◎ 肖玉梅，劉 恬，吳源益，楊 艷，楊 懿

（西南醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院，四川 瀘州 646000）

趕黃草學名為扯根菜，是虎耳草科扯根菜屬植物，扯根菜的嫩芽部分也可作為蔬菜食用[1]。其主要分布于東北、華北、華南、西南等地，是苗族民間用于預防治療肝病的常用中草藥，被譽為“神仙草”[2]。民間以全草入藥，性甘、平，歸肝經(jīng)、腎經(jīng)，除濕利水，清熱解毒，祛瘀止痛，主治黃疸、水腫、經(jīng)閉、跌打損傷等。以其為原料的單方制劑在臨床中多用于治療慢性乙肝、急性病毒性肝炎等疾病[3-5]，在治療、保護肝損傷等方面也有較多研究報道[6-9]。2020 年6 月2 日，國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布關于新食品原料的國家公告及解讀[10]，正式批準趕黃草的莖和葉為新食品原料，這為進一步開發(fā)利用趕黃草提供了契機。趕黃草中的主要活性成分為有機酸類和黃酮類等，其中穩(wěn)定存在的有機酸類成分為沒食子酸[2,11]。沒食子酸又名五倍子酸、棓酸，化學名稱為3,4,5-三羥基苯甲酸（C7H605），為白色或淡黃色針狀結晶或粉末，通常以一水合物的形式存在[12]。沒食子酸具有多種生物活性，如抗菌[13]、抗病毒[14]、抗炎、清除自由基和預防心血管疾病[15-16]、抗氧化[17-18]、抗癌[19-20]、預防糖尿病[21-22]等，有著廣闊的應用前景。因此，檢測趕黃草中的沒食子酸含量對于評估趕黃草品質(zhì)具有重要意義。

已有研究者建立不同的分析方法檢測趕黃草等樣品中沒食子酸含量。在樣品提取方面，有研究[23]建立了回流法、超聲法、冷浸法3 種方法提取趕黃草中的沒食子酸，以沒食子酸含量為指標，采用反相高效液相色譜法測定提取液中沒食子酸的含量，分別比較回流法、超聲法和冷浸法3 種提取方法對趕黃草中沒食子酸的提取效果，結果表明，3 種提取方法的提取效率分別為1.98、1.67 和0.86 mg·g-1。在檢測方面，THOMAS 等[24]建立了同時測定辣木乙醇和水葉提取物中沒食子酸、槲皮素和蘆丁的高效薄層色譜法。劉文等[25]建立了測定余甘子中沒食子酸的反射鋸齒薄層掃描法。薄層掃描法前處理要求低，可同時分析多個樣品，但由于制板、點樣、展開等操作的差異，穩(wěn)定性較差。胡楊等[26]建立高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）測定趕黃草及醇提物中沒食子酸的含量。LI 等[27]采用高效液相色譜法測定茶酒中兒茶素和沒食子酸的含量，結果表明茶酒中兒茶素和沒食子酸含量較高。此外，發(fā)酵后茶汁的兒茶素和沒食子酸含量會下降，其中，沒食子酸含量下降13.56%。

高效液相色譜法具有選擇性好、重現(xiàn)性好、靈敏度高等優(yōu)點，是應用于沒食子酸檢測的最普遍方法，但需要對樣品進行前處理，因檢測沒食子酸樣品的時間較長，還需要優(yōu)化前處理條件。SUN 等[28]建立了液相色譜-質(zhì)譜法應用于大鼠口服山楂水提取物后的藥代動力學研究。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)法靈敏度高，選擇性強，不依賴峰與峰之間的分離度，信號采集時間短，為分析沒食子酸提供了可靠方法，但對樣品前處理的要求較高，檢測成本高。申銅飛等[29]建立氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定藏青果中沒食子酸的含量。氣相色譜-質(zhì)譜法分離性能和檢測性能高，分析時間相對較快，但檢測結果會由于樣品提取方法不同而導致沒食子酸的分析結果受到影響。ZHAN 等[30]采用近紅外光譜結合多元分析對芍藥中沒食子酸、兒茶素、白花素和芍藥甙進行定量分析，考察對不同地區(qū)樣品進行分類的可行性，開發(fā)并驗證了一種新的高效液相色譜方法，以分析芍藥中的沒食子酸、兒茶素、白芍素和芍藥甙作為參考。采用偏最小二乘法、主成分回歸法和逐步多元線性回歸法對回歸模型進行標定。近紅外光譜法對于樣品中沒食子酸的前處理簡單、檢測快速方便，可以作為半定量分析法用于大規(guī)模篩查。張澤宇等[31]建立測定地榆中沒食子酸含量的高效毛細管電泳法。翟海云等[32]建立了測定沒食子酸的毛細管電泳高頻電導法。毛細管電泳法能夠在短時間內(nèi)測定沒食子酸的含量，具有快速、高效的特點，但由于電滲會因樣品組成而變化，因而該法重現(xiàn)性較差。綜上，沒食子酸的測定方法多種多樣，各有優(yōu)缺點，其中，高效液相色譜是最常用于檢測沒食子酸的方法[33-34]，具有高效、靈敏、經(jīng)濟等優(yōu)點。

趕黃草的主要食用方式為泡飲。研究表明，沖泡條件對茶葉中溶出物質(zhì)的含量存在影響[35]，例如茶多酚的含量。茶葉泡制的持續(xù)時間、泡茶所用水的溫度和沖泡茶葉的頻率次數(shù)會對茶湯中活性物質(zhì)茶多酚的含量有直接影響，當延長洗茶的時間，茶多酚的溶出量會快速增加；當升高洗茶的溫度，茶多酚的溶出量也會有不同程度的增加，用沸水泡茶會更利于茶多酚的溶出。因此，正確選擇和把握科學的泡茶方法可以充分溶出茶多酚等茶葉中的有益成分，最大限度發(fā)揮茶葉本身的健康價值。已有研究測得趕黃草中沒食子酸含量為0.213～13.990 mg·g-1[26,36-38]，然而，目前尚無研究比較不同沖泡條件對趕黃草中沒食子酸溶出量的影響。

綜上，本研究擬建立測定趕黃草中沒食子酸含量的高效液相色譜法，評估趕黃草中沒食子酸在不同沖泡條件下的溶出量，為更好地開發(fā)趕黃草產(chǎn)品提供技術支持和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

趕黃草購自瀘州盛邦中藥材研究有限公司。沒食子酸標準品（HPLC ≥98%），購自四川省維克奇生物科技有限公司。乙腈、甲醇和磷酸（85%～90%）均為色譜純，購自上海麥克林生化有限公司。實驗室用超純水由Milli-Q 凈化系統(tǒng)制備（18 MΩ·cm，德國默克公司）。

安捷倫1260 高效液相色譜儀（安捷倫科技公司，德國沃爾德布?。?，配有1260 Quat Pump VL、G7129A 1260 自動取樣器和G7114A 1260 紫外檢測器。試驗中使用的其他儀器包括SPECTROstar Nano 高通量紫外分光光度計（廣州伯齊生物科技有限公司）、（Toruńska 5, 26-600，波蘭拉多姆）、5430R 離心機（Eppendorf AG, 22331，德國漢堡）、SB-800 DTD超聲波清洗機（寧波森茲生物科技有限公司，中國寧波）、FCD-2000 Serials 恒溫鼓風干燥箱(上海瑯玕試驗設備有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制

沒食子酸標準溶液（1.00 mg·mL-1）：稱取一定量沒食子酸標準品，溶解在甲醇中配制濃度為1.00 mg·mL-1的標準儲備液，密封并儲存于4 ℃冰箱。

1.2.2 樣品處理

在方法建立階段，參考王星月等[39]提取趕黃草中沒食子酸的方法，分別稱取10 mg 干燥的趕黃草花、莖和葉粉末至15 mL 離心管內(nèi)，添加10 mL 50%甲醇水超聲30 min，用0.45 μm 微孔濾膜過濾后進樣測定。

為測定趕黃草中沒食子酸在不同沖泡條件下的溶出量，參考茶葉的泡制條件[40]，取趕黃草葉、莖和花各100 mg，分別用5 mL 不同溫度的超純水浸泡5～60 min，浸泡液經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后進樣測定。

1.2.3 高效液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）（安捷倫科技公司，美國）；柱溫：35 ℃；流動相：甲醇:乙腈:0.2%磷酸溶液（8:5:87，V:V）；流速：0.9 mL·min-1；紫外檢測波長：264 nm。

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜條件優(yōu)化

測定沒食子酸所用HPLC 條件采用文獻報道的方法[41]，并對其進行優(yōu)化。首先通過紫外分光光度計掃描10 μg·mL-1沒食子酸標準溶液在220～1 000 nm 的紫外光譜，確定沒食子酸的最大吸收波長為264 nm。為了分離干擾物，保證靈敏度并減少運行時間，對流動相、柱溫和流速進行優(yōu)化。對流動相的比例進行優(yōu)化，流動相主要為甲醇、乙腈和0.2%磷酸，確定最佳流動相比例。當甲醇體積比為3%～10%時，沒食子酸的保留時間縮短，峰形變差，和基質(zhì)中干擾物間的分離度變差；在甲醇體積為8%時沒食子酸的峰形最好，且與其他雜質(zhì)的分離效果最好。在乙腈體積比為3%～7%時，沒食子酸的保留時間縮短，峰形變差，與雜質(zhì)的分離度變差；在乙腈體積為5%時，沒食子酸的峰形最好，且與雜質(zhì)的分離效果最好。最終采用流動相為甲醇:乙腈:0.2%磷酸溶液=8:5:87（V:V）。對25 ～40 ℃柱溫進行優(yōu)化，根據(jù)峰面積、保留時間和分離度確定最佳柱溫溫度，結果表明：在35 ℃下沒食子酸的峰形最好，與雜質(zhì)的分離度最高，故選擇柱溫35 ℃。對0.8 ～1.2 mL·min-1流速進行優(yōu)化，結果表明：隨著流速增快，保留時間縮短，但峰面積降低，在0.9 mL·min-1時，沒食子酸的峰形和保留時間均較好。優(yōu)化后的高效液相色譜條件如下：流動相：甲醇:乙腈:0.2%磷酸水溶液（8:5:87，V:V）；柱溫：35 ℃；流速：0.9 mL·min-1。

2.2 方法驗證

2.2.1 線性范圍、檢出限與定量限

用超純水稀釋對照品溶液，配制濃度分別為0.005 μg·mL-1、0.010 μg·mL-1、0.020 μg·mL-1、0.050μg·mL-1、0.100 μg·mL-1、0.200 μg·mL-1、0.500μg·mL-1、1.00 μg·mL-1、2.00 μg·mL-1、5.00μg·mL-1和10.0 μg·mL-1的沒食子酸標準溶液系列，進樣10 μL 測定。以標準溶液濃度對峰面積進行線性回歸，繪制標準曲線，得沒食子酸在0.005～10μg·mL-1線性范圍的回歸方程：y = 31.439x - 0.754 3（r=0.999 8，n=11）。根據(jù)信噪比（S/N）=3 得出檢出限（Limit of Detection，LOD）為3.77 ng·g-1，根據(jù)信噪比（S/N）=10 得出定量限（Limit of Quantif ication，LOQ）為12.441 ng·g-1。結果如表1 所示。

表1 沒食子酸標準曲線方程、線性范圍、相關系數(shù)及方法檢出限表

2.2.2 方法準確度與精密度試驗

分別向10 mg 趕黃草粉末中添加200 μg·g-1、440μg·g-1和850 μg·g-1沒食子酸來進行加標回收試驗，以評估方法的準確度與精密度。表2 為本方法的回收率和精密度(n=3)表，由表2 可知，沒食子酸的加標回收率為93.2%～98.2%。通過在同一天分析3 個濃度的趕黃草加標樣品來評估方法的日內(nèi)精密度，并通過連續(xù)3 d 分析這3 個濃度的趕黃草加標樣品來評估方法的日間精密度。結果表明：日內(nèi)和日間相對標準偏差分別為3.07%～7.05%和2.27%～3.74%。圖1為沒食子酸標準溶液色譜圖、趕黃草樣品色譜圖和趕黃草加標樣品色譜圖。

圖1 沒食子酸標準溶液色譜圖、趕黃草樣品色譜圖和趕黃草加標樣品色譜圖

表2 本方法的回收率和精密度 (n=3)表

2.3 實際樣品測定

為評估不同沖泡條件對趕黃草中沒食子酸溶出量的影響，參考茶葉的泡制條件[40]，取趕黃草葉、莖和花各100 mg，分別用5 mL 的25 ℃、80 ℃和90 ℃超純水浸泡5 min、10 min、20 min、30 min 和60 min，浸泡液經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后用所建高效液相色譜法檢測。結果如圖2 所示，經(jīng)超純水沖泡后，趕黃草的葉、莖和花中沒食子酸溶出量分別為91 ～2 478μg·g-1，118 ～616 μg·g-1和116 ～787 μg·g-1。趕黃草的葉在80 ℃沖泡60 min 溶出的沒食子酸含量最高；不同溫度下沒食子酸的溶出量均隨著沖泡時間增加而增加；80 ℃沖泡后溶出的沒食子酸量最高，可能是因為隨著溫度增加，沒食子酸在水中的溶出效率升高，但部分溶出的沒食子酸在90 ℃高溫下發(fā)生分解。趕黃草的莖在90 ℃泡制20 min 所得沒食子酸含量最高；在25 ℃和80 ℃超純水中溶出的沒食子酸含量隨著時間的增加有增加趨勢；在90 ℃超純水中沖泡20 min時沒食子酸溶出量達到最高，隨后含量降低。趕黃草的花在90 ℃超純水中沖泡60 min 后溶出的沒食子酸含量最高，不同溫度下沒食子酸溶出量均隨著時間增加而增加。趕黃草的葉、莖和花的沖泡結果均提示80℃沖泡后溶出的沒食子酸量較高，25 ℃沖泡后溶出的沒食子酸含量較低，而90 ℃沖泡后溶出的沒食子酸含量不穩(wěn)定。

圖2 不同沖泡條件對趕黃草的葉、莖和花中沒食子酸溶出量的影響圖

3 結論

本研究建立了測定趕黃草中沒食子酸的高效液相色譜法，該法準確、可靠、穩(wěn)定，可用于趕黃草的質(zhì)量評估。此外，本文比較了趕黃草的葉、莖和花經(jīng)25 ℃、80 ℃和90 ℃超純水沖泡5～60 min 溶出的沒食子酸含量，發(fā)現(xiàn)趕黃草的葉經(jīng)超純水在80 ℃沖泡60 min 后溶出沒食子酸含量最高，該結果能夠為企業(yè)更好地開發(fā)利用趕黃草提供技術依據(jù)，為消費者選擇趕黃草產(chǎn)品和泡飲方式提供數(shù)據(jù)支撐。