李 菁,趙瑞陽,張俊杰

( 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830052 )

無翅型MMTV整合位點(diǎn)家族信號(hào)通路是目前生物體中常見的信號(hào)通路之一,它是受到配體蛋白Wnt和膜蛋白兩種蛋白相互作用產(chǎn)生的一種下游通路,經(jīng)此途徑,細(xì)胞外的信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi),從而參與到生物體的早期細(xì)胞發(fā)育及生殖器官的形成過程中[1]。在不同種類的動(dòng)物中,Wnt信號(hào)通路進(jìn)化十分保守。最初在小鼠乳腺腫瘤中被發(fā)現(xiàn)[2],命名為1nt1基因,在小鼠的胚胎生長發(fā)育過程中有支持作用,通過研究發(fā)現(xiàn)該基因的功能與果蠅的wingless基因類似,從此合并為Wnt基因[3]。Wnt蛋白屬于分泌蛋白,通過不同的結(jié)構(gòu)功能蛋白結(jié)合不同功能的受體,不同種類的受體分子各自誘導(dǎo)不同的細(xì)胞反應(yīng),從而達(dá)到調(diào)控下游靶向基因的目的[4]。Wnt蛋白與其下游效應(yīng)蛋白共同形成一系列重要的信號(hào)通路。Wnt信號(hào)通路在細(xì)胞生長、細(xì)胞分化、細(xì)胞極性和凋亡等多種發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。Wnt4基因是Wnt基因家族的一員,是參與性腺早期生長分化的重要基因之一,在動(dòng)物的生長發(fā)育、繁殖階段及性別的維持方面具有重要支持作用。Wnt4蛋白是人類和小鼠性腺分化的關(guān)鍵調(diào)控因子[5],在早期胚胎發(fā)生中起關(guān)鍵作用,尤其在卵巢的發(fā)育和雌性功能的維持方面具有支持作用。在哺乳動(dòng)物中,Wnt4蛋白對(duì)于將繆勒管發(fā)育成雌性輸卵管和子宮也是必需的[6]。在小鼠的性別完全形成之前,Wnt4蛋白在小鼠卵巢中的表達(dá)較精巢更為持久、顯著[7]。在人類的性別決定機(jī)制中Wnt4基因扮演著重要角色,其與Dax1基因共同調(diào)控參與雌性的性別決定機(jī)制,抑制雄性器官的形成[8]。有學(xué)者在黑鯛(Acanthopagrusschlegelii)的性別相關(guān)基因研究中發(fā)現(xiàn),Wnt4對(duì)雌性生殖器官的發(fā)育形成有重要作用[9];Wnt4基因在櫛江珧(Atrinapectinata)的卵巢中的表達(dá)量顯著高于精巢[10];而櫛孔扇貝的Wnt4基因在精巢中的表達(dá)量顯著高于卵巢[11],與黑鯛的表達(dá)模式不同。對(duì)水生動(dòng)物Wnt4基因的研究主要集中在克隆及表達(dá)分析方面,目前已涉及斑馬魚(Daniorerio)[12]、海膽[13]、櫛江珧[10]、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[11]、三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)[14]、厚殼貽貝(Mytiluscoruscus)[15]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[16]、黑鯛[9]、青鳉(Oryziaslatipes)[17]等物種。

然而在硬骨魚中Wnt4基因的相關(guān)研究較少。白斑狗魚(Esoxlucius)是廣泛分布于世界各大自然水域的冷水性魚類[18],在我國主要分布于新疆額爾齊斯河流域[19],其生長迅速,適宜生長溫度范圍較廣,肉質(zhì)鮮美,已成為新疆地區(qū)重要養(yǎng)殖魚類之一[20]。有研究表明,白斑狗魚雌性生長明顯快于雄性[21],開展單性養(yǎng)殖有助于擴(kuò)大養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。目前白斑狗魚的性別發(fā)育機(jī)制尚未闡明,Wnt4基因在其性腺發(fā)育過程中的作用未見報(bào)道,筆者通過反轉(zhuǎn)錄PCR方法克隆得到白斑狗魚的Wnt4基因,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)Wnt4基因在白斑狗魚生長發(fā)育不同階段的組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析,從而探討白斑狗魚Wnt4基因在性別形成與分化中的功能,為白斑狗魚性別決定機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用魚為本實(shí)驗(yàn)室人工繁殖的白斑狗魚仔魚,親魚為烏倫古湖野生白斑狗魚,飼養(yǎng)于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室,分別取180日齡[體質(zhì)量(300±30) g、體長(25±3) cm]及320日齡[體質(zhì)量(600±30) g、體長(52±3) cm]雌性成魚和雄性成魚各3尾,對(duì)活魚進(jìn)行快速解剖,分別取性腺、腎臟、肌肉、鰓、腦、頭腎、腸道組織裝入無菌凍存管中,將其迅速置于液氮里,轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱中。

1.2 方法

1.2.1 試劑

Trizol試劑購自Invitrogen公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)、PCR試劑盒TaKaRa TaqTM購自寶生物工程大連有限公司,熒光定量試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中白斑狗魚基因組測(cè)序信息,結(jié)合已報(bào)道鮭科魚類Wnt4基因的蛋白質(zhì)編碼(CDS)區(qū)域設(shè)計(jì)引物Wnt4-F-Primer、Wnt4-R-Primer(表1),用于白斑狗魚Wnt4基因擴(kuò)增。根據(jù)克隆得到的基因片段設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Wnt4-F-QPCR、Wnt4-R-QPCR,引物的設(shè)計(jì)采用Primer 5.0軟件,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 試驗(yàn)所涉及的特異引物Tab.1 Primer sequences used in the experiments

1.2.3 性腺總RNA的提取及cDNA的制備

采用Trizol法提取白斑狗魚不同時(shí)期的不同組織總RNA,采用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的光密度(顯示1.8～2.0表示RNA完整性良好),1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書完成cDNA的制備,將其置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.4 Wnt4基因的克隆

PCR反應(yīng)以精巢cDNA為起始模板,反應(yīng)體系為:2.5 mmol/L dNTP Mixture,4 μL;10×PCR buffer,5 μL;正、反向引物各2 μL;TaKaRa TaqTM(5 U/μL),0.5 μL;cDNA,3 μL;最后加入ddH2O補(bǔ)齊至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃ 5 min;94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)35次;72 ℃延伸10 min,4 ℃終止程序。PCR反應(yīng)結(jié)束后,在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳中以D2000 DNA Marker作為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè),再置于紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果,將產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.2.5 Wnt4基因的生物信息學(xué)分析

采用DNAMAN軟件將測(cè)序所得cDNA序列進(jìn)行拼接,運(yùn)用BLAST查詢?cè)撐锓N在數(shù)據(jù)庫中同其他物種Wnt4蛋白序列的同源性;使用生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)上的ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)工具分析白斑狗魚Wnt4基因序列的開放閱讀框,進(jìn)一步推導(dǎo)出該蛋白的氨基酸序列;采用DNAMAN、Clustal X軟件進(jìn)行氨基酸序列多重對(duì)比;運(yùn)用MEGA 6.1軟件(鄰接法的Boisson Model)對(duì)其構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[22]。

1.2.6 Wnt4基因熒光定量表達(dá)

以反轉(zhuǎn)錄的各組織cDNA為模板,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)Wnt4基因在白斑狗魚各個(gè)組織的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定,選定β-actin基因作為內(nèi)參表達(dá)基因,Wnt4基因?yàn)槟康幕?。采用SYBR Green I熒光染料(天根)為原料,BIO-RAD CFX96定量PCR儀為試驗(yàn)儀器。反應(yīng)體系10 μL為:2×SuperReal PreMix Plus(天根),7.8 μL RNase Free dH2O,上、下游引物各0.6 μL,模板cDNA 1 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 5min;95 ℃ 30 s,59 ℃ 30 s,39個(gè)循環(huán);95 ℃ 30 s。采用 2-ΔCt法計(jì)算Wnt4基因的相對(duì)表達(dá)量。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,數(shù)據(jù)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行單因素方差分析,進(jìn)行LSD多重比較及鄧肯多重比較。

2 結(jié) 果

2.1 白斑狗魚Wnt4基因擴(kuò)增與克隆

將cDNA模板與特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)產(chǎn)物采用瓊脂凝膠電泳檢測(cè),分子長度約1500 bp,長度符合目的基因序列。對(duì)測(cè)序片段進(jìn)行拼接,獲得Wnt4的cDNA序列,長度為1505 bp。運(yùn)用美國國家生物技術(shù)信息中心上的ORF Finder對(duì)白斑狗魚Wnt4基因的開放閱讀框進(jìn)行查詢,得出1條序列長度為1059 bp的開放閱讀框,編碼352個(gè)氨基酸(圖1)

圖1 白斑狗魚Wnt4基因 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The PCR amplification result of Wnt4 gene in northern pike E. lucius1～4表示白斑狗魚擴(kuò)增結(jié)果;M表示DNA marker.The number from 1 to 4 represents the amplification result of northern pike E. lucius; M stands for DNA marker.

圖2 白斑狗魚Wnt4蛋白質(zhì)氨基酸序列推導(dǎo)圖Fig.2 Amino acid sequence of Wnt4 protein in northern pike E. lucius代表正向引物;代表反向引物.represents the forward primer; represents the reverse primer.

2.2 同源性分析

運(yùn)用Clustal X軟件對(duì)白斑狗魚等13個(gè)物種進(jìn)行同源性分析,結(jié)果顯示,白斑狗魚Wnt4蛋白與硬骨魚類的同源性更高,與虹鱒同源性為96.59%,與青鳉同源性為93.48%,與胡子鲇(Clariasbatrachus)、大西洋鱈(Gadusmorhua)、斑馬魚的同源性均為92.61%,與原雞(Gallusgallus)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)、人類(Homosapiens)同源性分別為84.38%、86.08%、80.40%,與黑天鵝(Cygnusatratus)、大鼠耳蝠(Myotismyotis)、印度水牛(Bubalusbubalis)、褐家鼠(Rattusnorvegicus)同源性分別為84.38%、80.68%、80.68%、79.83%。從Wnt4蛋白氨基酸同源性分析上可以得出,白斑狗魚與虹鱒、青鳉等魚類同源性均在90%以上,與哺乳動(dòng)物和兩棲動(dòng)物的Wnt4蛋白氨基酸同源性則較低。

圖3 白斑狗魚與其他物種Wnt4蛋白氨基酸序列比對(duì)分析Fig.3 Multiple sequence alignment analysis of amino acid sequences of Wnt4 protein in northern pike E. lucius and othersWnt4蛋白保守結(jié)構(gòu)域由表示.The conserved domain of Wnt4 protein is represented by the black box.

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹

運(yùn)用MEGA 6.1軟件對(duì)白斑狗魚及其余13個(gè)處于不同分類地位的物種進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建(圖4)。結(jié)果顯示,Wnt4蛋白氨基酸構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹首先分為3大類,分別為脊索動(dòng)物門、棘皮動(dòng)物門和軟體動(dòng)物門。白斑狗魚與白邊鋸鱗魚(Myripristismurdjan)、紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)、金頭鯛(Sparusaurata)聚為一亞支,非洲爪蟾與原雞聚為一支,并與白斑狗魚所在的硬骨魚綱聚在一起,這一分支再與哺乳動(dòng)物(人類、小家鼠、綿羊)聚成一亞支,最后與軟殼動(dòng)物和棘皮動(dòng)物共同會(huì)聚為系統(tǒng)發(fā)育樹。Wnt4氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹表明,白斑狗魚與白邊鋸鱗魚親緣關(guān)系最近,與青灰擬球海膽(Paracentrotuslividus)和櫛孔扇貝、厚殼貽貝的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。這與氨基酸同源性分析結(jié)果一致,系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系符合傳統(tǒng)的物種進(jìn)化理論。

圖4 基于不同物種的Wnt4氨基酸序列構(gòu)建的鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 NJ phylogenetic tree constructed based on Wnt4 amino acid sequence of different species

2.4 Wnt4基因在不同組織的表達(dá)情況

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,Wnt4基因在白斑狗魚卵巢、精巢、腸道、頭腎、腎臟、肌肉、鰓、腦這8個(gè)組織中均有不同程度的表達(dá),顯示出Wnt4基因在各個(gè)組織中表達(dá)的廣泛性。各個(gè)組織之間表達(dá)存在差異,180日齡期(圖5a),Wnt4基因在卵巢、肌肉、頭腎、腦組織中的表達(dá)量相對(duì)較高,而在腸道、肝臟、腎臟的表達(dá)量相對(duì)較低,卵巢的表達(dá)量顯著高于精巢(P<0.05)。320日齡期(圖5b),Wnt4基因在腸道、腎臟、肝臟開始出現(xiàn)較明顯的表達(dá),并且卵巢的表達(dá)量極顯著高于精巢(P<0.01)。對(duì)比不同時(shí)期的精巢表達(dá)量可以發(fā)現(xiàn),隨著性腺的生長發(fā)育,320日齡期卵巢的表達(dá)量明顯低于180日齡期,Wnt4基因的表達(dá)量在性腺(精巢和卵巢)中呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

圖5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Wnt4基因在不同日齡期白斑狗魚不同組織的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression levels of Wnt4 gene in different tissues of northern pike E. lucius at different ages detected by real-time PCR**為差異極顯著(P<0.01).** indicates very significant difference at P<0.01 level.

3 討 論

3.1 Wnt4蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及其同源性進(jìn)化關(guān)系分析

Wnt4蛋白可能是一種影響組織離散區(qū)域發(fā)展的信號(hào)分子。Wnt基因存在于脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物中,目前已知人類的Wnt蛋白有19種。Wnt基因過表達(dá)可能與人乳腺組織的異常增殖有關(guān)[23]。由Wnt蛋白介導(dǎo)的Wnt信號(hào)通路,其主要功能是協(xié)調(diào)和影響大量的細(xì)胞過程,如細(xì)胞增殖、分化、腫瘤發(fā)生、凋亡和參與微生物感染期間的免疫防御[24]。筆者克隆得到的白斑狗魚Wnt4基因序列具有Wnt基因家族的特征,編碼352個(gè)氨基酸,含有2個(gè)以上的N糖基化位點(diǎn),對(duì)比不同的Wnt4蛋白發(fā)現(xiàn)其保守序列超過100個(gè)。符合大多數(shù)推導(dǎo)的蛋白質(zhì),長度約為350～380個(gè)氨基酸,包含超過100個(gè)保守殘基,且相當(dāng)均勻地分布在整個(gè)序列中[3]。

氨基酸同源性分析發(fā)現(xiàn),白斑狗魚Wnt4蛋白與虹鱒、青鳉、胡子鲇等硬骨魚類的相似性均在92%以上,從進(jìn)化發(fā)育樹的遺傳距離程度上看,白斑狗魚與白邊鋸鱗魚親緣關(guān)系最近,與軟殼動(dòng)物親緣關(guān)系較遠(yuǎn),說明筆者克隆的Wnt4基因?qū)儆赪nt基因家族成員,且從系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系看Wnt4基因進(jìn)化亦符合傳統(tǒng)的物種進(jìn)化理論。

3.2 Wnt4表達(dá)模式分析

Wnt4基因作為生長因子參與調(diào)控動(dòng)物體生長發(fā)育的不同過程,與機(jī)體腎臟、腎上腺、乳腺及垂體及生殖器官的形成有關(guān),特別是與動(dòng)物的性別發(fā)育密切相關(guān)。在哺乳動(dòng)物胚胎的形成過程中,發(fā)育初期時(shí)Wnt4基因在睪丸和卵巢都有表達(dá),隨著胚胎發(fā)育到一定時(shí)期,Wnt4基因在睪丸的表達(dá)發(fā)生下調(diào),從而出現(xiàn)基因表達(dá)的二態(tài)性[25]。有研究表明,小鼠Wnt4基因的缺失會(huì)導(dǎo)致雌性向雄性的逆轉(zhuǎn),從而進(jìn)一步提示了Wnt4基因在雌性性腺發(fā)育過程中起到的分子調(diào)控機(jī)制[6,26]。Wnt4基因在長牡蠣(Crassostreagigas)[27]雌、雄性腺中的表達(dá)呈現(xiàn)明顯的二態(tài)性,卵巢的表達(dá)量顯著高于精巢。并且在不同的日齡期中白斑狗魚的卵巢表達(dá)量都顯著高于精巢,這與Wnt4基因在牙鲆(Paralichthysolivaceus)性腺中的表達(dá)情況一致[28]。在虹鱒中存在2種Wnt4基因,Wnt4a1、Wnt4a2基因在生殖細(xì)胞周圍的體細(xì)胞中都被檢測(cè)到,且存在輕微的偏向雄性表達(dá)的性別二態(tài)性,在虹鱒性腺發(fā)育的早期并未出現(xiàn)卵巢表達(dá)優(yōu)勢(shì)[16]。

本研究中,白斑狗魚的Wnt4基因在卵巢、精巢、腸道、頭腎、腦等不同組織均有表達(dá),這與櫛孔扇貝[11]、長牡蠣[27]、厚殼貽貝[15]的Wnt4基因廣泛組織表達(dá)模式類似。白斑狗魚Wnt4基因在320日齡期的表達(dá)較180日齡期有降低的趨勢(shì),推測(cè)Wnt4蛋白在其性腺發(fā)育的早期參與到某些器官的形成及功能的維持。在哺乳物及軟體動(dòng)物中存在相似的結(jié)果,Wnt4蛋白參與哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育,參與排泄、生殖器官的發(fā)育[25]。Wnt4基因在整個(gè)脊椎動(dòng)物中都是高度保守的,最初是在非哺乳類脊椎動(dòng)物中被研究的。在哺乳動(dòng)物小鼠和袋鼠中,Wnt4基因在卵巢中的表達(dá)顯著高于精巢,在精巢幾乎不表達(dá)[29,30]。Wnt4基因與神經(jīng)的發(fā)育有關(guān),也參與其他功能的維持,如:在斑馬魚[11]、雞[31]和非洲爪蟾[32]中,Wnt4基因在大腦中表達(dá),提示其在胚胎發(fā)生過程中起抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的作用;在某些哺乳動(dòng)物腎臟的形成過程中,缺失Wnt4基因的小鼠,會(huì)出現(xiàn)腎衰竭導(dǎo)致死亡[33];有研究表明在腎小管形成過程中,Wnt4蛋白在間質(zhì)細(xì)胞向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程中扮演重要角色,Wnt4蛋白作為分泌型糖蛋白,是腎小管形成所必需的組分[34]。

Wnt4基因在白斑狗魚的不同部位呈現(xiàn)出廣泛的表達(dá)特點(diǎn),其中卵巢的表達(dá)量最高,并且卵巢的表達(dá)量顯著高于精巢,隨著性腺發(fā)育到后期,Wnt4基因在卵巢的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。推測(cè)該基因在白斑狗魚發(fā)育的早期參與多個(gè)部位的生長發(fā)育,并且在卵巢發(fā)育前期對(duì)卵巢具有支持作用。白斑狗魚雌、雄生長速度差異明顯,研究白斑狗魚性別相關(guān)發(fā)育基因有助于對(duì)今后實(shí)現(xiàn)單性養(yǎng)殖提供理論支持。

4 結(jié) 論

筆者克隆獲得了白斑狗魚Wnt4基因,通過分析其編碼的氨基酸序列發(fā)現(xiàn),該蛋白與虹鱒、青鳉同源性較高,與非洲爪蟾和褐家鼠等相似性較低。Wnt4基因在白斑狗魚不同組織中的表達(dá)結(jié)果顯示,Wnt4基因在性腺中的表達(dá)具有明顯的二態(tài)性,該基因在卵巢中的表達(dá)顯著高于精巢,并在以性腺為首的8個(gè)不同組織中均有不同程度的表達(dá)。這說明在白斑狗魚早期發(fā)育過程中Wnt4基因?qū)Π殉苍趦?nèi)的多個(gè)組織的生長發(fā)育均有支持作用。