鄒 杰,彭慧婧,鄭德斌,張守都

( 1.廣西科學(xué)院,廣西 南寧 530000; 2.廣西海洋研究所有限責(zé)任公司,廣西 北海 536000; 3.天津渤海水產(chǎn)研究所,天津 300457; 4.山東省海洋科學(xué)研究院,山東 青島 266000 )

合浦珠母貝(Pinctadafucatassp.martensii),又稱馬氏珠母貝,是我國(guó)培育海水珍珠的主要貝類。廣西為合浦珠母貝主產(chǎn)地和南珠發(fā)源地,近年來(lái),養(yǎng)殖環(huán)境日漸劣化、養(yǎng)殖群體生長(zhǎng)性狀衰退、繁育個(gè)體趨小型化等因素,均限制了南珠產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。由于重新選育合浦珠母貝優(yōu)良品種所需成本高、時(shí)間長(zhǎng),為適應(yīng)新的養(yǎng)殖形勢(shì)和環(huán)境變化,需要快速改良廣西合浦珠母貝的種質(zhì)資源,雜交育種是能夠短時(shí)間內(nèi)提升種質(zhì)資源的方式之一。有關(guān)不同地理群體合浦珠母貝雜交研究較多[1-2],其具有一定的雜種優(yōu)勢(shì)[3],但關(guān)于廣西合浦珠母貝地理群體內(nèi)雜交的研究較少。要加快廣西合浦珠母貝群體雜交育種應(yīng)用,首先要了解廣西合浦珠母貝主要群體的遺傳背景。目前廣西合浦珠母貝地理群體內(nèi)經(jīng)人工繁育或選育分化成3個(gè)主要群體:選育群體“海選1號(hào)”、養(yǎng)殖群體和野生繁育群體。選育群體是以廣西潿洲島海域野生群體選育出的優(yōu)質(zhì)新品種,已在廣東和廣西應(yīng)用多年,生長(zhǎng)性狀具有顯著優(yōu)勢(shì)[4];養(yǎng)殖群體則是合浦傳統(tǒng)南珠養(yǎng)殖區(qū)繼代繁育養(yǎng)殖群體,存在一定的抗逆優(yōu)勢(shì);野生群體表型分化較大,遺傳資源可能具有潛在的復(fù)雜多態(tài)性。這3個(gè)分化群體可作為廣西合浦珠母貝群體雜交親本的潛在來(lái)源群。由于長(zhǎng)期混雜養(yǎng)殖,3個(gè)分化群體間理論上存在基因交流,在進(jìn)行雜交育種時(shí)應(yīng)首先掌握選擇親本群體的真實(shí)遺傳分化狀況,分析不同群體的近交水平遺傳分化程度,進(jìn)而提升雜交育種的預(yù)期效果。鑒于遺傳標(biāo)記多態(tài)性可有效分析合浦珠母貝的遺傳差異[5-6],筆者通過(guò)對(duì)3個(gè)群體中的適齡種貝作為樣本進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組測(cè)序,通過(guò)單核苷酸多態(tài)標(biāo)記解析3個(gè)樣本群間的遺傳關(guān)系,從一定程度上反映3個(gè)群體的遺傳背景,探索出不同群體間的最佳雜交組合方式,為廣西合浦珠母貝雜交育種中的親本選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料處理

分別從野生群體(F1)、選育群體(“海選1號(hào)”F4)和養(yǎng)殖群體中隨機(jī)挑選15個(gè)2齡種貝,組成3個(gè)樣本群體,分別采集軟體部-80 ℃保存(3個(gè)月內(nèi)),利用1端EcoRⅠ(G^AATTC)和2端NlaⅢ(Hin1Ⅱ,CATG^)進(jìn)行雙酶切,將質(zhì)檢合格的DNA樣品500 ng采用ddRAD建庫(kù)方式構(gòu)建長(zhǎng)度在300～500 bp的雙端測(cè)序文庫(kù),基于Illunima HiSeq 2500高通量測(cè)序。

1.2 數(shù)據(jù)處理

1.2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控

對(duì)片段測(cè)序得到的原始讀長(zhǎng)進(jìn)行數(shù)據(jù)評(píng)估,得到各個(gè)樣品的原始數(shù)據(jù),通過(guò)堿基質(zhì)量值(Q)進(jìn)行質(zhì)控獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)。

堿基質(zhì)量值(Q)與錯(cuò)誤率(Re)的關(guān)系式為:

Q=-10lgRe

1.2.2 信息分析

將序列讀長(zhǎng)使用BWA比對(duì)到近緣[7]參考物種覆瓦珠母貝(P.imbricata)染色體上(GCA_002216045.1_PinMar1.0),根據(jù)高質(zhì)量數(shù)據(jù)在參考染色體的定位結(jié)果,未掛載上染色體的拼接序列共同作為參考基因組,使用Picard(0.7.17-r1188)的Mark Duplicate工具去除重復(fù),屏蔽PCR重復(fù)數(shù)據(jù)的影響,使用GATK進(jìn)行變異檢測(cè),變異位點(diǎn)質(zhì)量值重新校正,后進(jìn)行測(cè)序深度過(guò)濾,平均測(cè)序深度為5×,最小等位基因頻率為0.05,樣品信息完整度為0.70,變異位點(diǎn)質(zhì)量值Q>30,過(guò)濾獲取可靠變異結(jié)果形成單核苷酸多態(tài)標(biāo)記,用于后續(xù)分析?；趩魏塑账岫鄳B(tài)標(biāo)記,對(duì)序列雙端比對(duì)基因組率超90%個(gè)體,通過(guò)軟件GCTA(1.92.1,http://cnsgenomics.com/software/gcta/#Overview)進(jìn)行主成分分析,得到樣品的主成分,運(yùn)用R軟件繪制主成分分析圖,利用軟件FastTree(2.1.9)中的極大似然法構(gòu)建極大似然進(jìn)化樹;使用軟件PopLDdecay(https://github.com/BGI-shenzhen/PopLDdecay)進(jìn)行連鎖不平衡衰減分析,參數(shù)為:-OutPairLD5;在軟件vcftools(0.1.16)中,參數(shù)設(shè)為以100 kb為一個(gè)滑動(dòng)窗口,10 kb為步長(zhǎng)取一個(gè)區(qū)域,計(jì)算群體在這個(gè)區(qū)域內(nèi)的群體分化指數(shù)(Fst);在R軟件(R包:detectRUNS)中,設(shè)定每一個(gè)滑動(dòng)窗口至少要有20個(gè)單核苷酸多態(tài)標(biāo)記,滑動(dòng)窗口閾值使用默認(rèn)參數(shù)0.05,每一個(gè)滑動(dòng)窗口中允許的相反基因型數(shù)目為1個(gè),每一個(gè)滑動(dòng)窗口中允許丟失的基因型為1個(gè),組成長(zhǎng)純合片段(ROH)之間的單核苷酸多態(tài)標(biāo)記的最大間隔為1 Mb,長(zhǎng)純合片段的最小長(zhǎng)度設(shè)為0.25 Mb,基于參考染色體統(tǒng)計(jì)長(zhǎng)純合片段,基于每條染色體分析近交系數(shù)(FROH)。

FROH=∑LROH/Lgenome

式中,∑LROH為染色體上長(zhǎng)純合片段的長(zhǎng)度之和,Lgenome為染色體的物理總長(zhǎng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序與參考染色體比對(duì)結(jié)果

45個(gè)樣品共產(chǎn)生49.79 Gb高質(zhì)量數(shù)據(jù),對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控評(píng)估結(jié)果見表1,質(zhì)控平均Q30為92.17%,3群體GC含量34.59%～35.04%,低于AT含量。組裝參考基因組大小為990 984 031 bp,未掛載參考染色體的基因組大小為137 058 386 bp,樣品平均比對(duì)讀長(zhǎng)為768 337 bp,平均覆蓋基因組大小為85 103 126 bp,平均覆蓋深度為13.84,平均基因組覆蓋深度為0.99,選育群體的平均比對(duì)、雙端比對(duì)讀長(zhǎng)均較低。

表1 不同群體測(cè)序堿基分布和與參考基因組比對(duì)結(jié)果(均值)Tab.1 Distribution and comparison of sequencing bases with reference genome in different populations (mean)

2.2 單核苷酸多態(tài)與群體信息統(tǒng)計(jì)

樣品與參考基因組之間單核苷酸多態(tài)標(biāo)記檢測(cè)平均轉(zhuǎn)換數(shù)量為206 641個(gè),平均顛換數(shù)量為184 471個(gè)(圖1a),轉(zhuǎn)換/顛換為1.12,轉(zhuǎn)換發(fā)生率高于顛換,平均雜合類型單核苷酸多態(tài)標(biāo)記數(shù)量為151 042個(gè),野生群體雜合程度最高,平均純合單核苷酸多態(tài)標(biāo)記數(shù)量為240 070個(gè),選育群體平均純合單核苷酸多態(tài)標(biāo)記數(shù)量高于野生群體和養(yǎng)殖群體。群體單核苷酸多態(tài)標(biāo)記過(guò)濾后,1、3、9和10號(hào)染色體單核苷酸多態(tài)標(biāo)記數(shù)量較多(圖1b),以20 kb為一個(gè)窗口,統(tǒng)計(jì)窗口內(nèi)的單核苷酸多態(tài)標(biāo)記數(shù)量,單核苷酸多態(tài)標(biāo)記在染色體上的密度分布較均勻(圖1c),染色體單核苷酸多態(tài)標(biāo)記較多與其長(zhǎng)度相關(guān)。統(tǒng)計(jì)單群體內(nèi)的雙等位基因型群體遺傳指標(biāo)平均值,群體信息統(tǒng)計(jì)見表2,群體內(nèi)單核苷酸多態(tài)標(biāo)記統(tǒng)計(jì)數(shù)量超過(guò)58萬(wàn)個(gè),選育群體的觀測(cè)雜合度最低,平均近交系數(shù)(Fis)與養(yǎng)殖群體相近,野生群體觀測(cè)雜合度最高,近交系數(shù)(Fis)最低,野生群體相對(duì)具有較好的群體遺傳多態(tài)。

表2 群體遺傳信息統(tǒng)計(jì)Tab.2 The statistics of population genetic information

圖1 單核苷酸多態(tài)標(biāo)記統(tǒng)計(jì)Fig.1 SNP statisticsa.單核苷酸多態(tài)類型變異數(shù)量統(tǒng)計(jì);b.染色體單核苷酸多態(tài)標(biāo)記數(shù)量統(tǒng)計(jì);c.染色體單核苷酸多態(tài)標(biāo)記密度分布.a.SNP type variation statistics; b.statistics of chromosome SNPs; c.distribution of chromosome SNP density.

2.3 群體分化分析

利用與參考染色體高比對(duì)(>90%)樣品的單核苷酸多態(tài)標(biāo)記進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)和主成分(圖3)分析,結(jié)果顯示,選育群體與養(yǎng)殖群體部分樣品親緣關(guān)系較近,預(yù)示選育群體和養(yǎng)殖群體可能有部分相同的親本來(lái)源,主成分分析基本將樣品分成3個(gè)類群,主成分1顯示野生群體分類較好,主成分2顯示選育群體和養(yǎng)殖群體存在群體交雜,分析結(jié)果與進(jìn)化樹分析一致。通過(guò)計(jì)算區(qū)域平均遺傳分化指數(shù)(Fst),野生群體-選育群體、野生群體-養(yǎng)殖群體和選育群體-養(yǎng)殖群體的遺傳分化指數(shù)均值分別為0.068、0.065和0.030,選育群體和養(yǎng)殖群體之間的遺傳分化指數(shù)最低,多態(tài)性相近,進(jìn)一步表明部分親本來(lái)源相同的可能性較大。

圖2 系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree個(gè)體編號(hào)中,M1表示野生群體,M2表示選育群體,M3表示養(yǎng)殖群體.In the individual number, M1 represents wild population, M2 represents breeding population and M3 represents cultured population.

圖3 主成分分析Fig.3 Analysis of principal component analysis

2.4 長(zhǎng)純合片段與連鎖不平衡衰減分析

野生群體、選育群體和養(yǎng)殖群體的平均長(zhǎng)純合片段數(shù)分別為59.1、49.5個(gè)和56.6個(gè),長(zhǎng)純合片段平均長(zhǎng)度分別為0.312、0.313Mb和0.311Mb,平均單核苷酸多態(tài)標(biāo)記含量為59、50個(gè)和73個(gè),1號(hào)和10號(hào)染色體長(zhǎng)純合片段平均含量較多,為6.5個(gè),7號(hào)最少,為1.9個(gè)?；陂L(zhǎng)純合片段分布和比例計(jì)算的近交系數(shù)(FROH)見圖4,野生群體、選育群體和養(yǎng)殖群體的近交系數(shù)(FROH)分別為0.0149～0.0240、0.0159～0.0201和0.0170～0.0246,14號(hào)染色體近交系數(shù)(FROH)最高,野生群體近交系數(shù)(FROH)略高于選育群體和養(yǎng)殖群體,3個(gè)群體近交系數(shù)(FROH)均低于0.060。整個(gè)染色體內(nèi)的連鎖不平衡衰減結(jié)果見圖5。一般把連鎖不平衡系數(shù)(r2)降低至0.1～0.2時(shí)的遺傳距離認(rèn)為是該物種的衰減距離。r2為0.2時(shí),野生群體、選育群體和養(yǎng)殖群體的平均連鎖不平衡的距離為0.4、0.4 kb和0.2 kb;r2降為0.1時(shí),野生群體、選育群體和養(yǎng)殖群體的平均連鎖不平衡距離增至40.5、>300.0 kb和4.0 kb。衰減速度為養(yǎng)殖群體>野生群體>選育群體,養(yǎng)殖群體具有較高的群體內(nèi)核酸多態(tài)性(表2),結(jié)果與其衰減速度最快相一致,選育群體由于連續(xù)多年人工選育,群體內(nèi)核酸多態(tài)性較低,衰減速度最慢。

圖4 不同染色體近交系數(shù)統(tǒng)計(jì)Fig.4 Statistics of FROH in different chromosomes紅色代表野生群體,綠色代表選育群體,藍(lán)色代表養(yǎng)殖群體.Wild population is shown in red color, breeding population is shown in green color and cultured population is shown in blue color.

圖5 不同群體連鎖不平衡衰減Fig.5 Linkage disequilibrium decay in different populations

3 討 論

3.1 群體分化與雜交潛力分析

為獲取有效的雜種優(yōu)勢(shì),雜交親本應(yīng)選用不同分化亞群或具有較好遺傳資源的群體(系)或品系,并從來(lái)源群體中選擇具備一定表型優(yōu)勢(shì)的親本,野生群體作為來(lái)源時(shí)應(yīng)該純化親本[8]。合浦珠母貝養(yǎng)殖性狀中生長(zhǎng)速度[9]和存活率均是影響產(chǎn)珠的重要選擇性狀,在難以估計(jì)存活性狀的情況下,生長(zhǎng)相關(guān)表型性狀成為親本的首選性狀,筆者均利用人工繁選群體作為親本的來(lái)源群,保證了親本的純化和優(yōu)勢(shì)性狀親本的選擇,方便準(zhǔn)確分析適合作為雜交親本的遺傳信息。

本研究中,3個(gè)群體經(jīng)過(guò)群體多態(tài)指數(shù)比較、主成分分析交叉位點(diǎn)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析得出,選育群體和養(yǎng)殖群體群體分化程度最低。遺傳分化指數(shù)是衡量群體間的遺傳分化程度的重要指標(biāo),當(dāng)0<遺傳分化指數(shù)<0.05時(shí),表明各群體之間分化很小,幾乎可以忽略;當(dāng)遺傳分化指數(shù)>0.05時(shí),各群體之間才存在中度以上的遺傳分化[10]。馬氏珠母貝的不同殼色家系間遺傳分化指數(shù)為0.113～0.793[11],表明各個(gè)家系之間存在極大的分化,可能與連續(xù)多年的家系選育以及近交引起家系內(nèi)基因頻率發(fā)生較大變化有關(guān);在馬氏珠母貝近交與雜交4個(gè)家系間的平均遺傳分化指數(shù)為0.1049[12],表明4個(gè)家系間存在中度的遺傳分化,同雜交和近交的不同交配方式對(duì)基因頻率改變存在重要關(guān)系;本研究的平均遺傳分化指數(shù)相對(duì)較低,其中野生群體-選育群體和野生群體-養(yǎng)殖群體的遺傳分化指數(shù)均值分別為0.068和0.065,表明野生群體-選育群體、野生群體-養(yǎng)殖群體之間存在中等程度的分化,與選育群體的連續(xù)多年選育,以及養(yǎng)殖群體在養(yǎng)殖中被有意識(shí)作為一個(gè)獨(dú)立群體繁育有關(guān)。選育群體-養(yǎng)殖群體的遺傳分化指數(shù)均值為0.030,表明選育群體和養(yǎng)殖群體間幾乎沒有遺傳分化,表明本研究中的2個(gè)群體間的基因頻率差別不大,群體來(lái)源相同或部分個(gè)體來(lái)源相同的可能性較大,這可能與本研究選用來(lái)源群體的粗放保種以及生產(chǎn)中的不當(dāng)操作串種有較大關(guān)系。廣西合浦珠母貝產(chǎn)業(yè)受養(yǎng)殖環(huán)境的影響,導(dǎo)致傳統(tǒng)養(yǎng)殖群體萎縮,而隨著選育群體在廣西的推廣應(yīng)用力度加大,一定程度上造成傳統(tǒng)養(yǎng)殖群體與選育群體的混雜并存,且選育群體本身具有優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)表型性狀[4],所以在選擇同質(zhì)種貝樣本時(shí),樣本同源的概率較大。連鎖不平衡衰減速度能夠反映群體選擇強(qiáng)度或群體多態(tài)性[13],野生群體受人工選擇的壓力較小,養(yǎng)殖群體雖然多態(tài)性標(biāo)記數(shù)量(546 380個(gè))最多,但與選育群體分化程度偏低。為了引入更多的優(yōu)秀基因,在沒有專門化群系條件下,進(jìn)行快速育種時(shí)可優(yōu)先考慮野生群體×選育群體或野生群體×養(yǎng)殖群體雜交組合方式。而通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析時(shí),連鎖不平衡衰減越快,分析所需的標(biāo)記密度越大,與目標(biāo)性狀表型變異關(guān)聯(lián)的顯著性位點(diǎn)離功能基因位點(diǎn)距離會(huì)越近,進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析時(shí),野生群體×養(yǎng)殖群體雜交組合方式可提高基因定位精度。

3.2 群體近交水平分析

水產(chǎn)動(dòng)物具有較強(qiáng)的繁殖力,在短期內(nèi)經(jīng)過(guò)高強(qiáng)度的人工選擇可以實(shí)現(xiàn)性狀的快速改良,同時(shí)也意味著繁育的大部分個(gè)體父母本可能來(lái)自少數(shù)個(gè)體,育種群體的近交系數(shù)可能升高很快[14-15]。已有研究表明,貝類存在明顯的近交衰退問題[16-18]。了解群體的繁殖規(guī)律并掌握群體近交系數(shù),有助于了解父母本的親緣關(guān)系,并通過(guò)雜交的方式降低近交的影響[12]。本研究結(jié)果顯示,野生群體、選育群體和養(yǎng)殖群體的群體內(nèi)近交系數(shù)(Fis)分別為0.2075、0.3449和0.3465,選育群體和養(yǎng)殖群體接近近交系(Fis>0.375)[19]的水平,選育群體和養(yǎng)殖群體可以被視為具有一定純化水平的群系,無(wú)論是雜交育種或通過(guò)雜交方式降低群體近交系數(shù),野生群體均可作為主要親本群。近交系數(shù)在進(jìn)行雜交子代的遺傳參數(shù)分析時(shí),可作為重要的參考依據(jù)。一般雜交父本和母本分別來(lái)自不同群體(系),父本和母本被默認(rèn)為無(wú)親緣關(guān)系,但父本或母本個(gè)體間卻存在一定的親緣關(guān)系,利用基因型作為固定效應(yīng)計(jì)算親緣系數(shù)會(huì)優(yōu)于系譜計(jì)算。長(zhǎng)純合片段反映了子代從有共同祖先的親代遺傳了相同的染色體片段[20],也可以幫助了解群體近交程度和群體多樣性,相較于群體內(nèi)近交系數(shù)Fis,基于長(zhǎng)純合片段所計(jì)算的近交系數(shù)FROH更接近于真實(shí)近交水平,已在畜禽遺傳研究中普遍應(yīng)用[21-22],而本研究結(jié)果中,野生群體、選育群體和養(yǎng)殖群體的近交系數(shù)(FROH)分別為0.0149～0.0240、0.0159～0.0201和0.0170～0.0246,3個(gè)群體近交系數(shù)(FROH)相近并低于多數(shù)畜禽(FROH>0.05)[23-25],同時(shí)結(jié)果也明顯低于群體信息統(tǒng)計(jì)計(jì)算的近交系數(shù),除物種差異因素外,結(jié)果偏低也與簡(jiǎn)化測(cè)序結(jié)果與基因組覆蓋率低有關(guān),且多數(shù)貝類沒有明顯性染色體[26],計(jì)算時(shí)以全基因組長(zhǎng)度作為參數(shù)。近交系數(shù)(FROH)可作為群體內(nèi)無(wú)直接親緣關(guān)系個(gè)體的親緣關(guān)系參考系數(shù),在缺少基因型計(jì)算親緣系數(shù)時(shí),近交系數(shù)(FROH)可直接作為合浦珠母貝選擇群體的近交系數(shù)進(jìn)行因子計(jì)算,不同染色體長(zhǎng)純合片段的分布也表明了3個(gè)群體從共同祖先遺傳染色體概率相近。

4 結(jié) 論

筆者通過(guò)分析廣西合浦珠母貝3個(gè)不同群體間的遺傳關(guān)系,發(fā)現(xiàn)不同群體間存在一定程度的遺傳分化,并指出通過(guò)野生群體×選育群體或野生群體×養(yǎng)殖群體組合方式開展雜交育種,具有較大獲得雜種優(yōu)勢(shì)的潛力。研究結(jié)果可為廣西合浦珠母貝通過(guò)雜交育種對(duì)種質(zhì)資源改良提供新的思路和途徑。