植心妍,楊烜懿,王光輝,趙旭民,遲淑艷,4,譚北平

( 1.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院,廣東 湛江 524088; 2.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室,廣東 湛江 524013; 3.宜昌華太生物科技有限公司,湖北 宜昌 443500; 4.廣東省水產(chǎn)動(dòng)物精準(zhǔn)營養(yǎng)高效飼料工程研究中心,廣東 湛江 524088 )

2019年,我國水產(chǎn)品養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)5079.07萬t,同比增長1.76%,漁獲量1401.29萬t,同比下降4.45%[1]。由于近年來養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模的不斷擴(kuò)大和漁獲量的驟降,我國對(duì)魚粉的需求量不斷攀升,約為150萬t[2-3],而魚粉的價(jià)格也在不斷上漲。魚粉具有蛋白質(zhì)含量高、富含必需氨基酸和必需脂肪酸、抗?fàn)I養(yǎng)因子少且容易被消化吸收等優(yōu)點(diǎn),是水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物飼料中首選的優(yōu)質(zhì)蛋白源[4]。但魚粉的磷含量較高(1.7%～3.6%)[5],且以磷酸三鈣復(fù)合物的形式存在,大部分養(yǎng)殖魚類很難利用[6],致使磷元素隨尿液排入養(yǎng)殖水體,影響水體磷元素的循環(huán),加重養(yǎng)殖水體代謝的負(fù)擔(dān)[7]。同時(shí),飼料蛋白源的結(jié)構(gòu)已由傳統(tǒng)的魚粉-豆粕型向多元化原料組成發(fā)展,魚類對(duì)飼料中蛋白質(zhì)的消化能力受到關(guān)注,若飼料消化率下降,會(huì)導(dǎo)致部分氮元素流失于養(yǎng)殖水體中,且在有機(jī)物作用下轉(zhuǎn)換為氨氮,從而加快水體惡化。因此,尋找優(yōu)質(zhì)的蛋白源以降低飼料中魚粉的使用量是當(dāng)今水產(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)研究的重要任務(wù)之一。

大部分動(dòng)物蛋白源的蛋白質(zhì)含量較高,氨基酸含量豐富,抗?fàn)I養(yǎng)因子較少,且含有一些未知的功能性因子[8],可以促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物的生長發(fā)育[9]。如蠅蛆粉替代20%魚粉對(duì)錦鯉(Cyprinuscarpio)的生長具有促進(jìn)作用[10],南極磷蝦粉替代9%魚粉能夠促進(jìn)大口黑鱸(Micropterussalmoides)的生長[11]。腸膜蛋白粉是一種新型功能營養(yǎng)性動(dòng)物蛋白原料,源于豬小腸黏膜[12],含有小肽和游離氨基酸,且水溶性較好[13],經(jīng)過酶解處理后,小肽和游離氨基酸的含量更為豐富,且具有一些特殊功能的生物活性肽,能夠?qū)︳~體的健康和生長產(chǎn)生積極的影響[14-15]。

珍珠龍膽石斑魚(Epinephelusfuscoguttatus♀×E.lanceolatu♂)生長快速,肉質(zhì)鮮美,抗病力強(qiáng),營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值高[16]。筆者通過研究酶解腸膜蛋白粉替代魚粉對(duì)珍珠龍膽石斑魚的生長性能、營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率及養(yǎng)殖水體氨氮的影響,以探究飼料中酶解腸膜蛋白粉替代魚粉的最適水平,從而為配制珍珠龍膽石斑魚精準(zhǔn)配合飼料提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以酶解腸膜蛋白粉分別替代飼料中0%、9%、18%、27%和36%的魚粉,配制5種等氮等脂的試驗(yàn)飼料。所有原料經(jīng)粉碎后過60目篩,根據(jù)表1精準(zhǔn)稱取,混合后(V型立式混合機(jī)JS-14S型,浙江正泰電器股份有限公司)用雙螺桿膨化機(jī)(TSE 65,北京現(xiàn)代洋工機(jī)械科技發(fā)展有限公司)加工成直徑為3.0 mm的顆粒狀飼料,室內(nèi)晾干后,密封儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱中。魚粉和酶解腸膜蛋白粉的營養(yǎng)成分含量見表2,酶解腸膜蛋白粉的肽分子量分布見圖1。

圖1 酶解腸膜蛋白粉的肽分子量分布Fig.1 The molecular weight distribution of peptide in powder of enzyme-digested hydrolyzed porcine mucosa

表1 試驗(yàn)飼料的配方和近似組成(干物質(zhì)) %Tab.1 Ingredient and proximate composition of the experimental diets (dry matter)

表2 魚粉和酶解腸膜蛋白粉的養(yǎng)分分析(干物質(zhì)) %Tab.2 Proximate composition of the fish meal and enzyme-digested hydrolyzed porcine mucosa (dry matter)

1.2 試驗(yàn)用魚與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)用珍珠龍膽石斑魚幼魚取自湛江東海島石斑魚苗場。養(yǎng)殖試驗(yàn)于湛江海洋高新科技園進(jìn)行。養(yǎng)殖試驗(yàn)前,將魚苗在室外的水泥池中暫養(yǎng)且投喂商品飼料(廣東粵海飼料集團(tuán)股份有限公司,粗蛋白質(zhì)50.0%),養(yǎng)殖14 d后挑選規(guī)格一致、健康的珍珠龍膽石斑魚[(7.50±0.02) g]隨機(jī)分為5組,每組3個(gè)平行,每個(gè)平行30尾。每日8:00和16:00投喂試驗(yàn)飼料,養(yǎng)殖周期為8周。試驗(yàn)用水為經(jīng)過沉淀、砂濾的天然海水,養(yǎng)殖水溫(31.2±0.7) ℃,光照周期12 h∶12 h,pH 7.05±0.25,養(yǎng)殖水體的氨氮質(zhì)量濃度≤2.5 mg/L,溶解氧質(zhì)量濃度≥5 mg/L。

1.3 樣品采集和分析

飼料原料、飼料和糞便中營養(yǎng)成分含量測定參照文獻(xiàn)[17]的方法。水分含量測定采用105 ℃烘干恒質(zhì)量法;粗蛋白質(zhì)含量的測定采用凱氏定氮法;粗脂肪含量的測定采用索氏抽提法;粗灰分含量的測定采用箱式電阻爐550 ℃灼燒恒質(zhì)量法。鈣和磷含量的測定參考JYT 015—1996《感耦等離子體原子發(fā)射光譜方法通則》[18]。

于養(yǎng)殖試驗(yàn)第4周開始收集糞便,直至養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束。在珍珠龍膽石斑魚攝食后4 h收集糞便,用濾紙吸干水分并置于50 mL離心管中,保存于-20 ℃的冰箱中備用。糞便冷凍干燥(CHRIST,Alpha 2-4 LDplus,德國)后粉碎并過60目篩,測定糞便養(yǎng)分含量和Y2O3含量(上海微譜化工技術(shù)服務(wù)有限公司,上海),用于計(jì)算飼料干物質(zhì)表觀消化率、粗蛋白質(zhì)表觀消化率、鈣表觀消化率和磷表觀消化率。

于養(yǎng)殖試驗(yàn)第7周第1天,在8:00珍珠龍膽石斑魚攝食后1、5、9、13、17、21 h用虹吸法,于同一個(gè)位置采集水樣,密封避光的環(huán)境下保存,根據(jù)JY/T 015—1996《海洋監(jiān)測規(guī)范》[19]于24 h內(nèi)測定水體氨氮和亞硝態(tài)氮的質(zhì)量濃度。

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后禁食24 h,稱量質(zhì)量,計(jì)算成活率(RS,%)、質(zhì)量增加率(wWGR,%)、特定生長率(RSG,%/d)、飼料系數(shù)(RFC)、蛋白質(zhì)效率(RPE)和攝食率(RF,%)。

1.4 指標(biāo)計(jì)算

RS=nt/n0×100%

wWGR=(mt-m0)/m0×100%

RSG=(lnmt-lnm0)/t×100%

RFC=mf/(mt-m0)

RPE=(mt-m0)/mfp

RF=md/[t×(m0+mt)/2]×100%

ADCDM=(1-wsy/wfy)×100%

ADCN=(1-wfi/wsi)×(wsy/wfy)×100%

式中,n0為試驗(yàn)魚初始數(shù)量(尾),nt為試驗(yàn)魚終末數(shù)量(尾),m0為初始均質(zhì)量(g),mt為終末均質(zhì)量(g),t為飼養(yǎng)天數(shù)(d),mf為飼料攝入量(g),mfp為飼料蛋白質(zhì)攝入量(g),md為飼料攝入干物質(zhì)量(g),ADCDM為干物質(zhì)表觀消化率(%),ADCN為營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率(%),wsy為飼料中Y2O3的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%),wfy為糞便中Y2O3的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%),wfi為糞便中營養(yǎng)物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%),wsi為飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,若有顯著性差異(P<0.05)則進(jìn)行Tukey多重比較。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 生長性能

本試驗(yàn)中使用的主要替代魚粉的蛋白源是酶解腸膜蛋白粉,蛋白質(zhì)含量較高,氨基酸較平衡,其主要優(yōu)勢在于含有較多的小肽。由于采用了酶解等預(yù)處理技術(shù),原料中分子質(zhì)量2000 u以下的小肽占96.85%(圖1),有利于動(dòng)物對(duì)原料蛋白質(zhì)的利用。由表3可見,酶解腸膜蛋白粉替代0%和9%組的質(zhì)量增加率和特定生長率差異不顯著(P>0.05),但是顯著高于其他各組(P<0.05)。酶解腸膜蛋白粉替代0%、9%、18%和27%組組間的蛋白質(zhì)效率和飼料系數(shù)差異不顯著(P>0.05);酶解腸膜蛋白粉替代36%組蛋白質(zhì)效率顯著低于替代0%和9%組(P<0.05),飼料系數(shù)則顯著高于替代0%組(P<0.05)。各組攝食率和成活率受飼料影響不顯著(P>0.05)。

表3 珍珠龍膽石斑魚的生長性能Tab.3 Growth performance of hybrid grouper E. fuscoguttatus ♀×E. lanceolatus ♂

2.2 干物質(zhì)及營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率

隨著飼料中酶解腸膜蛋白粉替代水平的上升,珍珠龍膽石斑魚的干物質(zhì)表觀消化率、粗蛋白質(zhì)表觀消化率、鈣表觀消化率和磷表觀消化率呈下降趨勢(表4)。酶解腸膜蛋白粉替代9%、18%、27%和36%組中的干物質(zhì)表觀消化率、粗蛋白質(zhì)表觀消化率、鈣表觀消化率和磷表觀消化率差異不顯著(P>0.05),但顯著低于替代0%(P<0.05)。酶解腸膜蛋白粉替代18%和27%組的干物質(zhì)表觀消化率間及替代9%和18%組的粗蛋白質(zhì)表觀消化率間差異不顯著(P>0.05)。

表4 珍珠龍膽石斑魚表觀消化率 %Tab.4 Apparent digestibility coefficients of hybrid grouper E. fuscoguttatus ♀×E. lanceolatus ♂

2.3 養(yǎng)殖水體氨氮及亞硝態(tài)氮含量變化

2.3.1 氨氮

酶解腸膜蛋白粉替代0%和9%組養(yǎng)殖水體氨氮含量在攝食后1～5 h顯著低于攝食后13～21 h(P<0.05),攝食后13～21 h差異不顯著(P>0.05)(表5)。酶解腸膜蛋白粉替代18%組和酶解腸膜蛋白粉替代27%組養(yǎng)殖水體氨氮含量在攝食后1～13 h顯著低于攝食后17～21 h(P<0.05),攝食后17 h和21 h差異不顯著(P>0.05)。酶解腸膜蛋白粉替代36%組養(yǎng)殖水體氨氮含量在攝食后1～5 h差異不顯著(P>0.05),但顯著低于攝食后9～21 h(P<0.05)。

表5 養(yǎng)殖水體氨氮質(zhì)量濃度的變化 mg/LTab.5 Changes in ammonia nitrogen concentration in aquaculture water

在攝食后5 h時(shí),酶解腸膜蛋白粉替代18%組養(yǎng)殖水體氨氮含量呈現(xiàn)最低值,顯著低于酶解腸膜蛋白粉替代27%組和酶解腸膜蛋白粉替代36%組(P<0.05)。在攝食后13～17 h,各組間養(yǎng)殖水體氨氮含量差異不顯著(P>0.05)。在攝食后21 h時(shí),酶解腸膜蛋白粉替代0%組養(yǎng)殖水體氨氮含量與酶解腸膜蛋白粉替代9%組差異不顯著(P>0.05),但顯著低于其他各組(P<0.05)。

2.3.2 亞硝態(tài)氮

隨著時(shí)間延長,各組養(yǎng)殖水體亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度在攝食后1～13 h顯著低于攝食后21 h(P<0.05)。各組養(yǎng)殖水體亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度攝食后5 h和9 h差異不顯著(P>0.05),攝食后13 h和17 h差異不顯著(P>0.05)。

在攝食后1 h和21 h時(shí),各組間的養(yǎng)殖水體亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度差異不顯著(P>0.05)。在攝食后13 h時(shí),酶解腸膜蛋白粉替代0%、9%和36%組的養(yǎng)殖水體亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度差異不顯著(P>0.05),顯著高于替代27%組(P<0.05)。在攝食后17 h時(shí),酶解腸膜蛋白粉替代18%組養(yǎng)殖水體亞硝態(tài)氮含量顯著低于替代0%和9%組(P<0.05),但與替代27%和36%組差異不顯著(P>0.05)。

表6 養(yǎng)殖水體亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度的變化 mg/LTab.6 Changes in nitrite nitrogen concentration in aquaculture water

3 討 論

3.1 酶解腸膜蛋白粉替代魚粉對(duì)珍珠龍膽石斑魚的生長性能的影響

雞肉粉替代30%的魚粉時(shí),未影響黃鱔(Mono-pterusalbus)的生長性能[20],表明動(dòng)物蛋白源對(duì)魚體的生長具有積極作用。動(dòng)物蛋白源經(jīng)過酶解后,含有更加豐富的小肽和游離氨基酸[21],魚蛋白的酶解物可促進(jìn)歐洲舌齒鱸(Dicentrarchuslabrax)[15]的生長性能,改善免疫能力。本試驗(yàn)結(jié)果表明,酶解腸膜蛋白粉替代飼料中的魚粉,不會(huì)對(duì)珍珠龍膽石斑魚的成活率造成負(fù)面影響,酶解腸膜蛋白粉替代魚粉水平達(dá)27%時(shí),珍珠龍膽石斑魚的特定生長率和質(zhì)量增加率高于替代0%時(shí)。有研究顯示,酶解磷蝦粉替代水平為30%時(shí),可顯著促進(jìn)珍珠龍膽石斑魚的特定生長率和質(zhì)量增加率[21]。羅非魚(Oreochromis)副產(chǎn)品酶解物替代水平為10%時(shí),能顯著提高真鯛(Pagrusmajor)幼魚的特定生長率[22]。然而,當(dāng)酶解腸膜蛋白粉替代魚粉水平超過18%時(shí),石斑魚的質(zhì)量增加率、特定生長率和蛋白質(zhì)效率顯著下降。當(dāng)飼料中酶解磷蝦粉和酶解魚溶漿替代一定水平時(shí)也會(huì)導(dǎo)致珍珠龍膽石斑魚和黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)的質(zhì)量增加率和特定生長率降低,表明動(dòng)物蛋白酶解物替代水平過高對(duì)魚體生長性能會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響[21,23]?？赡苁且?yàn)轱暳现行‰暮陀坞x氨基酸的含量過高,機(jī)體腸道轉(zhuǎn)運(yùn)能力超負(fù)荷,此外,快速涌入機(jī)體的小肽可能會(huì)加速氨基酸氧化和內(nèi)因性排泄[24],從而影響氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn),最終抑制魚體對(duì)蛋白質(zhì)的吸收[25]。本試驗(yàn)中,隨著酶解腸膜蛋白粉替代魚粉水平的增加,珍珠龍膽石斑魚的攝食率顯著上升,這與克林雷氏鲇(Rhamdiaquelen)[26]和異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[27]的研究結(jié)果一致,可能是因?yàn)閯?dòng)物蛋白源經(jīng)過酶解生成的活性小肽具有誘食的功效,能夠提高攝食率[28]。

3.2 酶解腸膜蛋白粉替代魚粉對(duì)珍珠龍膽石斑魚飼料營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

珍珠龍膽石斑魚的干物質(zhì)表觀消化率和粗蛋白質(zhì)表觀消化率隨著酶解腸膜蛋白粉替代魚粉水平的升高呈下降趨勢,表明飼料中添加較高水平的酶解腸膜蛋白粉會(huì)對(duì)營養(yǎng)素的利用產(chǎn)生負(fù)面影響。酶解腸膜蛋白粉相比魚粉而言精氨酸含量稍高,又缺乏賴氨酸和含硫氨基酸等必需氨基酸,致使氨基酸不平衡,影響魚類對(duì)蛋白質(zhì)氨基酸的利用,對(duì)飼料產(chǎn)生消化吸收障礙而隨糞便排出,影響飼料的消化率。同樣,羽毛粉中精氨酸含量較高而含硫氨基酸和賴氨酸含量較低,大菱鲆(Scophthalmusmaximu)[29]、金頭鯛(Sparusaurata)[30]和軍曹魚(Rachycentroncanadum)[31]對(duì)含有一定量酶解、酵解或水解的羽毛粉的飼料的干物質(zhì)和蛋白質(zhì)消化率均較低。隨著酶解腸膜蛋白粉替代水平的增加,珍珠龍膽石斑魚對(duì)飼料磷的表觀消化率顯著下降。有研究表明,隨著低魚粉飼料中肉骨粉含量上升,異育銀鯽的磷表觀消化率呈下降趨勢[32]。在動(dòng)物性原料中,肉骨粉的總磷含量較高,在軍曹魚的研究中發(fā)現(xiàn),肉骨粉的磷表觀消化率(62.44%)顯著低于秘魯魚粉的磷表觀消化率(71.22%)[33]。

3.3 酶解腸膜蛋白粉替代魚粉對(duì)珍珠龍膽石斑魚養(yǎng)殖水體氨氮及亞硝態(tài)氮的影響

養(yǎng)殖水體氮含量過多會(huì)造成富營養(yǎng)化,致使水生植物大量繁殖,使生物數(shù)量和多樣性發(fā)生改變,破壞水體的生態(tài)平衡并引起水生生物種群結(jié)構(gòu)的改變[34]。同時(shí),這也會(huì)導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物代謝紊亂,生長速度緩慢,生殖力衰弱,從而導(dǎo)致養(yǎng)殖動(dòng)物生產(chǎn)量低下[35]。水體的各種氮化合物中,氨氮對(duì)魚類的直接危害最大。水體中氨氮的來源主要為水生動(dòng)物的排泄物、施加的肥料、殘餌和動(dòng)植物尸體受池塘中微生物作用的分解產(chǎn)物。水體中氨氮含量過高會(huì)損傷水生動(dòng)物的鰓組織,抑制呼吸作用,打破生物體內(nèi)外氣體交換的平衡,造成生物中毒的現(xiàn)象,使魚類正常生命活動(dòng)受阻甚至死亡[7,36-37]。混合植物蛋白替代魚粉水平為30%時(shí),雜交鱘(Acipenserschrenckii×A.baeri)幼魚排氨率顯著降低[38],表明飼料原料的選擇對(duì)水體氨氮含量具有影響。本試驗(yàn)中,在攝食后1～21 h,酶解腸膜蛋白粉替代0%和9%組之間的氨氮含量差異不顯著,表明酶解腸膜蛋白粉替代9%時(shí)并未加劇養(yǎng)殖水體的惡化,并且上述兩組間魚體的生長無顯著差異。本試驗(yàn)中,隨著酶解腸膜蛋白粉替代魚粉水平的增加,各組飼料的消化率均低于對(duì)照組,養(yǎng)殖水體的氨氮含量呈上升趨勢,可能是由攝食后的魚體持續(xù)進(jìn)行代謝所致。此外,可能是酶解腸膜蛋白粉替代水平的上升,使得游離氨基酸含量增多,氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體飽和導(dǎo)致氨基酸之間競爭失衡,影響氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn),魚類對(duì)氨基酸的吸收能力下降[25],較多的氮元素隨著代謝廢物流入養(yǎng)殖水體,加快了水體中氨氮含量上升的速度。

亞硝態(tài)氮由氨氮硝化形成,水體中亞硝態(tài)氮含量過高會(huì)導(dǎo)致魚體血液中高鐵血紅蛋白的含量升高,載氧能力下降,造成組織缺氧,引發(fā)死亡[39]。較高含量的亞硝態(tài)氮會(huì)導(dǎo)致中華鱉(Pelodiscussinensis)稚鱉[40]養(yǎng)殖水體中病菌的大量繁殖,加劇養(yǎng)殖水體污染,使養(yǎng)殖的鱉死亡。本試驗(yàn)中,在攝食后1～21 h時(shí),酶解腸膜蛋白粉替代0%組的亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度與酶解腸膜蛋白粉替代9%和36%組差異不顯著,攝食后21 h時(shí),各組間的亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度差異不顯著,表明酶解腸膜蛋白粉替代水平的升高對(duì)水體亞硝態(tài)氮的影響較小。

4 結(jié) 論

綜上所述,在本試驗(yàn)條件下,當(dāng)基礎(chǔ)飼料中含有33%的魚粉時(shí),添加3%酶解腸膜蛋白粉,可替代9%的魚粉,對(duì)珍珠龍膽石斑魚生長性能和養(yǎng)殖水體氨氮含量不會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響。