰吡啶、6-羥基-3-琥珀酰吡啶、2，5-二羥基吡啶等。林智慧等[23]通過研究發(fā)現(xiàn)，具有高效煙堿降解功能的內(nèi)生菌G16的煙堿降解能力與pH、接種量和煙堿濃度有關(guān)，其代謝產(chǎn)物為尼古丁提林、脫甲基尼古丁和可鐵寧等物質(zhì)。孫柯丹[24]等從庫存廢棄煙葉中篩分出一株具有高效降解煙堿能力的菌株ZUTSKD，經(jīng)鑒定該菌株為假單胞菌屬，在溫度為30 ℃，pH為7.5時，添加氯化銨和葡萄糖有利于煙堿的降解，并能檢測出3-（2，3，4-三氫-5-吡咯基）-吡啶，2，3′-二吡啶、可天寧和3-羧基-吡啶等代謝產(chǎn)物。陳辰等[25]分離篩選出一株具有煙堿降解能力的菌株，在溫度30 ℃、起始pH 7.0、接種量10%、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速180 r/min的條件下發(fā)酵，煙堿的降解率可達到91.53%。蘇丹等[26]從三明煙區(qū)的煙草植株中篩分出內(nèi)生菌Y5，培養(yǎng)條件優(yōu)化后可完全降解煙堿，并發(fā)現(xiàn)該菌株的中間產(chǎn)物與已報道的假單胞菌屬的吡咯途徑不同。鄧高毅等[27]使用3種不同的菌液對煙株進行了葉面噴灑和根灌處理，結(jié)果表明雖然根灌處理方式無明顯效果，但是通過葉面噴灑的方式，3株菌的降解率分別達到了17.7%、18.5%和25%，且處理后的上部葉感官質(zhì)量有改善的趨勢。任平等[28]分離篩選出一株能夠高效降解煙堿的新菌株Y523，將發(fā)酵優(yōu)化后的菌液進行煙葉烘烤應(yīng)用試驗，烘烤后上部煙葉的煙堿降解率達到28.7％，且上部煙葉品質(zhì)有一定的改善和提高。李雪梅等[29]通過篩分得到一株具有較高煙堿降解能力的微生物菌Nic22，利用其所產(chǎn)酶液對上部煙葉進行處理試驗，感官評吸后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)酶液處理后的上部煙葉，其雜氣和刺激性明顯降低，感官質(zhì)量得到顯著提高。袁永軍等[30]從福建三明地區(qū)的土壤中分離得到一株能夠以煙堿為唯一碳源生長并且具有高效降解煙堿功能的菌株DN2，在500 mg/L的煙堿濃度下，其降解速率為15 mg/（L·h），36 h煙堿降解率為97.65%。

4 結(jié)語

綜上所述，前人研究和應(yīng)用結(jié)果證實利用微生物及其酶能夠有效降解上部煙葉煙堿改善煙葉品質(zhì)，且具有高效性、選擇性等優(yōu)點，是一種切實可行提高上部煙葉可用性的方法。因此，在煙草行業(yè)“控總量、守紅線、降庫存”工作任務(wù)引導(dǎo)下，開展微生物及其酶降低上部煙葉的煙堿含量的研究應(yīng)用前景廣泛，可帶來較高的經(jīng)濟效益和社會效益。

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（責(zé)編：王慧晴）

作者簡介 李晨虎（1998—），河南濟源人，從事煙草研究工作。

收稿日期 2022-05-23