洪繼彪，丁晟琦，常亞青，尹東紅，王許波，宋堅(jiān)

(大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

哈氏刻肋海膽(Temnopleurushardwickii)隸屬于海膽綱(Echinoidea)拱齒目(Camarodonta)刻肋海膽科(Temnopleuridae)刻肋海膽屬(Temnopleurus)[1]，與細(xì)雕刻肋海膽(T.alexandri)的親緣關(guān)系較近[2]，分布于中國(guó)的黃海、渤海、東海舟山群島海域和臺(tái)灣海峽。其殼較低平，呈半球形，最大殼徑為4.5 cm，高約2 cm，步帶狹窄，此間步帶稍隆起(圖1)。

哈氏刻肋海膽棘刺較細(xì)，呈規(guī)則排列，棘一節(jié)深一節(jié)淺，形態(tài)美觀，觀賞性極高，在水族造景中應(yīng)用廣泛，對(duì)水族缸內(nèi)壁藻類(lèi)的控制也有著較好的效果，有利于調(diào)節(jié)水質(zhì)。因此，其觀賞應(yīng)用潛力較大。目前，有關(guān)哈氏刻肋海膽的研究較少，主要集中在其遺傳進(jìn)化和生態(tài)方面[3-4]。國(guó)外有關(guān)哈氏刻肋海膽的養(yǎng)殖文獻(xiàn)也較稀少，僅見(jiàn)Yaguchi等[5]對(duì)該海膽的生殖周期進(jìn)行過(guò)研究。哈氏刻肋海膽種群數(shù)量較少，開(kāi)展哈氏刻肋海膽的人工繁殖，不僅對(duì)生態(tài)環(huán)境的保護(hù)具有積極作用，而且緩解了水族造景等產(chǎn)業(yè)的需求。本研究中，首次探究了哈氏刻肋海膽人工繁育技術(shù)，并觀察其胚胎及幼體發(fā)育過(guò)程，以期為該海膽的遺傳和人工繁育提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用親膽200枚，于2018年9月采自旅順黃泥川海域(圖1)，殼徑為3.0～4.5 cm，活力充沛，體表無(wú)損傷，親膽運(yùn)送至大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)3 d。

圖1 哈氏刻肋海膽形態(tài)Fig.1 Morphology of Temnopleurus hardwickii

1.2 方法

1.2.1 親膽管理 將哈氏刻肋海膽親膽暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，自然光照，水溫為(24.2±1.0)℃，鹽度為29～32。暫養(yǎng)池中24 h充氣，每天換水一次并投喂馬尾藻，換水量為2/3，換水時(shí)緩慢加水以減少對(duì)親膽的刺激。

1.2.2 親膽促熟 通過(guò)投喂充足餌料對(duì)哈氏刻肋海膽親膽進(jìn)行促熟。溫度較低時(shí)，可通過(guò)緩慢升溫促熟，促熟過(guò)程中投喂海帶、裙帶菜、石莼及少量煮熟的貽貝，保證親膽食物充足，使親膽在性腺發(fā)育過(guò)程中有著較好的豐滿度。自然光周期下，每天換水一次，換水量為1/3，輕度充氣，并用虹吸管將親膽所排糞便吸出，溫度控制在23 ℃左右。

1.2.3 受精卵的獲得與觀察 參考王寶鋒等[6]的方法對(duì)海膽進(jìn)行催產(chǎn)。在23.7 ℃水溫下，使用1 mL的注射器，分別從圍口膜處給10枚親膽注射0.5 mol/L的KCl溶液0.4 mL。注射KCl溶液后，將親膽倒扣在500 mL的礦泉水瓶上。親膽排精、產(chǎn)卵后，收集適量活力好的精子加入已經(jīng)準(zhǔn)備好的卵子中，輕輕攪動(dòng)，等待卵子的受精。在顯微鏡下觀察到卵子有極體放出時(shí)，表明該卵子已受精。取1 mL精卵混合液在顯微鏡下觀察受精卵的變化并記錄數(shù)量。受精率(%)計(jì)算公式為

受精率=2細(xì)胞數(shù)量/總卵數(shù)量×100%。

1.2.4 胚胎和幼體發(fā)育觀察 受精卵在水溫23～24 ℃、鹽度29～32下進(jìn)行孵化，受精時(shí)卵密度為60～80枚/mL。胚胎發(fā)育至纖毛囊胚期后上浮于水面，用虹吸法吸取上層囊胚進(jìn)入育苗池進(jìn)行培養(yǎng)，在選育時(shí)也可用孔徑為57 μm的篩絹網(wǎng)在水面上層進(jìn)行篩選。選育后的優(yōu)良胚胎發(fā)育至棱柱幼體時(shí)期時(shí)，開(kāi)始投喂牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)，起始投喂量為每日2 000 cells/mL，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察幼體胃部飽滿情況并逐漸增加投喂量。二腕幼體至四腕幼體時(shí)期，每日投喂量為3 500～8 100 cells/mL；六腕幼體至八腕幼體時(shí)期，每日投喂量逐漸增加至12 500～20 000 cells/mL。在浮游幼體培育過(guò)程中，幼體密度約為0.5 枚/mL，此時(shí)空間適宜，成活率較高。室內(nèi)水溫保持在22～23.3 ℃，鹽度保持在29～32，養(yǎng)殖池中24 h微充氣。在幼體發(fā)育期間，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察幼體發(fā)育過(guò)程，并用電子設(shè)備進(jìn)行拍照，觀察記錄胚胎和幼體的發(fā)育特征及時(shí)間，測(cè)量相關(guān)時(shí)期特征數(shù)據(jù)。各期胚胎和幼體發(fā)育時(shí)間以隨機(jī)樣本中出現(xiàn)該時(shí)期50%的個(gè)體為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 稚膽培育 八腕幼體變態(tài)成為稚膽后，管足開(kāi)始伸出，此時(shí)將培育好的波紋板放入稚膽池中，稚膽通過(guò)管足附著在硅藻板上，開(kāi)始攝食底棲硅藻，纖毛帶上的纖毛活動(dòng)逐漸減弱。每日換水一次，換水量為1/2，保持水質(zhì)清潔，自然光照，微充氣。隨著稚膽的生長(zhǎng)，開(kāi)始投喂海帶、裙帶菜和石莼，每日一次，及時(shí)查看，保證海膽的攝食充足。此時(shí)進(jìn)行網(wǎng)箱養(yǎng)殖，將相同大小的同家系海膽置于同一個(gè)網(wǎng)箱，以防止因食物競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致海膽生長(zhǎng)差距過(guò)大。另外，仍需防范病害的發(fā)生，防止弧菌等病菌滋生，并加強(qiáng)人工管理，勤換水，或進(jìn)行流水養(yǎng)殖。

波紋板附著基的培育：先將水泥池消毒，取潮間帶底棲硅藻，用孔徑為50 μm的篩絹網(wǎng)反復(fù)篩取后加入池水中，再加入用硅酸鈉、過(guò)磷酸鈣和硫酸銨配制的營(yíng)養(yǎng)鹽，將消毒后的波紋板放入池中，充氣，每隔兩天換水一次，如有橈足類(lèi)等敵害生物發(fā)生，可加入敵百蟲(chóng)等藥物控制。

1.2.6 人工繁育3齡海膽生長(zhǎng)指標(biāo)及性腺指數(shù)的測(cè)定 將繁育的稚膽繼續(xù)在實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖3年。于2022年7月9日開(kāi)始，一周內(nèi)先后取3批3齡海膽樣本，包括產(chǎn)卵的51枚和未產(chǎn)卵的39枚，每批樣本30枚。先稱(chēng)量每一枚海膽的活體質(zhì)量，取其平均值，然后解剖取其性腺，稱(chēng)量濕性腺質(zhì)量，取其平均值，再計(jì)算每一批海膽的性腺指數(shù)(IGS)，即

IGS=濕性腺質(zhì)量/活體質(zhì)量×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，采用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 親膽促熟效果

在親膽促熟過(guò)程中，一般來(lái)說(shuō)，體積越大的海膽性腺發(fā)育越好。殼徑在2 cm以上的哈氏刻肋海膽產(chǎn)卵量較大。給親膽注射KCl溶液1.5～5 min后，雌性海膽開(kāi)始產(chǎn)卵，在燈光下可見(jiàn)卵透明且呈細(xì)小球狀體；雄性海膽開(kāi)始排精，精液為白色乳狀液體。說(shuō)明親膽催熟效果較好。

2.2 人工催產(chǎn)及受精卵觀察

在23.7 ℃水溫下，給哈氏刻肋海膽親膽注射KCl溶液1.5～5 min后，親膽開(kāi)始產(chǎn)卵、排精。親膽在產(chǎn)卵、排精時(shí)，管足不停搖擺，生殖孔周?chē)募跓o(wú)規(guī)則擺動(dòng)，所排出的精子和卵細(xì)胞呈細(xì)線狀從多個(gè)生殖孔排出，隨之在海水中散開(kāi)。2018年9月5日共催產(chǎn)10枚親膽，其中4枚親膽產(chǎn)卵，在5倍顯微鏡下可見(jiàn)均黃卵(圖2(a))，帶有極體，易沉，在燈光下可見(jiàn)細(xì)小透明球體；3枚親膽產(chǎn)精子，為細(xì)線狀乳白色液體，排入水體后散成霧狀，在40倍顯微鏡下可見(jiàn)精子呈帶有長(zhǎng)尾的類(lèi)似錐形體(圖2(b))，精子活性好，不停地?zé)o規(guī)則游動(dòng)。取適量精子倒入卵子中進(jìn)行授精，10 min左右后在5倍鏡下可見(jiàn)卵膜(圖2(c))，每枚卵子周?chē)?～5個(gè)精子不停游動(dòng)；受精卵色澤淡黃，外形飽滿，無(wú)不規(guī)則卵，卵膜無(wú)破損；受精率較高，為90.6%～96.4%，平均為93.6%±2.1%。在此后又催產(chǎn)3次(表1)，每次解剖催產(chǎn)成功的親膽和未產(chǎn)卵的海膽共30枚，觀察其性腺發(fā)育情況。

PB—極體；UE—未受精卵；T—尾；H—頭；N—頸；A—頂體；EM—卵膜。PB—polar body；UE—unfertilized egg；T—tail；H—head；N—neck；A—acrosome；EM—egg membrane.圖2 哈氏刻肋海膽的生殖細(xì)胞和受精卵Fig.2 Germ cells and fertilized egg of Temnopleurus hardwickii

表1 哈氏刻肋海膽的催產(chǎn)、受精及孵化Tab.1 Induced to spawn，fertilization and incubation of the Temnopleurus hardwickii

2.3 胚胎發(fā)育過(guò)程

1)卵與受精卵。哈氏刻肋海膽成熟卵細(xì)胞卵徑為(131.0±13.9)μm，呈淡黃色，當(dāng)水中不充氣時(shí)，卵子易沉于水，屬于均黃沉性卵。卵呈橢圓形，光學(xué)顯微鏡下卵膜明顯，且具有卵膜孔(圖3A)。精子進(jìn)入卵細(xì)胞后，卵細(xì)胞周?chē)纬梢粚邮芫?，受精卵卵徑?132.71±4.68)μm(圖3B，表2)。

表2 哈氏刻肋海膽的胚胎和幼體發(fā)育過(guò)程Tab.2 Embryonic and larval development process of Temnopleurus hardwickii

A—卵；B—受精卵；C—2細(xì)胞期；D—4細(xì)胞期；E—8細(xì)胞期；F—16細(xì)胞期；G—囊胚期；H—原腸期；I—棱柱幼體期；J—二腕幼體；K—四腕幼體；L—六腕幼體；M—八腕幼體；N、O—稚膽。A—egg；B—fertilized egg；C—2-cell stage；D—4-cell stage；E—8-cell stage；F—16-cell stage；G—blastula stage；H—gastrula stage；I—prism stage；J—two-armed larva；K—four-armed larva；L—six-armed larva；M—eight-armed larva；N and O—juvenile.圖3 哈氏刻肋海膽胚胎發(fā)育過(guò)程Fig.3 Embryonic development of Temnopleurus hardwickii

2)卵裂期。受精卵經(jīng)50 min左右進(jìn)入卵裂期。受精卵開(kāi)始輻射型卵裂，卵細(xì)胞中部向內(nèi)凹陷，分裂成兩個(gè)相似大小的細(xì)胞(圖3C)，第一次卵裂20 min后進(jìn)入第二次卵裂，受精卵分裂成4個(gè)相似大小的細(xì)胞(圖3D)。此后每經(jīng)30 min 進(jìn)行一次卵裂，歷經(jīng)8細(xì)胞期(圖3E)、16細(xì)胞期(圖3F)。

3)囊胚期。受精卵歷經(jīng)約5 h進(jìn)入囊胚期(圖3G)。囊胚期胚胎是由少數(shù)幾層細(xì)胞圍成的中空球體，胚胎長(zhǎng)度為(121.69±3.61)μm(表2)，約2 h 后，囊胚脫去卵膜，開(kāi)始在水中自主旋轉(zhuǎn)。

4)原腸期。受精卵經(jīng)過(guò)10 h發(fā)育后，胚胎進(jìn)入原腸期(圖3H)。原腸期胚胎長(zhǎng)度為(139.53±9.03)μm(表2)。原腸期開(kāi)始時(shí)，囊胚植物極出現(xiàn)扁平平面，處在植物極的中胚層細(xì)胞開(kāi)始相互脫離，成為單個(gè)細(xì)胞并遷移到囊胚腔中，在植物極附近形成兩簇細(xì)胞團(tuán)。之后，內(nèi)胚層細(xì)胞整體內(nèi)陷并延伸形成原腸腔。

2.4 幼體發(fā)育過(guò)程

1)棱柱幼體。受精卵經(jīng)過(guò)18 h左右發(fā)育至棱柱幼體(圖3I)，幼體體長(zhǎng)為(155.96±12.94)μm(表2)。棱柱幼蟲(chóng)的口葉突出，前端呈弧形。幼蟲(chóng)左右兩側(cè)的三射骨針已長(zhǎng)大，一支伸向幼蟲(chóng)的后端，一支伸至幼蟲(chóng)的前端。此期內(nèi)，消化道未開(kāi)通，尚不能攝食，幼蟲(chóng)趨光性較強(qiáng)，多密聚于水表層。

2)二腕幼體。受精卵經(jīng)過(guò)23 h發(fā)育形成二腕幼體(圖3J)。二腕幼體整體呈三角錐形，其顯著特征為肛門(mén)所在的平面形成兩個(gè)錐形的長(zhǎng)腕，腕內(nèi)有骨針支撐，使腕不能彎曲。二腕幼體體長(zhǎng)為(197.03±16.89)μm(表2)。此時(shí)幼體的腸和胃已基本形成，腸呈細(xì)小管狀，有開(kāi)口，為肛門(mén)。幼體周?chē)睦w毛不停地?cái)[動(dòng)，使幼體在水中游動(dòng)，口上方形成的口前纖毛環(huán)不停地?cái)[動(dòng)。攝食角毛藻時(shí)食管開(kāi)始緩慢蠕動(dòng)，并伴隨胃部和腸的節(jié)律性收縮。到二腕幼體后期，幼體體長(zhǎng)達(dá)到306.15 μm，位于口葉中線的橫枝凸起，頂端形成了前側(cè)腕芽突。

3)四腕幼體。受精卵經(jīng)過(guò)1 d 16 h進(jìn)入四腕幼體期(圖3K)。幼體明顯長(zhǎng)大，體長(zhǎng)為(339.74±24.45)μm(表2)。此期幼體的典型特征是口葉凸起，頂端形成2個(gè)前側(cè)腕，與之前的2個(gè)腕共同構(gòu)成四腕幼體的4個(gè)腕。幼體形態(tài)和內(nèi)部器官發(fā)育較快，胃部進(jìn)一步膨大，攝食量增加，胃部食物清晰可見(jiàn)。

4)六腕幼體。受精卵歷經(jīng)7 d 2 h進(jìn)入六腕幼體(圖3L)，體長(zhǎng)達(dá)到(507.03±31.19)μm(表2)。幼體從前側(cè)腕和口后腕之間的口端面周緣生出2個(gè)后背腕，與之前的4個(gè)腕共同構(gòu)成六腕幼體的6個(gè)腕。胃部膨大呈卵圓形，顏色變深。體壁變厚，后期幼體反口端頂部逐漸變鈍圓。

5)八腕幼體。受精卵歷經(jīng)10 d 16 h進(jìn)入八腕幼體(圖3M)。此階段最后一對(duì)口前腕從前側(cè)腕的內(nèi)側(cè)生出，與之前的6個(gè)腕共同構(gòu)成八腕幼體的8個(gè)腕。幼體體長(zhǎng)為(1 129.62±104.07)μm(表2)。后背腕與前側(cè)腕繼續(xù)生長(zhǎng)變得更加寬大，使幼體體寬增加，與體長(zhǎng)幾乎相等。八腕幼體中期，后背腕與口后腕靠外一側(cè)在與反口端較近的位置出現(xiàn)一條帶狀凸起，其上密布纖毛。反口端頂部變平，兩側(cè)向外擴(kuò)張形成了2個(gè)肉褶。八腕幼體后期，前庭復(fù)合體不斷增大，將幼體的胃向一側(cè)擠壓，后期可見(jiàn)前庭復(fù)合體內(nèi)的初生管足蠕動(dòng)。

6)稚膽。受精卵歷經(jīng)35 d后進(jìn)入稚海膽階段(圖3N、O)。八腕幼體末期，幼體的體壁和腕在水中水解，前庭復(fù)合體中的初生棘長(zhǎng)出體壁，初生觸手伸出與外界接觸，開(kāi)始擺動(dòng)，幼體經(jīng)過(guò)變態(tài)成為稚海膽。稚海膽體長(zhǎng)為(595.89±46.09)μm(表2)，其口面位于原來(lái)幼體的左側(cè)面，反口面位于原來(lái)幼體的右側(cè)面。依靠初生的5只管足，固著在波紋板及池壁上，并且通過(guò)固著開(kāi)始攝食波紋板上附著的底棲硅藻。隨著棘和管足不斷生長(zhǎng)，數(shù)量也在不斷增多，管足隨著水流不停擺動(dòng)，稚海膽的活動(dòng)性增大，在波紋板上可以運(yùn)動(dòng)攝食，此時(shí)稚海膽生長(zhǎng)速度加快，體壁棘和管足仍在不斷生長(zhǎng)，直至外殼布滿棘刺，此后稚海膽基本與親膽外形相似。

2.5 胚胎及幼體的生長(zhǎng)

在23～24 ℃水溫下，通過(guò)測(cè)量胚胎及幼體的體長(zhǎng)，繪制其生長(zhǎng)曲線。在測(cè)量過(guò)程中，使用同一臺(tái)電子顯微鏡，由同一人測(cè)量，每個(gè)時(shí)期測(cè)量的個(gè)體數(shù)量不少于30個(gè)。從圖4可見(jiàn)，海膽胚胎及幼體發(fā)育過(guò)程中，胚胎期卵徑會(huì)稍微縮小，到幼體期則開(kāi)始增大，體長(zhǎng)開(kāi)始增長(zhǎng)，從二腕幼體到四腕幼體，以及六腕幼體到八腕幼體時(shí)，幼體生長(zhǎng)有顯著性差異(P<0.05)；生長(zhǎng)到八腕幼體后，體長(zhǎng)達(dá)到最大，為(1 129.62±104.07)μm，而八腕幼體經(jīng)過(guò)變態(tài)到稚膽時(shí)，體長(zhǎng)則明顯縮小，并有顯著性差異(P<0.05)。

*為該時(shí)期相對(duì)前一時(shí)期生長(zhǎng)有顯著性差異(P<0.05)。*，relatively significant difference in growth is compared from the previous growth stage during this period(P<0.05).圖4 哈氏刻肋海膽胚胎及幼體生長(zhǎng)曲線Fig.4 Embryo and larva growth curve of Temnopleurus hardwickii

2.6 稚膽的培育

稚膽培育2～3月后，體長(zhǎng)達(dá)到0.5～2.0 cm，生長(zhǎng)差異較大，這可能與其基因及攝食情況不同有關(guān)。此期間，應(yīng)加強(qiáng)巡視，保證食物充足和水質(zhì)良好，觀察池底是否起弧菌等病原，仔細(xì)檢查稚膽狀態(tài)，將大小一致的稚膽置入一個(gè)網(wǎng)箱中培育。

2.7 海膽的生長(zhǎng)及性腺指數(shù)

對(duì)3齡人工繁育的哈氏刻肋海膽解剖發(fā)現(xiàn)，雌、雄海膽性腺顏色主要呈橙黃色、黃色和黃綠色。產(chǎn)完卵的雌性海膽性腺多呈淡黃綠色、黃色，在解剖鏡下呈暗黃色且可見(jiàn)細(xì)小的卵細(xì)胞；雄性海膽性腺多呈橙黃色、黃色，在解剖鏡下可見(jiàn)亮黃色。將雌、雄海膽性腺用體積分?jǐn)?shù)為10%的福爾馬林溶液固定在1 mL離心管中，解剖鏡觀察發(fā)現(xiàn)，3種顏色的雌、雄海膽性腺飽滿，呈簇狀球體(圖5)。

A—雌海膽性腺；B—解剖鏡下雌海膽性腺；C—雄海膽性腺；D—解剖鏡下雄海膽性腺；E—取出的性腺，左雌右雄；F—黃色性腺(♂)；G—橙黃色性腺(♂)；H—黃色性腺(♀)；I—黃綠色性腺(♀)；J—黃綠色性腺(♀)；Go—性腺；Ee—卵；Se—精液。A—gonads of female sea urchin；B—anatomical view of gonads of female sea urchin；C—male sea urchin gonads；D—anatomical view of male sea urchin gonads；E—removed gonads，female on the left and male on the right；F—yellow gonad(♂)；G—orange yellow gonad(♂)；H—yellow gonad(♀)；I—yellowish green gonad(♀)；J—yellowish green gonad(♀)；Go—Gonad；Ee—egg；Se—semen.圖5 3齡哈氏刻肋海膽性腺觀察Fig.5 Observation of gonads of the 3 years old Temnopleurus hardwickii

對(duì)3齡人工繁育的哈氏刻肋海膽性腺指數(shù)分3次進(jìn)行取樣測(cè)定，每次隔兩天。計(jì)算結(jié)果表明，3齡哈氏刻肋海膽的平均性腺指數(shù)為7%～12%(表3)，此時(shí)海膽已達(dá)性成熟，注射0.5 mol/L的KCl溶液即可進(jìn)行催產(chǎn)，開(kāi)展人工繁育。

表3 3齡人工繁殖哈氏刻肋海膽的生長(zhǎng)及性腺指數(shù)Tab.3 Growth and gonado-somatic index(GSI)of the 3 years old Temnopleurus hardwickii by artificial reproduction

3 討論

3.1 哈氏刻肋海膽的生殖特征

海膽在生殖過(guò)程中，產(chǎn)卵、排精不僅受水流、溫度等環(huán)境因素的影響，還與月盈月虧有著較大關(guān)系[7]。本研究中所用的哈氏刻肋海膽親本采自大連市黃泥川海域，7—9月份是哈氏刻肋海膽的高產(chǎn)期，9月份達(dá)到最高峰[7]。哈氏刻肋海膽在性腺成熟時(shí)，雌性性腺顏色較深，雄性性腺顏色鮮艷，雌、雄性腺顏色具有明顯差異，這與常亞青等[8]得出的馬糞海膽性腺的顏色亮度值(L*)、紅度值(a*)和黃度值(b*)，在雌、雄海膽間具有極顯著性差異的研究結(jié)果相似。哈氏刻肋海膽卵子直徑為131 μm左右，形態(tài)特征與中間球海膽等其他海膽卵子相似，在排卵時(shí)極體已經(jīng)排出[9]，此時(shí)向卵細(xì)胞中加入適量精液，即可開(kāi)始人工授精，在光學(xué)顯微鏡下觀察到每個(gè)卵周?chē)?個(gè)精子，此時(shí)精子適量[10]。受精后的卵細(xì)胞可見(jiàn)類(lèi)似小圓點(diǎn)的第二極體放出，特征明顯。在養(yǎng)殖過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，換水、溫差過(guò)大和干露情況下均會(huì)發(fā)生零星產(chǎn)卵現(xiàn)象[11]。

3.2 哈氏刻肋海膽胚胎及幼體發(fā)育特征

哈氏刻肋海膽生長(zhǎng)速度較快，胚胎時(shí)間短。本研究中，哈氏刻肋海膽受精后50 min時(shí)進(jìn)入卵裂期，快于29.22～30.18 ℃下的紫海膽(Anthocidariscrassispina)進(jìn)入卵裂期的時(shí)間(1 h 30 min)[12]，稍慢于25.8～27.5 ℃下的白棘三列海膽(Teipneustesgratilla)進(jìn)入卵裂期的時(shí)間(40 min)[13]，快于17～21 ℃下的馬糞海膽(Hemicentfotuspulcherrimus)[14]和25～26 ℃下的高腰海膽(Mespiliaglobulus)[6]進(jìn)入卵裂期的時(shí)間(分別為1 h 30 min和1 h)。哈氏刻肋海膽分別在受精后5、10 h時(shí)進(jìn)入囊胚期和原腸期，與20～24 ℃下的光棘球海膽(Mesocentrotusnudus)[15]和中間球海膽(S.intermedius)[16]進(jìn)入囊胚期的時(shí)間接近，與白棘三列海膽[13]進(jìn)入囊胚期和原腸期的時(shí)間接近，慢于紫海膽[12]，但快于馬糞海膽[14]和高腰海膽[6]。哈氏刻肋海膽進(jìn)入棱柱期的時(shí)間(18 h)快于馬糞海膽[14]和高腰海膽[6](表4)。

在幼體發(fā)育時(shí)期，哈氏刻肋海膽進(jìn)入四腕幼體、六腕幼體、八腕幼體的時(shí)間分別為1 d 16 h、7 d 2 h和10 d 16 h，與白棘三列海膽進(jìn)入四腕幼體的時(shí)間接近，但整體進(jìn)入速度快于白棘三列海膽[13]、馬糞海膽[14]、光棘球海膽[15]和中間球海膽[16](表4)。

表4 哈氏刻肋海膽與其他海膽胚胎發(fā)育時(shí)序比較Tab.4 Comparison of embryonic developmental timing of Temnopleurus hardwickii with other sea urchins

在外形上，哈氏刻肋海膽在胚胎期時(shí)，細(xì)胞期、桑葚期、囊胚期、原腸期的形態(tài)與光棘球海膽、中間球海膽、高腰海膽等[6，15-16]除卵徑外并無(wú)太大的區(qū)別；在棱柱幼體時(shí)，哈氏刻肋海膽一側(cè)形成平面，原腸分化成胃、口和腸，出現(xiàn)了后口腕，兩側(cè)骨針開(kāi)始生長(zhǎng)，這與馬糞海膽[14]、中間球海膽[16]相似；在二腕幼體時(shí)，兩側(cè)骨針生長(zhǎng)形成弧形頂，這與高腰海膽[6]、紫海膽[12]和白棘三列海膽[13]類(lèi)似，而中間球海膽[16]、光棘球海膽[15]和馬糞海膽兩側(cè)骨針相交合形成頂尖。四腕幼體時(shí)，哈氏刻肋海膽骨針斷裂，形成橢圓形頂，出現(xiàn)兩個(gè)前側(cè)腕，胃部食物明顯，口腕伸長(zhǎng)，器官更加明顯，這與高腰海膽[6]、紫海膽[12]比較相似，比中間球海膽[16]、光棘球海膽[15]和白棘三列海膽[13]的腕寬。在六腕幼體時(shí)，哈氏刻肋海膽后背腕長(zhǎng)出，體壁加厚，胃顏色加深，這與高腰海膽[6]、紫海膽[12]相似，腕繼續(xù)變寬，骨針繼續(xù)斷裂變成鈍圓形，中間球海膽[16]、光棘球海膽[17]和白棘三列海膽[13]的骨針同樣斷裂，形成鈍圓頂；在八腕幼蟲(chóng)時(shí)，哈氏刻肋海膽口前腕生出，其他腕繼續(xù)增大，前庭復(fù)合體不斷增大，將胃擠向一側(cè)，可見(jiàn)初生管蠕動(dòng)，這與高腰海膽[6]、中間球海膽[16]相似(表5)。可見(jiàn)，從二腕幼體到八腕幼體，哈氏刻肋海膽的腕比其他一些海膽寬，不同種類(lèi)的海膽腕的增長(zhǎng)不盡相同，腕的生長(zhǎng)時(shí)期也各不相同，直到后期附著在硅藻板，各個(gè)時(shí)期的海膽腕的形狀和生長(zhǎng)速度也存在一定的差異。

表5 哈氏刻肋海膽與其他海膽體長(zhǎng)發(fā)育比較Tab.5 Comparison of body length development of Temnopleurus hardwickii with other sea urchins μm

3.3 哈氏刻肋海膽的繁殖生物學(xué)

在哈氏刻肋海膽?zhàn)B殖過(guò)程中，水質(zhì)、餌料和人工管理等方面顯得尤為重要。在哈氏刻肋海膽親膽促熟過(guò)程中，通過(guò)慢升溫、保證餌料充足等手段均可促熟，使性腺更加豐滿，與中間球海膽的促熟相似[16]。梁其旭等[10]在2021年紫海膽的人工育苗中指出，也可通過(guò)投喂牡蠣等肉類(lèi)食物進(jìn)行催熟。海膽催產(chǎn)的方法較多，包括陰干、流水、電刺激和滲透壓等，在實(shí)際操作過(guò)程中，較常用的還是KCl溶液注射法[16]。海膽是否能夠產(chǎn)出生殖細(xì)胞，關(guān)鍵在于性腺的發(fā)育程度，哈氏刻肋海膽性腺形態(tài)和顏色與中間球海膽等稍有不同，雌、雄海膽的性腺顏色亦有不同，這可能是由于雌、雄性腺中組成成分不同導(dǎo)致的[19]。在水溫23～24 ℃、鹽度29～32條件下，哈氏刻肋海膽能夠正常生長(zhǎng)，附板后其以底棲硅藻為食，之后以海帶等褐藻為食，哈氏刻肋海膽為雜食性，對(duì)綠藻(如石莼等)和肉類(lèi)亦食，這與大連紫海膽食性相似[20]。在繁育過(guò)程中，病害對(duì)哈氏刻肋海膽也有較大的威脅，如黑嘴病、弧菌病等。因此，在哈氏刻肋海膽繁殖過(guò)程中，不僅要精準(zhǔn)地控制繁殖條件和保持餌料的充足，而且要防止病害的發(fā)生。

4 結(jié)論

1)在水溫23～24 ℃、鹽度29～32、海膽幼體培育密度為0.5 ind./mL、投喂餌料牟氏角毛藻的條件下，可以實(shí)現(xiàn)在室內(nèi)對(duì)哈氏刻肋海膽的人工育苗，并進(jìn)行大量增殖。哈氏刻肋海膽幼體培育周期較短，從受精卵到八腕幼體僅需要10 d左右，餌料投喂成本低，生長(zhǎng)周期快，人工管理較為容易，易于大量繁殖。

2)使用0.5 mol/L的KCl溶液催產(chǎn)效果較好。在促熟過(guò)程中，投喂海帶、裙帶菜及少量煮熟的貽貝等對(duì)哈氏刻肋海膽的促熟效果較好。在胚胎及幼體發(fā)育過(guò)程中，從四腕幼體時(shí)體長(zhǎng)顯著增長(zhǎng)，而從八腕幼體變態(tài)成稚膽時(shí)，體長(zhǎng)又顯著縮小。在稚膽的培育中，哈氏刻肋海膽生長(zhǎng)顯著，偏好海帶和裙帶菜，需要保證餌料充足，將大小相同的海膽置于同一網(wǎng)箱中飼養(yǎng)，以減小食物競(jìng)爭(zhēng)。

3)哈氏刻肋海膽的大量繁殖有利于緩解對(duì)其他地區(qū)供應(yīng)的問(wèn)題，經(jīng)過(guò)人工繁育的哈氏刻肋海膽生命力增強(qiáng)，從而減少了運(yùn)輸途中的死亡率。哈氏刻肋海膽的人工繁育成功，極大地緩解了自然捕撈的壓力，為保護(hù)自然野生種和促進(jìn)生態(tài)建設(shè)及提高經(jīng)濟(jì)效益具有一定的積極作用。