張美彥,楊 星,姜再勝,趙 鳳,李松艷,劉婷婷,張芷欣,商寶娣

( 1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水產(chǎn)研究所,貴州 貴陽 550025; 2.貴州省特種水產(chǎn)工程技術(shù)中心,貴州 貴陽 550025; 3.安徽省宣城市宣州區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局水產(chǎn)技術(shù)推廣站,安徽 宣城 242000; 4.貴州師范學(xué)院,貴州 貴陽 550018 )

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)不斷發(fā)展,集約化程度不斷提高,養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大,環(huán)境污染加劇,水產(chǎn)養(yǎng)殖病害時常發(fā)生,病種不斷增多,抗生素的濫用導(dǎo)致養(yǎng)殖水體惡化,細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[1],對生態(tài)環(huán)境和食物鏈的健康產(chǎn)生不利影響。雖然接種疫苗可以預(yù)防疾病的發(fā)生,但養(yǎng)殖對象個體量極大、接種程序復(fù)雜、病原體特異性差異較大、成本高等因素,限制了疫苗在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[2]。由于抗生素的禁用與疫苗的局限性,亟需一種安全、能防病且成本較低的中草藥類來保障水產(chǎn)養(yǎng)殖對象的健康。姜黃素是一種極具生理活性的物質(zhì),主要從植物莪術(shù)、姜黃、郁金等中提取。姜黃素包含了2個鄰甲基化的酚以及1個β-二酮功能基團(tuán),這種結(jié)構(gòu)特性與其多種生物活性作用都高度相關(guān)[3],具有抗氧化、抗炎、消除自由基、增強免疫、促進(jìn)消化等作用[4-5]。姜黃素在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的研究相對較少,已有的研究也表明,姜黃素能促進(jìn)尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)等的生長,提高其消化酶活性,促進(jìn)魚體免疫調(diào)節(jié)等[6]。

大口黑鱸(Micropterussalmoides),又稱加州鱸,屬鱸形目鱸亞目太陽魚科黑鱸屬,具有生長快、肉質(zhì)鮮美、經(jīng)濟(jì)效益高等特點,是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖主要品種之一[7-8]。近幾年,隨著大口黑鱸養(yǎng)殖集約化程度的提高,傳染性疾病暴發(fā)的情況頻發(fā)[9],尤其在魚苗養(yǎng)殖階段更易受到多種因素影響,造成魚體發(fā)病和死亡,影響?zhàn)B殖的經(jīng)濟(jì)效益。

筆者以大口黑鱸為研究對象,在飼料中添加不同含量的姜黃素,通過對大口黑鱸生長和非特異性免疫及相關(guān)抗氧化指標(biāo)的影響,綜合評定姜黃素對大口黑鱸的作用,旨在探明姜黃素對大口黑鱸生長及免疫機能的影響,并為開發(fā)大口黑鱸健康養(yǎng)殖的免疫增強劑提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 飼料配方

采用單因子試驗設(shè)計,在飼料中添加不同水平的姜黃素,共配制出6組基礎(chǔ)飼料。姜黃素購自河南中大生物工程有限公司,純度>98%。1～6號基礎(chǔ)日糧(表1)中姜黃素的添加量為0(對照組)、15、30、60、120 mg/kg和240 mg/kg。各種原料粉碎后過80目篩網(wǎng),制作普通硬顆粒飼料(粒徑1.5 mm),自然風(fēng)干,保存于-20 ℃冰箱待用。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ)) %Tab.1 Formulation and proximate composition of the basal diet (air-dry basis)

1.2 試驗用魚及養(yǎng)殖管理

大口黑鱸苗種來自貴州省水產(chǎn)研究所試驗基地。選擇540尾體表無傷痕、規(guī)格一致,平均體質(zhì)量(4.17±0.39) g的健康苗種,于18個直徑720 mm×高600 mm的室內(nèi)可控溫循環(huán)水圓形水族桶中進(jìn)行飼養(yǎng),每桶30尾,每組3個平行,日投喂3次(8:20—9:00、11:30—12:10和16:50—17:30),日投餌量約為魚體質(zhì)量的4%,每日排污清洗水族桶1次。循環(huán)水系統(tǒng)日夜連續(xù)循環(huán)并充氣增氧,飼養(yǎng)期間pH 7.0～7.9、溫度(18±1) ℃、總氮<0.05 mg/L、溶解氧>5 mg/L、鹽度<0.05、硫化氫<0.01 mg/L。60 d養(yǎng)殖試驗過程中應(yīng)保持環(huán)境安靜,盡量減小環(huán)境應(yīng)激。

1.3 樣品采集與處理

養(yǎng)殖試驗開始前,測定每組大口黑鱸平均體質(zhì)量;試驗結(jié)束后,禁食24 h,將試驗魚放入間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(200 mg/L)麻醉劑溶液中,70 s后撈出,置于濕毛巾上。每個桶取3尾魚,心臟取血(剪開肌肉,找到心臟下方三角形的膜狀區(qū)域,從中間向左下方扎針,取血)。每3尾魚的血液作為一個獨立的樣本,其中取50 μL血液用于呼吸爆發(fā)活性測定,20 μL血液用于血細(xì)胞計數(shù),剩余部分血液置于EDTA抗凝管中以4 ℃、2000 r/min(離心半徑20 cm)離心30 min制備血清,用于檢測生化指標(biāo),-80 ℃凍存?zhèn)溆?。測量魚體體質(zhì)量和體長,解剖,并取內(nèi)臟和肝臟分別稱量質(zhì)量,將肝臟組織存于-80 ℃冰箱備用。

1.4 指標(biāo)測定方法

1.4.1 生長指標(biāo)

養(yǎng)殖試驗開始前,測定每組大口黑鱸平均體質(zhì)量;試驗結(jié)束后,測定大口黑鱸飼料系數(shù)(RFC)、質(zhì)量增加率(wWGR,%)、特定生長率(RSG,%/d)、成活率(RS,%)、肝體指數(shù)(wHSI,%)和臟體指數(shù)(wVSI,%),按下式計算:

RFC=mF/(mt-m0)

(1)

wWGR=(mt-m0)/m0×100%

(2)

RSG=(lnmt-lnm0)/t×100%

(3)

RS=nf/ni×100%

(4)

wHSI=mh/mb×100%

(5)

wVSI=mv/mb×100%

(6)

式中,m0為魚初始體質(zhì)量(g),mt為魚終末體質(zhì)量(g),mF為飼料攝入量(g),t為飼喂時間(d),ni為初始魚數(shù)量(尾),nf為終末魚數(shù)量(尾),mb為樣品魚體質(zhì)量(g),mh為樣品魚肝臟質(zhì)量(g),mv為樣品魚內(nèi)臟質(zhì)量(g)。

1.4.2 血液常規(guī)參數(shù)

血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞和白細(xì)胞密度利用深圳邁瑞全自動五分類動物血液細(xì)胞分析儀(BC-5300 VEt)進(jìn)行測定。試劑盒購于深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.4.3 血液生化指標(biāo)

總蛋白采用比色法,白蛋白采用溴甲酚綠法,乳酸脫氫酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性采用國際臨床化學(xué)聯(lián)合會制定的分析測定參考方法(IFCC),由深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司提供試劑盒,在邁瑞B(yǎng)S-400全自動生化分析儀上測定。

1.4.4 血細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性

血細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性的測定參照文獻(xiàn)[6]的方法,略加修改進(jìn)行測定。取抗凝全血50 μL,加入2′,7′-二氯熒光素雙乙酸鹽,使其終濃度為1 μmol/L,避光孵育30 min后,200目篩網(wǎng)過濾,用多功能酶標(biāo)儀,激發(fā)485 nm,發(fā)射535 nm,測定其熒光值。2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞后,被酯酶水解生成二氯二氫熒光素,二氯二氫熒光素不能穿透細(xì)胞膜,就被留在細(xì)胞內(nèi),細(xì)胞內(nèi)的活性氧氧化無熒光的二氯二氫熒光素生成有熒光的二氯熒光素。二氯熒光素的平均熒光量可代表呼吸爆發(fā)活性。

1.4.5 白細(xì)胞介素-1β和腫瘤壞死因子-α活性的測定

肝臟中白細(xì)胞介素-1β和腫瘤壞死因子-α的活性主要是通過雙抗體夾心法來測定,采用購于IBL(德國)公司的白細(xì)胞介素-1β Elisa檢測試劑盒和腫瘤壞死因子-α ELISA檢測試劑盒完成測定。

1.4.6 補體替代途徑溶血(ACH50)活性測定

補體替代途徑溶血活性主要參照文獻(xiàn)[10-11]的方法,略加修改進(jìn)行測定。將血清和乙二醇雙氨基四乙酸-Mg2+-明膠巴比妥緩沖液按不同比例混合,加入0.1 mL紅細(xì)胞,在25 ℃水浴下孵育90 min后,4000 r/min離心(離心半徑20 cm)10 min,取上清液,測吸光度(414 nm),計算各管修正值,算出溶血率為50%所需稀釋補體的體積(mL),換算出的濃度補體量,即為1個ACH50單位。

1.4.7 肝臟中抗氧化蛋白基因的相對表達(dá)水平測定

抗氧化蛋白基因的表達(dá)水平測定方法與文獻(xiàn)[12]的方法相似,各引物信息見表2。應(yīng)用2-ΔΔCt法,基準(zhǔn)為60 mg/kg姜黃素添加組的基因表達(dá)水平。

表2 PrxⅠ、PrxⅡ、PrxⅢ、PrxⅣ、PrxⅤ、PrxⅥ基因熒光定量PCR引物Tab.2 Primers for real time PCR analysis of PrxⅠ, PrxⅡ, PrxⅢ, PrxⅣ, PrxⅤ, and PrxⅥ genes

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。用單因子方差分析及鄧肯多重比較檢驗各試驗組間差異顯著性,P<0.05為差異顯著,數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜黃素對大口黑鱸生長及形體指標(biāo)的影響

經(jīng)過60 d的養(yǎng)殖試驗(表3),隨著姜黃素含量的升高,大口黑鱸質(zhì)量增加率及特定生長率先升后降。60 mg/kg的姜黃素顯著提高了大口黑鱸的質(zhì)量增加率及特定生長率(P<0.05)。60 mg/kg姜黃素組飼料系數(shù)最低,顯著低于對照組(P<0.05)。同時,各組間魚體肝體指數(shù)、臟體指數(shù)及存活率差異不顯著(P>0.05)。

表3 姜黃素對大口黑鱸生長性能和形體指標(biāo)的影響Tab.3 Effects of curcumin on growth performance of largemouth bass M. salmoides

2.2 姜黃素對大口黑鱸血液指標(biāo)的影響

白細(xì)胞密度隨著姜黃素含量的增加呈先升后降的趨勢,30 mg/kg和60 mg/kg姜黃素組白細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05)(表4)。此外,各組間魚體血紅蛋白質(zhì)量濃度及血紅細(xì)胞數(shù)差異不顯著(P>0.05)。

表4 姜黃素對大口黑鱸血液指標(biāo)的影響Tab.4 Effects of curcumin on haematological analyses of largemouth bass M. salmoides

2.3 姜黃素對大口黑鱸生理生化指標(biāo)的影響

隨著姜黃素添加量的增多,大口黑鱸谷丙轉(zhuǎn)氨酶及谷草轉(zhuǎn)氨酶活性呈先降后升的趨勢,60 mg/kg姜黃素顯著降低了谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性(P<0.05),30 mg/kg和60 mg/kg組谷草轉(zhuǎn)氨酶活性顯著低于對照組(P<0.05);30 mg/kg和60 mg/kg姜黃素但大口黑鱸白蛋白質(zhì)量濃度較高(表5)。而各組間魚體總蛋白、乳酸脫氫酶、球蛋白含量無顯著差異(P>0.05)。

表5 姜黃素對大口黑鱸生理生化指標(biāo)的影響Tab.5 Effects of curcumin on biochemical indices of largemouth bass M. salmoides

2.4 姜黃素對大口黑鱸非特異性免疫指標(biāo)的影響

各組之間細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性差異不顯著(P>0.05)(圖1);各組添加的姜黃素均顯著提高了腫瘤壞死因子-α的活性(P<0.05)(圖2);60 mg/kg姜黃素顯著提高了白細(xì)胞介素-1β活性(P<0.05)(圖3);30、60 mg/kg和120 mg/kg姜黃素顯著提高了補體替代途徑活性(P<0.05)(圖4)。

圖1 姜黃素對大口黑鱸呼吸爆發(fā)活性的影響Fig.1 Effects of curcumin on respiratory burst activity of largemouth bass M. salmoides

圖2 姜黃素對大口黑鱸腫瘤壞死因子-α活性的影響Fig.2 Effects of curcumin on TNF-α activity of largemouth bass M. salmoides

圖3 姜黃素對大口黑鱸白細(xì)胞介素-1β活性的影響Fig.3 Effects of curcumin on IL-1β activity of largemouth bass M. salmoides

圖4 姜黃素對大口黑鱸補體替代途徑活性的影響Fig.4 Effects of curcumin on ACH50 activity of largemouth bass M. salmoides

2.5 姜黃素對大口黑鱸抗氧化蛋白基因的影響

和對照組相比,60、120 mg/kg和240 mg/kg姜黃素顯著提高了肝臟中PrxⅠ基因的表達(dá)水平(P<0.05)(圖5a);60 mg/kg和120 mg/kg姜黃素顯著提高了肝臟中PrxⅡ基因的表達(dá)水平(P<0.05)(圖5b);與對照組相比,各組姜黃素均顯著提高了PrxⅣ、PrxⅤ基因表達(dá)水平(P<0.05)(圖5d、5e);15、30 mg/kg和60 mg/kg姜黃素顯著提高了PrxⅥ基因的表達(dá)水平(P<0.05)(圖5f)。

圖5 姜黃素對大口黑鱸Prx mRNA表達(dá)水平的影響Fig.5 Effects of curcumin on relative expression level of Prx mRNA of largemouth bass M. salmoides

3 討 論

3.1 姜黃素對大口黑鱸生長性能的影響

在對尼羅羅非魚等的研究中發(fā)現(xiàn),姜黃素可以通過提高腸道消化酶活性,促進(jìn)吸收飼料中的營養(yǎng)物質(zhì),從而提高飼料利用率[6]。本試驗結(jié)果顯示,在大口黑鱸日糧中添加60 mg/kg的姜黃素,可顯著提高大口黑鱸特定生長率和質(zhì)量增加率,降低餌料系數(shù)。其原因應(yīng)該是日糧中60 mg/kg的姜黃素,提高了腸道內(nèi)的消化酶活性,日糧中的營養(yǎng)物質(zhì)能被更好地消化吸收,從而提高了大口黑鱸的特定生長率和質(zhì)量增加率,這與對大鼠[13]、小鼠[14]、尼羅羅非魚[6]等的研究結(jié)果一致。

日糧中過量添加姜黃素對大口黑鱸生長性能產(chǎn)生不良影響。這與對羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)[15]、建鯉(Cyprinuscarpiovar.jian)[16]、尼羅羅非魚[17]的研究報道一致。過量添加姜黃素產(chǎn)生不利影響的原因可能是:過量添加會導(dǎo)致飼料適口性變差,影響?zhàn)B殖對象攝食水平;也可能與過量的姜黃素促氧化作用有關(guān)[18];另外,姜黃素還會對腸道菌群有負(fù)面影響,從而影響消化吸收。此外,姜黃素添加水平對大口黑鱸肝體指數(shù)、臟體指數(shù)、存活率和肥滿度無顯著影響,說明姜黃素是一種低毒的優(yōu)質(zhì)膳食補充劑,此結(jié)果與胡忠澤等[19-20]關(guān)于姜黃素化學(xué)成分和毒性研究結(jié)果一致。

3.2 姜黃素對大口黑鱸血液及生理生化指標(biāo)的影響

血液生化指標(biāo)檢測已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖研究中。其中,白細(xì)胞作為血液中消除有害微生物的第一道防線,被認(rèn)為是非特異性免疫中最主要的物質(zhì)之一,是機體免疫功能和健康狀況正常與否的重要指標(biāo)。本試驗中,添加60 mg/kg的姜黃素顯著提高了大口黑鱸血液中白細(xì)胞數(shù)量,這與在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[21]上的研究結(jié)果相同,說明姜黃素可能會刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng),從而提高機體免疫功能。本試驗中,各組血紅蛋白含量和紅細(xì)胞數(shù)無顯著差異,這與對虹鱒、斑點叉尾(Ictaluruspunctatus)[22-23]的研究結(jié)果不同,可能是因為不同物種、不同養(yǎng)殖密度、不同養(yǎng)殖階段、不同姜黃素添加量等都會對試驗結(jié)果產(chǎn)生差異,具體的反應(yīng)機制還需進(jìn)一步研究。

白蛋白及總蛋白含量增加表明機體的先天免疫功能增強[22,24]。本試驗中,添加姜黃素提高了大口黑鱸血清中白蛋白含量,這與對尖吻鱸(Latescalcarifer)[25]的研究結(jié)果一致。一般來說,谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性增加說明肝臟受到一定程度損傷[26],大口黑鱸日糧中添加60 mg/kg姜黃素降低了血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性,與在草魚(Ctenopharyngodonidella)[27]、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[28]、尼羅羅非魚[29]中的變化趨勢一致。這表明適當(dāng)添加姜黃素可降低血清中的轉(zhuǎn)氨酶活性,對肝臟有一定的保護(hù)作用。這可能與姜黃素中具有的二酮和酚羥基基團(tuán)有關(guān),這種特有結(jié)構(gòu)能夠有效清除氧化自由基,提高機體的抗氧化能力[30],保護(hù)肝臟。

3.3 姜黃素對大口黑鱸炎癥因子的影響

呼吸爆發(fā)又稱為氧爆發(fā),是再灌注時自由基生成的重要途徑之一,也是機體免疫反應(yīng)的重要組成部分。本試驗結(jié)果表明,60 mg/kg姜黃素可提高大口黑鱸的細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性,這與對團(tuán)頭魴[31]的研究結(jié)果一致。白細(xì)胞介素-1β是機體發(fā)生炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì),在本試驗中飼料添加60 mg/kg姜黃素顯著提高了白細(xì)胞介素-1β活性。但有相關(guān)研究報道,姜黃素對細(xì)胞中的白細(xì)胞介素-1β表達(dá)有抑制作用[32]。大部分機體的肝臟受損均可能會刺激誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α,以清除受損肝細(xì)胞并促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生愈合反應(yīng)[33]。魚體中腫瘤壞死因子-α是由白細(xì)胞產(chǎn)生的活化因子,能夠改善呼吸爆發(fā)活性、激發(fā)巨噬細(xì)胞吞噬活性[34],這也與本試驗中的白細(xì)胞含量增高相符。本試驗中,隨著姜黃素含量的增加,白細(xì)胞介素-1β和腫瘤壞死因子-α活性升高。腫瘤壞死因子-α是典型的促炎因子,機體在應(yīng)激狀態(tài)下發(fā)生內(nèi)分泌紊亂和激素水平的異常,也會使機體腫瘤壞死因子-α活性升高[35]。肝臟白細(xì)胞介素-1β具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用,能夠分泌免疫球蛋白及介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等[36]。因本試驗中大口黑鱸的白細(xì)胞介素-1β和腫瘤壞死因子-α與其他報道的變化趨勢不同,故大膽推測可能是大口黑鱸有炎癥或是有其他應(yīng)激反應(yīng),具體的原因還需要進(jìn)一步的研究。補體替代途徑是機體中關(guān)鍵的殺菌機制[37],本試驗結(jié)果顯示,補體替代途徑溶血活性在60 mg/kg姜黃素組顯著增強。以上結(jié)果表明,姜黃素可有效緩解肝臟炎癥。可能的原因是:姜黃素通過抑制一氧化碳和活性氧信號的釋放,從而減少中性粒細(xì)胞的滲漏[38];直接調(diào)控巨噬細(xì)胞或抑制核轉(zhuǎn)錄因子信號通路,減少了炎癥因子的釋放,從而緩解炎癥反應(yīng)[39]。

3.4 姜黃素對大口黑鱸抗氧化蛋白基因表達(dá)的影響

Prx是一類常見的過氧化物酶,共有6個成員,分別為PrxⅠ、PrxⅡ、PrxⅢ、PrxⅣ、PrxⅤ、PrxⅥ,均具有清除細(xì)胞中過多氧自由基的作用,可以將細(xì)胞中過多的過氧化氫還原為水,從而清除機體內(nèi)過多的活性氧分子[40]。本試驗中,隨著大口黑鱸飼料中姜黃素添加水平的不斷提高,抗氧化蛋白基因表達(dá)水平均呈現(xiàn)先升后降的趨勢,表明一定水平的姜黃素可提高大口黑鱸肝臟的抗氧化功能,并且添加60 mg/kg的姜黃素效果最為顯著?？赡艿脑蚴?姜黃素結(jié)構(gòu)中的酚羥基基團(tuán)能夠清除自由基,有利于機體對過氧化氫、活性氧和脂質(zhì)氫過氧化物等的清除,從而間接降低了脂質(zhì)過氧化損傷[41]。

4 結(jié) 論

綜上所述,大口黑鱸日糧中適當(dāng)添加姜黃素能顯著提高魚體生長性能、免疫功能和抗氧化水平,降低炎癥因子水平,且日糧中60 mg/kg姜黃素添加量為大口黑鱸的最適添加水平。