丁祝進(jìn),崔虎軍,谷昭天,趙曉恒,程漢良

( 1.江蘇海洋大學(xué) 海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院,江蘇 連云港 222005; 2.江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 連云港 222005; 3.江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 連云港 222005 )

魚類的免疫系統(tǒng)由非特異性免疫和特異性免疫組成,包括免疫組織和器官、免疫細(xì)胞及免疫因子等。魚類免疫細(xì)胞主要有兩種類型:一類是淋巴細(xì)胞,主要參與特異性免疫應(yīng)答;另一類是吞噬細(xì)胞,作為非特異性和特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分,在抵御病原體侵襲方面發(fā)揮著非常重要的作用。巨噬細(xì)胞是由單核細(xì)胞衍生而來(lái)的白細(xì)胞,主要是以固定或游離細(xì)胞的形態(tài)對(duì)細(xì)胞殘片和病原體進(jìn)行吞噬、殺傷及消化,并激活淋巴細(xì)胞等其他免疫細(xì)胞,以抵御病原體感染從而保護(hù)生物體。魚類巨噬細(xì)胞可被不同刺激物誘導(dǎo),分化成表型和功能具有顯著性差異的M1型和M2型巨噬細(xì)胞,不同類型巨噬細(xì)胞具有特定的標(biāo)記物,筆者將對(duì)魚類巨噬細(xì)胞通用型、M1型和M2型標(biāo)記物的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,相關(guān)標(biāo)記物見表1。

表1 部分已報(bào)道的魚類巨噬細(xì)胞標(biāo)記物Tab.1 Some of the fish macrophage markers reported

1 巨噬細(xì)胞的通用標(biāo)記物

巨噬細(xì)胞是一種可塑性較高的免疫細(xì)胞,參與機(jī)體的多種免疫學(xué)功能。魚類巨噬細(xì)胞在未分化前,具有多種典型的標(biāo)記物,稱為巨噬細(xì)胞的通用標(biāo)記物,如巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體蛋白等。通用標(biāo)記物可介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的多種免疫功能,并可用于魚類巨噬細(xì)胞的分選與鑒定,具有重要的研究意義。

集落刺激因子(CSF)是一類能刺激多能造血干細(xì)胞和不同發(fā)育階段造血祖細(xì)胞增殖分化,并在固定培養(yǎng)基中形成相應(yīng)細(xì)胞集落的細(xì)胞因子。研究顯示,部分集落刺激因子可以動(dòng)員中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞遷移、分化和增殖,并增強(qiáng)其吞噬功能,稱為粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF,又稱CSF-1),最初發(fā)現(xiàn)于血清、尿液等體液中,主要由單核-巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等分泌產(chǎn)生。巨噬細(xì)胞集落刺激因子在促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞生存、增殖、分裂和骨、胚胎的形成等多方面起到重要作用[27]。草魚巨噬細(xì)胞集落刺激因子與白細(xì)胞介素-4/13(IL-4/13)同源物可以協(xié)同促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖[28]。金魚體內(nèi)注射巨噬細(xì)胞集落刺激因子可增加血液中循環(huán)單核細(xì)胞的數(shù)量,且在原代金魚巨噬細(xì)胞培養(yǎng)中持續(xù)添加重組巨噬細(xì)胞集落刺激因子,可以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)并延長(zhǎng)巨噬細(xì)胞的存活時(shí)間,并增強(qiáng)長(zhǎng)期培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā)活性[29]。金魚巨噬細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞集落刺激因子表現(xiàn)出濃度依賴性的趨化反應(yīng)及吞噬活性增強(qiáng),但該效應(yīng)在培養(yǎng)基中添加巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體后受到抑制[30]。因此,魚類巨噬細(xì)胞集落刺激因子在促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖、維持巨噬細(xì)胞體外穩(wěn)定培養(yǎng)、延長(zhǎng)巨噬細(xì)胞存活時(shí)間、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞免疫活性等方面都發(fā)揮著重要作用。

巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體是巨噬細(xì)胞的通用標(biāo)記物[1],屬于生長(zhǎng)因子受體家族,與巨噬細(xì)胞集落刺激因子結(jié)合后發(fā)生二聚化或多聚化,從而激活一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程,對(duì)巨噬細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化等具有重要作用。在正常情況下,巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體以跨膜蛋白的形式分布于細(xì)胞膜上,巨噬細(xì)胞集落刺激因子與其受體結(jié)合發(fā)揮著多種生物學(xué)效應(yīng),可以延長(zhǎng)成熟巨噬細(xì)胞的壽命,增強(qiáng)正常巨噬細(xì)胞的生物學(xué)功能,參與多種與非造血組織、器官、系統(tǒng)相關(guān)的生長(zhǎng)和發(fā)育,并影響著與之相關(guān)的疾病發(fā)生[31]。

巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體在多種魚類中都已克隆、鑒定,并作為巨噬細(xì)胞標(biāo)記物進(jìn)行應(yīng)用[32]。金頭鯛巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體mRNA基因雖然在鰓、肝臟、脾臟和頭腎等不同免疫組織中均有表達(dá),但其表達(dá)僅限于單核/巨噬細(xì)胞譜系,且其表達(dá)可能受巨噬細(xì)胞激活階段的影響[2]。金魚巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體抗體可特異性識(shí)別單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及其祖細(xì)胞,單核細(xì)胞中始終存在巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體,并且在分化為巨噬細(xì)胞后也持續(xù)高表達(dá),表明其是金魚巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)記物[3]。香魚巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體基因也主要在頭腎單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、脾臟和頭腎中表達(dá),并且鰻弧菌(Vibrioanguillarum)感染后表達(dá)顯著上調(diào),表明其參與調(diào)控香魚巨噬細(xì)胞的吞噬功能[4]。草魚巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體基因在單核/巨噬細(xì)胞中高表達(dá),而在其他類型的白細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到,表明其可作為草魚巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)記[5]。草魚巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體基因的敲除不僅會(huì)導(dǎo)致單核/巨噬細(xì)胞處于抑炎狀態(tài),也會(huì)降低單核/巨噬細(xì)胞的吞噬活性。此外,研究表明,巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體基因敲除會(huì)干擾斑馬魚胚胎至成魚巨噬細(xì)胞的發(fā)育,從而使斑馬魚幼魚表現(xiàn)出系統(tǒng)性巨噬細(xì)胞缺失[33]。也有研究表明,魚類巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞譜系中特異性高表達(dá),并且對(duì)巨噬細(xì)胞的吞噬功能具有顯著的調(diào)控作用,因此可以作為魚類巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)記物。

2 巨噬細(xì)胞的極化及相應(yīng)標(biāo)記物

單核(巨噬)細(xì)胞和中性粒細(xì)胞是魚類中兩類重要的吞噬細(xì)胞。魚類單核細(xì)胞與哺乳動(dòng)物中類似,從血管遷移到各種組織中分化發(fā)育為巨噬細(xì)胞,魚類巨噬細(xì)胞不僅在非特異性免疫中具有吞噬和殺傷功能,在特異性免疫中作為抗原呈遞細(xì)胞也發(fā)揮著重要作用。硬骨魚類的細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-13和γ-干擾素與巨噬細(xì)胞激活及分化有關(guān),白細(xì)胞介素-1、γ-干擾素等活化巨噬細(xì)胞后,不僅可以通過(guò)分泌殺傷性物質(zhì)殺死靶細(xì)胞或病原體,還可以通過(guò)分泌白細(xì)胞介素-1、γ-干擾素、腫瘤壞死因子-α等細(xì)胞因子來(lái)增強(qiáng)自身的免疫功能。通過(guò)類比T輔助細(xì)胞1和T輔助細(xì)胞2極化的概念,根據(jù)巨噬細(xì)胞對(duì)不同環(huán)境刺激的反應(yīng),可將其分為表型和功能不同的M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞[34]。

γ-干擾素誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞可分泌大量炎癥因子,能夠抗血管形成、抗膠原蛋白合成及清除病原體,并與動(dòng)脈硬化、胰島素抵抗等代謝性疾病相關(guān),被稱為經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞[35-38]。M2型巨噬細(xì)胞主要參與炎癥消除[37],抑制T細(xì)胞的增殖和活化,有助于組織再生[39]。M2型巨噬細(xì)胞又可分為M2a、M2b、M2c 3種亞型[40]。M2a型巨噬細(xì)胞主要由白細(xì)胞介素-4/13誘導(dǎo),也稱為愈合性巨噬細(xì)胞,可以產(chǎn)生多種抗炎因子,從而抑制炎癥反應(yīng)并促進(jìn)血管生成[41]。M2b巨噬細(xì)胞被Toll樣受體配體或白細(xì)胞介素-1受體激動(dòng)劑等免疫復(fù)合物及凋亡細(xì)胞聯(lián)合誘導(dǎo)后形成,具有抑制急性炎癥反應(yīng)、促進(jìn)Th2免疫及體液免疫發(fā)生的作用。M2c巨噬細(xì)胞由白細(xì)胞介素-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)后形成,能夠抑制炎性反應(yīng)、促進(jìn)組織重塑[41-42]。

2.1 M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物

脂多糖、γ-干擾素和巨噬細(xì)胞集落刺激因子等刺激后極化的巨噬細(xì)胞稱為炎癥性巨噬細(xì)胞或M1型巨噬細(xì)胞。脂多糖通過(guò)哺乳動(dòng)物Toll樣受體4激活核因子κB(NFκB)、激活蛋白-1(AP-1)等信號(hào)因子,從而誘導(dǎo)下游γ-干擾素和腫瘤壞死因子-α表達(dá),并產(chǎn)生M1型巨噬細(xì)胞的表型特征[43]。魚類中的研究表明,體外脂多糖刺激后會(huì)引起巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)、產(chǎn)生一氧化氮自由基并誘導(dǎo)促炎型細(xì)胞因子分泌[44]。此外,魚類γ-干擾素單獨(dú)或與脂多糖聯(lián)合刺激都會(huì)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能,引起呼吸爆發(fā),并誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-12和腫瘤壞死因子-α等促炎性細(xì)胞因子及多種趨化因子表達(dá)[45]。目前,已報(bào)道的魚類M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物包括誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6、C-X-C型趨化因子11aa和C-X-C型趨化因子受體3.1等趨化因子及受體。

2.1.1 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶

一氧化氮合酶(NOS)是一種同工酶,分布于巨噬細(xì)胞、神經(jīng)吞噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞中。哺乳動(dòng)物一氧化氮合酶有3種亞型:一是正常狀態(tài)下表達(dá)的神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS);二是內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS);三是損傷后誘導(dǎo)表達(dá)的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶,該亞型是由2個(gè)鈣調(diào)蛋白和2個(gè)一氧化氮合酶連接構(gòu)成的四聚體[46]。

系統(tǒng)發(fā)育表明,誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因在鯉與高等脊椎動(dòng)物中高度同源,推測(cè)其與哺乳動(dòng)物誘導(dǎo)型一氧化氮合酶相似,可以作為魚類M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物[6]。鯉頭腎巨噬細(xì)胞被脂多糖刺激時(shí)會(huì)極化產(chǎn)生M1型巨噬細(xì)胞表型,且轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因表達(dá)顯著上調(diào)。在大黃魚腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)的促炎性巨噬細(xì)胞極化中,誘導(dǎo)型一氧化氮合酶等炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)顯著上調(diào),并引起一氧化氮產(chǎn)生及呼吸爆發(fā)[7]。重唇魚在肝臟表達(dá)抗菌肽2 (LEAP-2)單獨(dú)或與脂多糖聯(lián)合處理巨噬細(xì)胞時(shí)也可誘導(dǎo)M1型極化,其炎性反應(yīng)包括引起巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā),并促進(jìn)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、白細(xì)胞介素-1β和腫瘤壞死因子-α等炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)顯著上調(diào)[8]。

誘導(dǎo)型一氧化氮合酶在魚類組織中廣泛分布且能在病原侵染時(shí)快速應(yīng)答,因而在魚類中發(fā)揮著重要的免疫作用。鮭腎桿菌(Renibacteriumsalmoninarum)感染虹鱒后,誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因僅在鰓和頭腎巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[9]。此外,虹鱒感染病毒性出血敗血癥后,脾、頭腎和肝臟巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因被顯著誘導(dǎo)表達(dá)[47],表明巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶在虹鱒抗病毒防御過(guò)程中也發(fā)揮了重要作用。鯉經(jīng)過(guò)嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)刺激后,誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因在多組織中廣泛被誘導(dǎo)表達(dá),其中頭腎巨噬細(xì)胞中的表達(dá)量上調(diào)最顯著[46]。因此,誘導(dǎo)型一氧化氮合酶已被證明是參與魚類多種免疫過(guò)程的重要效應(yīng)酶,尤其在寄生蟲[48-49]、細(xì)菌[50]和病毒[51]等病原體侵染后,巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因表達(dá)量均顯著上調(diào),表明其參與魚類抵抗病原感染的炎癥反應(yīng),是魚類M1型巨噬細(xì)胞的重要標(biāo)記物。

2.1.2 腫瘤壞死因子-α

腫瘤壞死因子-α屬于TNF超家族成員,能增強(qiáng)殺傷細(xì)胞活性,抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞,促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖和分化[52],是機(jī)體抵抗細(xì)菌、寄生蟲及病毒感染的重要炎性細(xì)胞因子[53]。腫瘤壞死因子-α主要由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,M1型和M2b型巨噬細(xì)胞是分泌腫瘤壞死因子-α的主要細(xì)胞類型[37,54],在其他細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞和肥大細(xì)胞中也可以被誘導(dǎo)分泌[55]。

大黃魚單核/巨噬細(xì)胞在腫瘤壞死因子-α1/α2蛋白處理后可大量誘導(dǎo)活性氧和一氧化氮產(chǎn)生,并引起炎性細(xì)胞因子誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、腫瘤壞死因子-α1、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6和白細(xì)胞介素-8基因表達(dá)上調(diào),并增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能,表明腫瘤壞死因子-α可以誘導(dǎo)大黃魚M1型巨噬細(xì)胞形成,且是重要的M1型極化標(biāo)記物[7]。此外,建立的2種大黃魚巨噬細(xì)胞系在脂多糖刺激后,腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β等炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)量被誘導(dǎo)上調(diào)[10]。類似的是,香魚巨噬細(xì)胞在脂多糖處理后也可誘導(dǎo)M1型極化標(biāo)記物腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-1β基因表達(dá)上調(diào),而該調(diào)控作用受到具有膠原結(jié)構(gòu)的巨噬細(xì)胞受體抑制[11]。筆者所在實(shí)驗(yàn)室研究表明,團(tuán)頭魴內(nèi)凝集素蛋白孵育巨噬細(xì)胞后可以誘導(dǎo)M1型極化,并顯著促進(jìn)腫瘤壞死因子-α和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶等炎性細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào),表明腫瘤壞死因子-α和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶等可以作為團(tuán)頭魴M1型巨噬細(xì)胞的極化標(biāo)記物[56-57]。在斑馬魚極化巨噬細(xì)胞亞群的建立和鑒定研究中,M1型巨噬細(xì)胞主要以腫瘤壞死因子-α作為標(biāo)記物進(jìn)行鑒定[12]。上述研究表明,炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α作為魚類巨噬細(xì)胞M1型極化標(biāo)記物已得到廣泛應(yīng)用。

2.1.3 白細(xì)胞介素家族

白細(xì)胞介素是多種細(xì)胞分泌并可作用于多種靶細(xì)胞的一類細(xì)胞因子家族。因最初由白細(xì)胞分泌并作用于白細(xì)胞,并具有重要的調(diào)節(jié)作用,因此得名并沿用至今[58]。白細(xì)胞介素是在生物學(xué)功能和分子結(jié)構(gòu)上已基本明確,且具有重要生物學(xué)調(diào)節(jié)作用的一類細(xì)胞因子。白細(xì)胞介素在信號(hào)傳遞,激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞,介導(dǎo)T細(xì)胞和B細(xì)胞活化、增殖與分化及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。目前,已發(fā)現(xiàn)的白細(xì)胞介素成員至少有38個(gè),分別被命名為白細(xì)胞介素-1～白細(xì)胞介素-38,功能復(fù)雜多樣。有關(guān)白細(xì)胞介素的研究很多,本節(jié)主要綜述與M1型巨噬細(xì)胞極化相關(guān)的標(biāo)記物白細(xì)胞介素-1β和白細(xì)胞介素-6。

(1)白細(xì)胞介素-1β

白細(xì)胞介素-1β是魚類炎癥反應(yīng)中最先分泌的細(xì)胞因子之一,也是M1型巨噬細(xì)胞的極化標(biāo)記物,目前在鯉形目、鮭形目、鱸形目等多種類型魚類中均已克隆、鑒定。雖然魚類白細(xì)胞介素-1β與哺乳動(dòng)物類似,但仍存在一定的差異。哺乳動(dòng)物白細(xì)胞介素-1β具有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子,而鮭形目魚類白細(xì)胞介素-1β只含有6個(gè)外顯子,鱸形目魚類白細(xì)胞介素-1β只含有5個(gè)外顯子,并且魚類白細(xì)胞介素-1β的剪切機(jī)制還不完全清楚。

魚類第一個(gè)白細(xì)胞介素-1β是通過(guò)同源克隆的方法在虹鱒中獲得的,與哺乳動(dòng)物白細(xì)胞介素-1β的氨基酸相似性為49%～56%,與鯉白細(xì)胞介素-1β的相似性為57%[59],此后魚類白細(xì)胞介素-1β得到了廣泛研究。脂多糖可誘導(dǎo)虹鱒白細(xì)胞介素-1β基因的表達(dá),且其表達(dá)水平受脂多糖濃度、環(huán)境溫度和皮質(zhì)醇水平等因素影響。脂多糖質(zhì)量濃度為1.5 μg/mL時(shí)誘導(dǎo)的白細(xì)胞介素-1β表達(dá)量約是質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL時(shí)的18倍,且脂多糖在22 ℃和14 ℃處理虹鱒頭腎白細(xì)胞時(shí)白細(xì)胞介素-1β的轉(zhuǎn)錄水平分別是4 ℃處理時(shí)的8倍和2倍,而皮質(zhì)醇卻會(huì)抑制脂多糖對(duì)白細(xì)胞介素-1β的誘導(dǎo)表達(dá)作用[14]。此外,虹鱒白細(xì)胞介素-1β可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞環(huán)氧化酶2(COX-2)和Ⅱ型主要組織相容性復(fù)合體(MHC Ⅱ)的表達(dá),并增強(qiáng)頭腎白細(xì)胞的吞噬活性。大黃魚重組白細(xì)胞介素-1β可增強(qiáng)其對(duì)溶藻弧菌(V.alginolyticus)的抵抗力,且在體外可誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞趨化,并增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬和殺菌活性[15]。香魚經(jīng)鰻利斯頓氏菌(Listonellaanguillarum)感染后,單核/巨噬細(xì)胞中的白細(xì)胞介素-1β蛋白表達(dá)顯著上調(diào),中和白細(xì)胞介素-1β不會(huì)改變香魚頭腎來(lái)源的單核/巨噬細(xì)胞的吞噬作用,但降低了其殺菌能力。因此,香魚白細(xì)胞介素-1β可能在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用,特別是參與單核/巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的殺傷作用[16]。綜上所述,魚類白細(xì)胞介素-1β在炎癥或病原感染時(shí)表達(dá)上調(diào),并通過(guò)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬或殺傷功能發(fā)揮其免疫保護(hù)作用,且白細(xì)胞介素-1β和腫瘤壞死因子-α作為魚類巨噬細(xì)胞M1型極化的典型標(biāo)記物已被廣泛應(yīng)用。

(2)白細(xì)胞介素-6

哺乳動(dòng)物白細(xì)胞介素-6家族由白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-11、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、白血病抑制因子、抑瘤素M、心肌營(yíng)養(yǎng)素-1、心肌營(yíng)養(yǎng)蛋白樣細(xì)胞因子等組成[58]。在魚類中,白細(xì)胞介素-6是一種多功能的細(xì)胞因子,也是最重要的促炎細(xì)胞因子之一[60-61],具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng),在先天性免疫和獲得性免疫方面都有著重要的功能[62]。在誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化的經(jīng)典方法中,脂多糖是誘導(dǎo)M1和M2b型巨噬細(xì)胞的常用刺激物,且白細(xì)胞介素-6在脂多糖誘導(dǎo)的M1和M2b巨噬細(xì)胞中高表達(dá),但在M2a和M2c中表達(dá)較低。結(jié)合白細(xì)胞介素-10、ccl1等其他標(biāo)記物,可通過(guò)白細(xì)胞介素-6從其他巨噬細(xì)胞亞群中鑒定M2b[35]。

2005年,利用人類和河豚基因組某些區(qū)域之間的同線性,在紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)中鑒定了魚類中的第一個(gè)白細(xì)胞介素-6序列[63],魚類白細(xì)胞介素-6的發(fā)現(xiàn)將允許對(duì)局部炎癥反應(yīng)進(jìn)行更深入的研究。脂多糖、poly (I:C)和白細(xì)胞介素-1β等促炎因子可誘導(dǎo)虹鱒巨噬細(xì)胞系RTS-11和原代頭腎巨噬細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞介素-6,虹鱒重組白細(xì)胞介素-6刺激增加了RTS-11細(xì)胞的數(shù)量,表明白細(xì)胞介素-6可以促進(jìn)虹鱒巨噬細(xì)胞系RTS-11的增殖[17]。此外,虹鱒重組白細(xì)胞介素-6還可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞鐵調(diào)素的表達(dá),從而通過(guò)抑制鐵的吸收來(lái)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的抑菌功能。因此,魚類白細(xì)胞介素-6在巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中被誘導(dǎo)表達(dá)后,可通過(guò)誘導(dǎo)鐵調(diào)素表達(dá)來(lái)限制鐵的獲取,從而將鐵缺乏作為限制病原侵染的一種手段[17]。鰻弧菌感染后香魚白細(xì)胞介素-6基因在主要免疫組織和單核/巨噬細(xì)胞中的表達(dá)量均顯著上調(diào),重組白細(xì)胞介素-6孵育香魚巨噬細(xì)胞可增強(qiáng)促炎細(xì)胞因子表達(dá)及其吞噬與殺菌能力,且白細(xì)胞介素-6受體β(IL-6Rβ)對(duì)該效應(yīng)起主要調(diào)控作用[18]。研究表明,鯉巨噬細(xì)胞可以極化為M1和M2表型,并具有保守的功能和相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄譜,M1極化的巨噬細(xì)胞一氧化氮的產(chǎn)生增加,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析表明白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-12、血清淀粉樣蛋白A(SAA)等促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平增加[19]。由此可知,白細(xì)胞介素-6作為魚類重要的M1型極化標(biāo)記物能快速響應(yīng)魚類炎癥反應(yīng)和病原感染,并對(duì)巨噬細(xì)胞增殖、吞噬和殺菌功能起到促進(jìn)作用。

2.1.4 趨化因子和趨化因子受體

趨化因子,由70～100個(gè)氨基酸組成,蛋白大小僅8～10 ku,是一類由細(xì)胞分泌的信號(hào)蛋白或細(xì)胞因子。趨化因子可以聚集并激活白細(xì)胞作用于感染部位參與免疫反應(yīng),在炎癥反應(yīng)和非特異性免疫中具有重要作用。趨化因子有多種分類方式,根據(jù)生理功能的不同,可將其分為誘導(dǎo)型趨化因子和組成型趨化因子[64],前者主要誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、活化的T細(xì)胞等到炎癥部位,后者主要是對(duì)機(jī)體起免疫監(jiān)控和維持機(jī)體動(dòng)態(tài)平衡的作用[64-65];根據(jù)趨化因子多肽鏈一級(jí)結(jié)構(gòu)中前2個(gè)半胱氨酸的排列位置可分為4類,分別是:近氨基端的兩個(gè)半胱氨酸之間還有一個(gè)其他氨基酸的為CXC亞族或α亞族,近氨基端的2個(gè)半胱氨酸緊密相連的是CC亞族或β亞族,近氨基端只有1個(gè)半胱氨酸的為C亞族或γ亞族,近氨基端的2個(gè)半胱氨酸之間有3個(gè)其他氨基酸的為CX3C亞族或δ亞族。此外,魚類還擁有1類特有的CX亞族,而近些年來(lái)對(duì)魚類的趨化因子的研究大都集中在CXC型和CC型2類[66]。CXC型和CC型趨化因子均可作用于嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞[65,67]。趨化因子受體根據(jù)結(jié)合配體的不同可以分為4類:CCR,即CC亞族趨化因子的受體;CXCR,即CXC亞族趨化因子的受體;XCR,即C亞族趨化因子的受體;CX3CR,即CX3C趨化因子的受體。

趨化因子受體CXCR3被認(rèn)為是香魚、草魚和黑青斑河鲀的M1(CXCR3.1)和M2(CXCR3.2)型巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物[20]。CXCR3.1和CXCR3.2基因?qū)Σ蒴~和黑青斑河鲀的巨噬細(xì)胞極化有調(diào)節(jié)作用,并首次證明了硬骨魚巨噬細(xì)胞極化受趨化因子受體的調(diào)節(jié)。香魚CXCL9-11l2和CXCL9-11l3通過(guò)與CXCR3.1相互作用誘導(dǎo)CXCR3.1+巨噬細(xì)胞趨化和M1表型,CXCL9-11l1和CXCL9-11l2通過(guò)與CXCR3.2相互作用誘導(dǎo)CXCR3.2+巨噬細(xì)胞趨化和M2表型。上述結(jié)果表明,在硬骨魚中CXCR3.1和CXCR3.2通過(guò)與其特異性配體相互作用來(lái)介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化[20]。斑馬魚CXCL11aa是人類CXCL11的同源物,細(xì)菌感染時(shí)可作為M1型巨噬細(xì)胞極化的標(biāo)記物[13]。綜上所述,魚類趨化因子及其受體種類繁多,在誘導(dǎo)魚類巨噬細(xì)胞M1型和M2型極化或作為極化標(biāo)記物方面都有較多的研究,表明魚類趨化因子及其受體在巨噬細(xì)胞功能分化中扮演著重要角色。

2.2 M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物

2.2.1 精氨酸酶-2

精氨酸酶是一種能夠水解L-精氨酸脒基并生成鳥氨酸與尿素的反應(yīng)酶,一般存在于可產(chǎn)生尿素的動(dòng)物如哺乳類、兩棲類、板鰓魚類、海龜類的肝臟、腎臟和精巢中,在植物與微生物中也有分布。精氨酸酶目前發(fā)現(xiàn)兩種亞型:精氨酸酶-1和精氨酸酶-2,兩者之間氨基酸序列約有60%的同源性[68],主要區(qū)別在于組織分布、亞細(xì)胞定位及免疫反應(yīng)不同。精氨酸酶-1在肝臟中的表達(dá)量較高,催化L-精氨酸酶代謝為L(zhǎng)-鳥氨酸和尿素,是尿素循環(huán)的最后步驟,對(duì)體內(nèi)的氨解毒起著重要作用[69]。精氨酸酶-2是一種線粒體酶,主要存在于線粒體中[70],幾乎在所有器官都有表達(dá)。魚類精氨酸酶是一種M2型巨噬細(xì)胞的典型標(biāo)記物。

與其他脊椎動(dòng)物一樣,硬骨魚表達(dá)精氨酸酶-1和精氨酸酶-2兩種精氨酸酶,但這兩種異構(gòu)體都存在線粒體靶向序列,表明這兩種酶都是線粒體形式的。由此可見,精氨酸酶在魚類中起線粒體酶的作用。鯉頭腎巨噬細(xì)胞在環(huán)磷酸腺苷(cAMP)刺激下極化形成M2表型,其特征是精氨酸酶-2基因表達(dá)上調(diào),但精氨酸酶-1基因表達(dá)不變,而在脂多糖誘導(dǎo)形成的M1型巨噬細(xì)胞中精氨酸酶-2基因表達(dá)無(wú)顯著變化,表明精氨酸酶-2是鯉M2型巨噬細(xì)胞的重要標(biāo)記物[6,21-22]。而且,鯉巨噬細(xì)胞極化為M2表型后抗炎介質(zhì)增加,精氨酸酶活性增加,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析表明,精氨酸酶-2等M2型極化標(biāo)記物表達(dá)上調(diào)[19]。金頭鯛前列腺素E2可通過(guò)cAMP/CREB信號(hào)途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2型極化,并誘導(dǎo)精氨酸酶-2、甘露糖受體和白細(xì)胞介素-10等標(biāo)記物基因顯著上調(diào)表達(dá)[23]。虹鱒和大西洋鮭的精氨酸酶-1和精氨酸酶-2基因在不同的刺激下也具有差異的表達(dá)模式,病原相關(guān)分子模式(PAMPs)和促炎性細(xì)胞因子可以顯著誘導(dǎo)精氨酸酶-1基因表達(dá)上調(diào),而精氨酸酶-2基因表達(dá)主要受白細(xì)胞介素-4/13調(diào)控,表明虹鱒和大西洋鮭精氨酸酶-2是白細(xì)胞介素-4/13誘導(dǎo)的M2型極化的重要標(biāo)記物[24]。類似的是,在金魚和草魚中的研究也表明,白細(xì)胞介素-4/13可顯著上調(diào)精氨酸酶-2基因表達(dá)水平及精氨酸酶-2活性,從而促進(jìn)草魚巨噬細(xì)胞的M2型極化并抑制M1型極化的形成[25,28]。上述研究表明,精氨酸酶-2是魚類巨噬細(xì)胞M2型極化的重要標(biāo)記物,并已被廣泛用于M2型極化鑒定。

2.2.2 清道夫受體CD163

清道夫受體(SR),是固有免疫中的一類重要模式識(shí)別受體,分為多種類型,主要包括SRA和SRB。其中,SRA含有6個(gè)半胱氨酸,SRB含有6～8個(gè)半胱氨酸。CD163屬于SRB家族,是位于細(xì)胞表面的糖蛋白受體,分子質(zhì)量為130 ku,在高等脊椎動(dòng)物中作為參與組織損傷修復(fù)的M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物。CD163的存在方式有兩種:一是在單核巨噬細(xì)胞上以跨膜大分子的形式存在,二是以可溶性CD163(sCD163)形式存在于組織液中[71]。CD163與sCD163均在抑制炎癥反應(yīng)方面起著重要的作用,因此也被認(rèn)為是M2型單核巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)記物[72-73]。目前,關(guān)于魚類CD163的研究相對(duì)較少。通過(guò)定期監(jiān)測(cè)虹鱒傷口中CD163基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn),受傷后1～3 d,CD163基因的表達(dá)量上調(diào)了10倍,受傷100 d后CD163基因表達(dá)顯著性上調(diào)了17倍。而且,魚類CD163的表達(dá)模式與M2c巨噬細(xì)胞在傷口中出現(xiàn)的預(yù)期時(shí)間一致,表明其是M2c巨噬細(xì)胞的重要標(biāo)記物[26]。高等脊椎動(dòng)物CD163對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用研究及其作為M2型極化標(biāo)記物的應(yīng)用較多,已有關(guān)于魚類CD163的研究也表明其參與組織修復(fù),但其作為魚類M2型極化標(biāo)記物的研究與應(yīng)用還有待深入。

2.2.3 甘露糖受體

甘露糖受體(MR)又稱CD206。甘露糖受體作為一種模式識(shí)別受體主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞及樹突細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面[74],在識(shí)別病原、維持穩(wěn)態(tài)、抗原遞呈、誘導(dǎo)細(xì)胞因子等過(guò)程有著重要作用,同時(shí)也可用作巨噬細(xì)胞分型,其對(duì)巨噬細(xì)胞選擇性較強(qiáng)[75],是M2型巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)記物[76]。甘露糖受體屬于多凝集素受體,可識(shí)別細(xì)胞表面或病原體細(xì)胞壁上的多種糖分子,通過(guò)參與受體介導(dǎo)的內(nèi)吞和吞噬作用,將非特異性和特異性免疫聯(lián)系起來(lái),組成機(jī)體的免疫防御系統(tǒng)。鯉MRC-1B基因在未刺激的巨噬細(xì)胞中有較高的基底表達(dá)量,在脂多糖刺激后表達(dá)下調(diào)5倍,而在cAMP刺激后上調(diào)3倍,推測(cè)MRC-1B是魚類重要的M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物[6]。類似的是,金頭鯛前列腺素E2可通過(guò)cAMP/CREB信號(hào)途徑誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M2型極化中甘露糖受體作為標(biāo)記物表達(dá)顯著上調(diào)[23]。團(tuán)頭魴甘露糖受體具有典型的C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域,定位于細(xì)胞表面和胞內(nèi),這與哺乳動(dòng)物巨噬細(xì)胞中甘露糖受體一致。此外,甘露聚糖和甘露糖受體特異性抗體抑制試驗(yàn)均表明,團(tuán)頭魴甘露糖受體蛋白通過(guò)Ca2+依賴性方式介導(dǎo)了巨噬細(xì)胞的吞噬作用[77]。近些年,魚類甘露糖受體對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用研究逐漸增多,并廣泛應(yīng)用于M2型巨噬細(xì)胞鑒定。

3 展 望

巨噬細(xì)胞作為重要的免疫細(xì)胞,在機(jī)體抗病及免疫過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。M1型巨噬細(xì)胞具有促炎作用,而M2型巨噬細(xì)胞的功能與M1型巨噬細(xì)胞相反,包括抑制炎癥、促進(jìn)修復(fù)及組織再生等。兩類巨噬細(xì)胞在功能和表型方面具有顯著差異,并分別具有特定的標(biāo)記物,因此巨噬細(xì)胞標(biāo)記物在不同極化類型巨噬細(xì)胞的鑒定、分選和功能研究中具有重要意義。目前,魚類巨噬細(xì)胞標(biāo)記物相關(guān)的研究較少,已鑒定的魚類巨噬細(xì)胞標(biāo)記物種類有限,且部分標(biāo)記物僅在一種或少數(shù)魚類中有報(bào)道,很多魚類巨噬細(xì)胞標(biāo)記物的研究依然需要參考高等脊椎動(dòng)物的研究成果。基于鑒定的魚類巨噬細(xì)胞標(biāo)記物,可進(jìn)行不同極化類型巨噬細(xì)胞的分選,并可促進(jìn)魚類巨噬細(xì)胞極化標(biāo)記物與表型特征及功能分化之間的關(guān)聯(lián)研究。因此,系統(tǒng)、全面地篩選巨噬細(xì)胞不同極化類型的標(biāo)記物是魚類巨噬細(xì)胞功能研究及分選的基礎(chǔ),也是魚類巨噬細(xì)胞研究的重要方向。

此外,已建立的魚類巨噬細(xì)胞系(株)較少,僅在虹鱒、大黃魚、羅非魚等少數(shù)魚類中有報(bào)道。魚類原代巨噬細(xì)胞具有分離步驟繁瑣,貼壁率、體外培養(yǎng)時(shí)間不穩(wěn)定等缺點(diǎn),而細(xì)胞系相對(duì)于原代細(xì)胞具有重復(fù)性高、可標(biāo)準(zhǔn)化及實(shí)驗(yàn)操作方便等優(yōu)勢(shì),可為魚類巨噬細(xì)胞的功能研究提供較好的材料。而且,基于魚類巨噬細(xì)胞系可以建立穩(wěn)定的不同極化類型巨噬細(xì)胞模型,從而為系統(tǒng)研究異質(zhì)性巨噬細(xì)胞的功能差異奠定基礎(chǔ)。綜上所述,對(duì)于魚類巨噬細(xì)胞極化標(biāo)記物的系統(tǒng)性鑒定及巨噬細(xì)胞極化模型的建立具有重要意義,有助于解析魚類巨噬細(xì)胞在病原感染及炎癥反應(yīng)中的免疫調(diào)控機(jī)制,并為魚類病害防治奠定理論基礎(chǔ)。