陸 晴, 宋茂興, 馬宏亮, 吳志會(huì)

(唐山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 河北 唐山 063000)

小麥(TriticumaestivumL.)是重要的糧食作物之一[1-3]。小麥白粉病是一種危害小麥地上部分的病害,作為小麥生長(zhǎng)期的一種主要病害,會(huì)對(duì)小麥的產(chǎn)量及品質(zhì)產(chǎn)生嚴(yán)重影響[4]。小麥白粉病主要病原菌是禾谷類(lèi)白粉菌(Blumeriagraminisf. sp.Tritici),是典型的子囊菌亞門(mén)白粉菌目布氏白粉菌屬中的一種專(zhuān)性活體寄生菌,濕潤(rùn)環(huán)境有利于其病原體的繁殖及傳播[5]。我國(guó)白粉病最初多發(fā)生在四川、云南等氣候濕潤(rùn)地區(qū),但是隨著近年來(lái)氣候的變化、小麥株高的普遍降低導(dǎo)致的群體內(nèi)濕度上升等原因,白粉病的發(fā)生區(qū)域逐漸北移[6]。農(nóng)藥能在一定程度上抑制白粉病的發(fā)生,但防治白粉病的根本、有效、經(jīng)濟(jì)的方法仍然是培育抗病品種。

抗病基因的定位、發(fā)掘及利用能夠有效提高抗病育種的效率,迄今為止已經(jīng)被正式命名的抗白粉病基因有64個(gè)[7],但多數(shù)抗病基因隨著病原菌小種不斷變異而喪失抗性[8],目前國(guó)內(nèi)較為有效的小麥白粉病抗性基因有Pm12,Pm13,Pm16,Pm20,Pm21,Pm30[9]。近年來(lái)不斷有學(xué)者克隆出新的白粉病抗性基因,董振杰[10]利用小片段易位系將Pm57精細(xì)定位到了X 67593和X 62492兩個(gè)分子標(biāo)記之間5.13 Mb區(qū)間內(nèi),并對(duì)候選基因comp430422_c0、comp4364_c0、eomp62492_c0進(jìn)行了功能驗(yàn)證;杜習(xí)軍[4]利用自然群體結(jié)合高密度芯片對(duì)小麥白粉病抗性進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析,關(guān)聯(lián)到34個(gè)與苗期白粉病抗性顯著相關(guān)的SNP,其中位于7 A染色體上的AX-110071156、AX-94416898,3 B染色體上的AX-94473502和1 D染色體上的AX-109436089為新的小麥抗白粉病位點(diǎn)。隨著小麥白粉病菌小種的不斷變異,現(xiàn)有抗病基因的抗性逐漸降低,需要不斷挖掘新的優(yōu)異等位基因,從而培育出新的抗病品種。

隨著基因芯片檢測(cè)技術(shù)逐步完善,基于SNP標(biāo)記的全基因組關(guān)聯(lián)分析被廣泛地應(yīng)用在小麥各種復(fù)雜性狀的遺傳解析中[11]。本研究以來(lái)源于我國(guó)華北、華東、華中等地區(qū)的215份小麥品種(系)為材料,利用小麥16 K高密度SNP芯片進(jìn)行小麥成株期白粉病抗性的全基因組關(guān)聯(lián)分析,發(fā)掘小麥白粉病抗性位點(diǎn),以期為克隆小麥白粉病優(yōu)異等位基因及抗性遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及種植方法

本研究選取215個(gè)小麥品種(系)構(gòu)成自然群體,來(lái)源于我國(guó)華北、華東、華中等多個(gè)地區(qū),其中河北省133個(gè)、北京市37個(gè)、山東省28個(gè)、河南省3個(gè)、山西省9個(gè)。試驗(yàn)材料于2020—2021年及2021—2022年分別種植于唐山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院試驗(yàn)田(唐山市)和灤州市龍澤農(nóng)作物研究所(灤州市),共4個(gè)不同環(huán)境。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),3次重復(fù),1 m行長(zhǎng),20 cm行距,按照河北省區(qū)域試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行田間管理及數(shù)據(jù)調(diào)查。

1.2 白粉病抗性鑒定及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

病害誘發(fā)方法采用田間自然誘發(fā),每5行材料種植1行白粉病高感材料(7 DL·7 Ag)作為誘發(fā)材料,待成株期7 DL·7 Ag材料發(fā)病明顯時(shí)對(duì)白粉病發(fā)病等級(jí)進(jìn)行調(diào)查。病害等級(jí)分5級(jí)記載,1級(jí):葉片無(wú)肉眼可見(jiàn)癥狀;2級(jí):基部葉片發(fā)病;3級(jí):病斑蔓延至中部葉片;4級(jí):病斑蔓延至劍葉;5級(jí):病斑蔓延至穗及芒。

用Excel 2010軟件對(duì)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),用SPSS Statistics 19軟件對(duì)表型數(shù)據(jù)的均值、方差等進(jìn)行計(jì)算分析。

1.3 全基因組SNP芯片分型

在小麥拔節(jié)期前,每個(gè)材料取5～7片嫩葉,將取得的葉片迅速冷凍在-80 ℃冰箱中,隨后用干冰低溫運(yùn)輸,委托石家莊博瑞迪生物技術(shù)有限公司進(jìn)行總DNA提取、使用小麥16 K高密度SNP芯片進(jìn)行群體DNA基因分型;去除位點(diǎn)檢出率<90%的樣本及低頻基因型頻率(MAF)<5%和缺失數(shù)據(jù)>30%的SNP標(biāo)記,最終得到共計(jì)210個(gè)高質(zhì)量樣本及9 501個(gè)高質(zhì)量SNP標(biāo)記用于小麥白粉病抗性的全基因組關(guān)聯(lián)分析。

1.4 群體結(jié)構(gòu)分析

從篩選的標(biāo)記中,隨機(jī)選取2 000個(gè)最小等位基因頻率大于10%,且在染色體上均勻分布的SNP,利用Structure 2.3.4軟件進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析;參數(shù)設(shè)置為:Length of Burnin Period=10 000,Number of MCMC Reps after Burnin=10 000,選擇Admixture Model模型,設(shè)置K=2～12,每個(gè)K值重復(fù)5次。將運(yùn)行結(jié)果打包成zip格式文件上傳到在線(xiàn)分析軟件Structure Harvester(https://taylor 0.biology.ucla.edu/structure Harvester/)計(jì)算ΔK,將出現(xiàn)明顯峰值的ΔK所對(duì)應(yīng)的K值作為亞群數(shù)目。

在Structure 2.3.4軟件運(yùn)行的結(jié)果中選擇最佳K值對(duì)應(yīng)的5個(gè)重復(fù)的分析結(jié)果,整合成CLUMPP分析軟件能夠讀取的indfile格式文件,用CLUMPP將結(jié)果合并為1個(gè)Q值矩陣,利用GraphPad Prism軟件結(jié)合Q值矩陣?yán)L制群體結(jié)構(gòu)圖。

1.5 全基因組關(guān)聯(lián)分析

將210個(gè)高質(zhì)量樣本及9 501個(gè)高質(zhì)量SNP標(biāo)記信息整理成TASSEL 5.0軟件可讀的MAP和PED文件,并使用TASSEL 5.0軟件合并成plink數(shù)據(jù)。在TASSEL 5.0中選取plink基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(PCA)及親緣關(guān)系矩陣(Kinship)值計(jì)算;將PCA、plink、表型值合并后,結(jié)合Kinship值,采用混合線(xiàn)性模型(MLM)對(duì)白粉病性狀及SNP標(biāo)記之間進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,設(shè)置閾值p<0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP標(biāo)記分布及群體結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)小麥16 K高密度SNP芯片對(duì)群體DNA進(jìn)行基因分型,共檢測(cè)出SNP標(biāo)記總數(shù)為37 669個(gè),其中包含核心SNP標(biāo)記14 868個(gè),其在A、B、D亞基因組中的分布情況分別為5 681個(gè)、5 939個(gè)和3 248個(gè)(圖1)。去除位點(diǎn)檢出率<90%的樣本及低頻基因型頻率(MAF)<5%和缺失數(shù)據(jù)>30%的SNP標(biāo)記,最終得到共計(jì)210個(gè)高質(zhì)量樣本及9 501個(gè)高質(zhì)量核心SNP標(biāo)記用于小麥白粉病抗性的全基因組關(guān)聯(lián)分析。

注:橫軸表示SNP標(biāo)記所在物理位置,縱軸表示SNP標(biāo)記所在染色體。圖1 目標(biāo)SNP位點(diǎn)在基因組上的分布情況Fig.1 Distribution of target SNPS across the genome

利用Structure 2.3.4軟件結(jié)合Structure Harvester在線(xiàn)分析軟件對(duì)群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,當(dāng)ΔK取得最大值時(shí),K=3,所以將關(guān)聯(lián)分析群體劃分為三個(gè)類(lèi)群(圖2)。第一類(lèi)群含83個(gè)品種(系),主要來(lái)自于河北及山東,第二類(lèi)群含42個(gè)品種(系),主要來(lái)自于河北,第三類(lèi)群含85個(gè)品種(系),主要來(lái)自于河北、北京及山西。

圖2 210個(gè)小麥品種(系)的群體結(jié)構(gòu)圖(左)及K值折線(xiàn)圖(右)Fig.2 The population structure map (left) and K value line chart (right) of 210 wheat varieties (lines)

表1 4種環(huán)境中各病級(jí)個(gè)體數(shù)分布情況Table1 Distribution of individuals of each disease grade in the four environments

2.2 白粉病抗性鑒定結(jié)果

在不同環(huán)境條件下,5個(gè)病級(jí)所對(duì)應(yīng)的個(gè)體數(shù)有所不同,小麥白粉病表型受環(huán)境因素的影響,在不同環(huán)境中鑒定結(jié)果會(huì)有差異(表1)。將病級(jí)1～2級(jí)規(guī)定為抗病表型,病級(jí)3～5級(jí)為感病表型;在2021年唐山環(huán)境和2022年唐山環(huán)境中,群體整體發(fā)病程度較輕,抗病表型個(gè)體數(shù)占比分別為78.09%、83.33%,感病個(gè)體數(shù)占比分別為21.91%、16.67%;在2021年灤州環(huán)境和2022年灤州環(huán)境中,群體整體發(fā)病程度較重,抗病表型個(gè)體數(shù)占比分別為42.18%、33.33%,感病個(gè)體數(shù)占比分別為57.82%、66.67%,其中病級(jí)為5的個(gè)體數(shù)占比分別達(dá)26.53%、22.55%。環(huán)境因素對(duì)小麥白粉病表型鑒定有一定影響,多年多點(diǎn)鑒定有利于降低環(huán)境造成的誤差。

2.3 白粉病抗性全基因組關(guān)聯(lián)分析

試驗(yàn)采用小麥16 K高密度SNP芯片的9 501個(gè)高質(zhì)量核心SNP標(biāo)記,結(jié)合210個(gè)高質(zhì)量樣本的白粉病抗性表型,對(duì)小麥白粉病抗性顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析,共檢測(cè)到分布于1 A(3)、1 D、2 A、2 B(4)、2 D(2)、3 A、3 B(2)、4 A(2)、4 D、5 A、5 B(2)、5 D、6 A、6 B、7 B、7 D染色體上的25個(gè)與白粉病抗性顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)(圖3、表2)。

在2021年唐山環(huán)境中,位于1 A(3)、1 D、2 A、3 A、4 D、6 B染色體上的8個(gè)位點(diǎn)與白粉病抗性顯著關(guān)聯(lián);在2021年灤州環(huán)境中,位于3 B、4 A、7 D染色體上的3個(gè)位點(diǎn)與白粉病抗性顯著關(guān)聯(lián);在2022年唐山環(huán)境中,位于2 B、2 D(2)、4 A、5 A、5 B(2)、5 D、7 B染色體上的9個(gè)位點(diǎn)與白粉病抗性顯著關(guān)聯(lián);在2022年灤州環(huán)境中,位于2 B(3)、3 B(2)、6 A染色體上的6個(gè)位點(diǎn)與白粉病抗性顯著關(guān)聯(lián)。山環(huán)境中,位于2 B、2 D(2)、4 A、5 A、5 B(2)、5 D、7 B染色體上的9個(gè)位點(diǎn)與白粉病抗性顯著關(guān)聯(lián);在2022年灤州環(huán)境中,位于2 B(3)、3 B(2)、6 A染色體上的6個(gè)位點(diǎn)與白粉病抗性顯著關(guān)聯(lián)。

表2 與小麥白粉病抗性顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)Table 2 SNP markers significantly associated with wheat powdery mildew resistance

圖3 全基因組關(guān)聯(lián)分析曼哈頓圖(左)和Q-Q圖(右)Fig.3 Manhattan (left) and Quantile-Quantile plot (right) of GWAS

在關(guān)聯(lián)出的25個(gè)與白粉病抗性顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)中,有多個(gè)區(qū)段(位點(diǎn))在多個(gè)環(huán)境中被檢測(cè)到:位于2 B染色體的743.4～781.6 Mb區(qū)段內(nèi)的2 B_743353859、2 B_745699320、2 B_781550737在2022年灤州環(huán)境中被檢測(cè)到,2 B_751000078在2022年唐山環(huán)境中被檢測(cè)到,該區(qū)段表型貢獻(xiàn)率為5.677%～8.344%;位于3 B染色體上的3 B_572684816在2021年灤州環(huán)境和2022年灤州環(huán)境中被檢測(cè)到,該位點(diǎn)表型貢獻(xiàn)率為7.061%～11.378%。

表3 白粉病抗性顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的優(yōu)異等位變異Table 3 Superior alleles variation significantly associated with wheat powdery mildew resistance

2.4 白粉病抗性顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)優(yōu)異等位變異

對(duì)白粉病抗性顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)優(yōu)異等位變異進(jìn)行分析(表3),以等位基因?qū)?yīng)的病級(jí)均值為衡量標(biāo)準(zhǔn),優(yōu)異等位基因?qū)?yīng)的病級(jí)均值變化范圍為1.62～3.07,非優(yōu)異等位基因?qū)?yīng)的病級(jí)均值變化范圍為2.37～4.03;優(yōu)異等位基因比非優(yōu)異等位基因的病級(jí)均值降低0.12～1.35、病級(jí)比率降低5.06%～45.45%。從個(gè)體角度分析,TM 007多個(gè)環(huán)境表現(xiàn)抗病,其4個(gè)環(huán)境的平均病級(jí)為1.5,含有14個(gè)優(yōu)異等位變異;TM 124多個(gè)環(huán)境表現(xiàn)感病,其4個(gè)環(huán)境的平均病級(jí)為4.25,含有9個(gè)非優(yōu)異等位變異。發(fā)掘白粉病抗性顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)優(yōu)異等位變異有利于小麥抗白粉病分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā),以提高表型選擇的準(zhǔn)確性。

3 討 論

3.1 環(huán)境因素對(duì)白粉病表型鑒定的影響

各種環(huán)境因素(氣候、地塊、管理方式等)均會(huì)對(duì)小麥白粉病表型鑒定產(chǎn)生較大影響,在2021年唐山環(huán)境和2022年唐山環(huán)境中,灌溉方式為淺埋滴灌,水肥管理及時(shí),植株生長(zhǎng)環(huán)境整體較好,外加小麥生長(zhǎng)期間的降雨量少、空氣濕度小等因素影響,群體整體發(fā)病程度較輕,抗病表型個(gè)體數(shù)占比分別為78.09%、83.33%;而在2021年灤州環(huán)境和2022年灤州環(huán)境中,采用多次噴灌方式,夏季高溫導(dǎo)致空氣濕度大,有利于白粉病菌繁殖傳播,群體整體發(fā)病程度較重,抗病表型個(gè)體數(shù)占比分別為42.18%、33.33%,而感病個(gè)體中病級(jí)為5的個(gè)體數(shù)占比分別達(dá)26.53%、22.55%。由此可見(jiàn),環(huán)境因素對(duì)小麥白粉病表型影響較大,而多年多點(diǎn)鑒定有利于降低環(huán)境造成的誤差,在不同環(huán)境中均能檢測(cè)到的小麥白粉病抗性顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)結(jié)果可靠、遺傳穩(wěn)定性較高。

3.2 小麥白粉病抗性的全基因組關(guān)聯(lián)分析

在小麥白粉病抗性的全基因組關(guān)聯(lián)分析中,共檢測(cè)到分布于1 A(3)、1 D、2 A、2 B(4)、2 D(2)、3 A、3 B(2)、4 A(2)、4 D、5 A、5 B(2)、5 D、6 A、6 B、7 B、7 D染色體上的25個(gè)與白粉病抗性顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn),其中在2 B和3 B染色體上各有1個(gè)區(qū)段(位點(diǎn))在多個(gè)環(huán)境中被檢測(cè)到:位于2 B染色體的743.4～781.6 Mb區(qū)段內(nèi)的2 B_743353859、2 B_745699320、2 B_781550737在2022年灤州環(huán)境中被檢測(cè)到,區(qū)段內(nèi)的2 B_751000078在2022年唐山環(huán)境中被檢測(cè)到;位于3 B染色體上的3 B_572684816在2021年灤州環(huán)境和2022年灤州環(huán)境中被檢測(cè)到。

目前在世界范圍內(nèi)報(bào)道了一系列與小麥白粉病抗性相關(guān)的基因,在2 B染色體上正式命名了多個(gè)小麥白粉病抗病基因,包含Pm26、Pm33、Pm42、Pm49、Pm51、Pm52、Pm63、Pm64、Pm68[12-20],但目前均未成功克隆;而目前在3 B染色體上只有1個(gè)小麥白粉病抗病基因被正式命名且成功克隆(Pm41)[21]。

本研究中檢測(cè)到的位于2 B染色體上的區(qū)段2 B_743353859～2 B_781550737與上述已命名的抗病基因中的Pm51相近[16],最小距離為3.95 Mb,推測(cè)本研究結(jié)果與前人結(jié)果相似,為同一位點(diǎn);且該區(qū)段包含了杜習(xí)軍[4]利用小麥660 K芯片檢測(cè)到的一個(gè)位于2 B染色體上的SNP位點(diǎn)AX-110471573(物理位置753837087),也可以認(rèn)為是同一位點(diǎn)。目前已報(bào)道的在3 B染色體上與白粉病抗性相關(guān)的基因位點(diǎn)較少,本研究中位于3 B染色體上的顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)3 B_572684816與該染色體上唯一被命名的白粉病抗性基因Pm41(物理位置429382520)[21]相距143.30 Mb,推測(cè)不是同一位點(diǎn),可能是一個(gè)新位點(diǎn)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)利用小麥16 K高密度SNP芯片對(duì)來(lái)源于我國(guó)華北、華東、華中等地區(qū)共215份小麥種質(zhì)資源進(jìn)行白粉病抗性全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS),檢測(cè)到25個(gè)與小麥白粉病抗性顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn),其中位于2 B染色體上的1個(gè)38.2 Mb的區(qū)段及位于3 B染色體上的1個(gè)位點(diǎn)在多個(gè)環(huán)境中被檢測(cè)到;位于2 B染色體上的區(qū)段與已命名的小麥白粉病抗性基因Pm51距離相近,推測(cè)為同一位點(diǎn),而位于3 B染色體上的位點(diǎn)推測(cè)可能是一個(gè)新位點(diǎn)。以上結(jié)果為小麥白粉病抗病育種提供了重要參考和標(biāo)記資源。