高 娜,盧 霞,閆允君,孔 杰,孟憲紅,李旭鵬,隋 娟,陳寶龍,曹寶祥,高 煥,欒 生

( 1.江蘇海洋大學(xué) 海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院,江蘇省海洋生物技術(shù)重點試驗室,江蘇 連云港 222005; 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室,山東 青島 266071; 3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室,海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室,山東 青島 266071; 4.中國科學(xué)院 煙臺海岸帶研究所,沿海生物資源高效利用研究開發(fā)中心,山東 煙臺 264003 )

動物肌肉的發(fā)生過程主要處于胚胎發(fā)育時期內(nèi),是在一系列基因復(fù)雜而精確的調(diào)控下進行的[1-2]。近年來,DNA重組、基因敲除等多種技術(shù)的廣泛應(yīng)用,使得胚胎肌肉生成的分子調(diào)控機制研究取得了極大的進展。轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)是一類龐大的調(diào)控動物肌肉生長發(fā)育的超家族,該家族中的多個基因已被證實與肌肉發(fā)育有直接或間接的關(guān)系。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)是從牛骨中分離的TGF-β超家族中的一員[3],可以啟動從軟骨形成到頭骨形成的過程[4]。截至目前,骨形態(tài)發(fā)生蛋白已被證明是一種多功能分泌信號蛋白,對各種細胞類型包括單核細胞[5-7]、上皮細胞[8]、間充質(zhì)細胞[9]、神經(jīng)細胞[10]均有廣泛的生物學(xué)活性。骨形態(tài)發(fā)生蛋白調(diào)節(jié)這些細胞的生長分化,并在各種組織和器官的形態(tài)形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。對脊椎動物骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族的研究較多,如:褚建新等[12]發(fā)現(xiàn),給正常小鼠大腿肌肉內(nèi)植入rh-BMP-2基因后,可以激活自身肌肉間質(zhì)細胞間接拯救骨髓衰竭;有研究證明,BMP-2基因間接參與了爪蟾(Xenopus)肌肉發(fā)生的起始特化過程[13]。近年來,一些無脊椎動物如棘皮動物[14-15]、節(jié)肢動物[16-17]、軟體動物[18-20]等的骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族成員也逐漸被克隆成功,發(fā)現(xiàn)其功能與脊椎動物的功能相似。

中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)是黃、渤海區(qū)域的特有種類,肉質(zhì)鮮嫩,具有較高的經(jīng)濟價值,歷史最高產(chǎn)量達到2.0×105t;但由于過度捕撈和環(huán)境惡化,其野生資源急劇減少,國內(nèi)養(yǎng)殖產(chǎn)量遠遠不能滿足市場的需求[21-23]。生長速度是決定養(yǎng)殖產(chǎn)量最為重要的經(jīng)濟性狀之一。骨形態(tài)發(fā)生蛋白是動物肌肉生長發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子,在脊椎動物及某些無脊椎動物的生長細胞中起關(guān)鍵作用。然而,關(guān)于骨形態(tài)發(fā)生蛋白調(diào)控中國明對蝦肌肉發(fā)生和生長的研究尚未見相關(guān)報道。筆者克隆了中國明對蝦骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族中的BMP-7基因成員,通過實時熒光定量PCR (qRT-PCR)技術(shù)分析了FcBMP-7基因在中國明對蝦幼體不同發(fā)育時期和生長速度差異顯著的幼蝦不同組織中的表達規(guī)律,為進一步解析中國明對蝦肌肉發(fā)生發(fā)育的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用中國明對蝦樣本均來自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部(青島)海水養(yǎng)殖遺傳育種中心第13代選育群體。中國明對蝦幼體不同發(fā)育階段取樣:分別從胚胎發(fā)育階段的原腸期和4個幼體發(fā)育階段無節(jié)幼體期、溞狀幼體期、糠蝦幼體期和仔蝦期采集10尾家系樣本,每個階段每個家系取50～60尾混合為1個樣本,其中大部分內(nèi)容物為肌肉。取幼蝦期同一家系的2種規(guī)格[(3.95±0.08) g和 (1.55±0.12) g]各10尾蝦的不同組織部位(心臟、鰓、肝胰腺、胃、腸道、肌肉、步足和游泳足),放入凍存管立即加入液氮后-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA的合成

利用Trizol法提取以上樣品的總RNA,通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性,用分光光度計檢測RNA濃度。采用HiScript ⅢRT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme,南京)合成第1鏈cDNA,-20 ℃保存。

1.2.2 FcBMP-7基因的克隆

在中國明對蝦的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)篩選到BMP-7基因部分cDNA片段。根據(jù)已知序列設(shè)計5′RACE和3′RACE特異性引物,設(shè)計原則參照5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends version 2.0 (Invitrogen,美國)和SMARTer?RACE 3′ Kit (Clontech,美國)試劑盒的說明書(表1)。

1.2.3 FcBMP-7蛋白的生物信息學(xué)分析

利用BioEdit軟件將3′RACE和5′RACE擴增片段與已知序列進行拼接,獲得FcBMP-7基因的cDNA全長序列。通過DNAMAN 8.0翻譯氨基酸序列;利用BLASTP (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行預(yù)測蛋白序列的同源性比對;通過Protparam (http://www.expasy.org/tools/protparam.html)預(yù)測蛋白的等電點和分子質(zhì)量;采用NetNGlyc 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)查找糖基化位點;通過NetPhos 2.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)查找磷酸化位點;利用ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)進行氨基酸序列的比對;基于MEGA 7.0的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(自展值為1000)。

1.2.4 FcBMP-7基因的表達模式分析

以18S rRNA為內(nèi)參基因,通過實時熒光定量PCR檢測FcBMP-7基因在不同發(fā)育時期、不同生長速率的2組蝦的不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平,反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒(Vazyme,南京)說明書進行。利用2-△△Ct方法[24]計算FcBMP-7基因的相對表達量。試驗所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 試驗所用引物序列Tab.1 The primer sequences used in this study

利用Excel 2016軟件分析中國明對蝦幼體和幼蝦不同組織FcBMP-7基因的表達量。利用SPSS 25.0中的單因素方差分析,對FcBMP-7基因在幼體不同時期間以及幼蝦不同規(guī)格間的轉(zhuǎn)錄表達差異進行顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 FcBMP-7基因的克隆及生物信息學(xué)分析

由于中國明對蝦轉(zhuǎn)錄組篩選得到的BMP-7基因cDNA序列不完整,因此分別進行5′RACE和3′RACE擴增5′和3′端的序列。其中5′RACE獲得541 bp序列 (圖1a),3′RACE得到409 bp序列 (圖1b)。與原序列拼接后得到中國明對蝦BMP-7基因2003 bp的全長cDNA序列,其中開放閱讀框為1242 bp,編碼413個氨基酸,5′非編碼區(qū)為466 bp,3′非編碼區(qū)為295 bp(圖2),將其命名為FcBMP-7基因(GenBank登錄號: MW048584)。

圖1 RACE擴增片段的電泳結(jié)果Fig.1 Eelectrophoresis of RACE amplificationa.5′ RACE電泳結(jié)果;b.3′ RACE電泳結(jié)果.a.electrphoresis of 5′ RACE amplification; b.electrphoresis of 3′ RACE amplification.

圖2 FcBMP-7基因的全長cDNA及推測編碼的氨基酸序列Fig.2 Full length cDNA and the putative amino acid sequence of FcBMP-7 gene黑色加粗部分為起始密碼子和終止密碼子;灰色陰影為磷酸化位點;實線方框為N-糖基化位點;下劃線為跨膜螺旋結(jié)構(gòu);斜體加粗的部分為TGF-β多功能肽.The initiator and the terminator are marked by black bold; the phosphorylation sites are denoted by gray shadow; the N-glycosylation sites are framed with solid lines; a transmembrane helix region is described as underlined part; the multifunctional peptide of TGF-β is expresse by italic bold.

該蛋白的等電點為6.20,分子質(zhì)量為45.6 ku。蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測表明,在該基因編碼蛋白序列中,α螺旋占22.28%、延伸鏈占21.07%、β轉(zhuǎn)角占6.05%、無規(guī)則卷曲占50.60%(圖3)。

圖3 FcBMP-7蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 The prediction of the secondary structure for FcBMP-7 proteinConf.預(yù)測可信度;Cart.三態(tài)分配;Pred.三態(tài)預(yù)測;AA.目標序列.Conf.confidence of prediction; Cart.3-state assignment cartoon; Pred.3-state prediction; AA.target sequence.

2.2 FcBMP-7蛋白的同源性比對及系統(tǒng)進化樹分析

FcBMP-7蛋白的氨基酸序列與其他物種進行同源性比對分析結(jié)果見圖4。FcBMP-7蛋白與節(jié)肢動物各物種的BMP-7蛋白具有很高的相似性,在相對保守區(qū)域有7個半胱氨酸殘基,其位置分別是307、336、340、377、378、410、412位氨基酸。此外,該蛋白還含有1個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域(13～35位氨基酸)和1個信號肽,信號肽的剪切位點位于第31和32位氨基酸之間。FcBMP-7蛋白與凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)BMP-7蛋白的同源性最高,達到98%;其次是脊尾白蝦(Palaemoncarinicauda)和中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis),同源性分別是75%和72%;與軟體動物如文蛤(Meretrixmeretrix)及三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)等的相似性較低,同源性為30%～34%。

圖4 FcBMP-7蛋白序列與其他已知物種BMP-7蛋白的同源比對結(jié)果Fig.4 Results of homologous comparison between FCBMP-7 protein sequence and BMP-7 protein of other known speciesBMP-7氨基酸序列比對物種的GenBank登錄號:凡納濱對蝦BMP-7, XM_027355389.1;脊尾白蝦BMP-7, AYC12382.1;中華絨螯蟹BMP-7, AWV66904.1;擬穴青蟹BMP-7, AOZ56940.1;智人BMP-7, NM_001719.3;原雞BMP-7, XM_417496.6;莫桑比克羅非魚BMP-7, FN565169.2;非洲爪蟾BMP-7, NP_001079934.1.GenBank accessions numbers of BMP-7 amino acid sequence alignment:L. vannamei BMP-7, XM_027355389.1; P. carinicauda BMP-7, AYC12382.1; E. sinensis BMP-7, AWV66904.1; S. paramamosain BMP-7, AOZ56940.1; H. sapiens BMP-7, NM_001719.3; G. gallus BMP-7, XM_417496.6; O. mossambicus BMP-7, FN565169.2; X. laevis BMP-7, NP_001079934.1.

FcBMP-7蛋白的系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果見圖5。中國明對蝦與凡納濱對蝦首先聚為一支,隨后與脊尾白蝦、中華絨螯蟹聚為一個甲殼類分支,然后與軟體動物如文蛤、三角帆蚌等分支共同形成一個大的無脊椎動物分支,整個無脊椎動物分支又與脊椎動物分支共同組成完整的進化樹,可見FcBMP-7蛋白在進化樹中與中國明對蝦的進化地位和分類階元基本一致。

圖5 基于鄰接法構(gòu)建的FcBMP-7 蛋白與其他已知物種BMP-7蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of FcBMP-7 protein and other known species BMP-7 protein based on the neighbor-joining method

2.3 FcBMP-7基因的表達模式分析

2.3.1 FcBMP-7基因在中國明對蝦幼體不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄水平分析

實時熒光定量PCR分析了FcBMP-7基因在中國明對蝦幼體發(fā)育不同時期的表達情況,結(jié)果見圖6。FcBMP-7基因在中國明對蝦各幼體發(fā)育階段均有表達,但表達水平不同,其中在原腸期表達最低,從無節(jié)幼體階段開始表達量顯著增加,糠蝦幼體階段達到最高,仔蝦階段表達量顯著降低。

圖6 FcBMP-7基因在中國明對蝦幼體發(fā)育不同時期的轉(zhuǎn)錄表達水平Fig.6 The relative expression level of FcBMP-7 gene in Chinese shrimp F. chinensis at different development stagesⅠ.原腸期;Ⅱ.無節(jié)幼體期;Ⅲ.溞狀幼體期;Ⅳ.糠蝦幼體期;Ⅴ.仔蝦期;不同字母表示組間存在顯著性差異(P<0.05).Ⅰ.gastrula stage; Ⅱ.nauplius stage; Ⅲ.zoea stage; Ⅳ.mysis stage; Ⅴ.post-larval stage; means with different letters are significant differences among groups (P<0.05).

2.3.2 FcBMP-7基因在中國明對蝦2種規(guī)格幼蝦不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平

FcBMP-7基因在中國明對蝦2種規(guī)格幼蝦不同組織中的表達結(jié)果見圖7。FcBMP-7基因的表達量在2種幼蝦大部分組織部位間存在顯著差異,除了肝胰腺和鰓組織外,在 (1.55±0.12) g幼蝦中FcBMP-7基因的表達量顯著高于(3.95±0.08) g幼蝦。在(3.95±0.08) g幼蝦不同組織中,表達量最高的是鰓,其次是胃、游泳足和步足,表達量最少的是肌肉;在(1.55±0.12) g幼蝦不同組織中,表達量最高的是鰓和游泳足,其次是步足和胃,表達量最少的是肝胰腺。

圖7 FcBMP-7基因在2種規(guī)格蝦不同組織中的表達水平Fig.7 The expression levels of FcBMP-7 gene in different tissues of large prawn and small juvenile shrimpA.肝胰腺;B.肌肉;C.腸道;D.心臟;E.胃;F.步足;G.游泳足;H.鰓; “*”表示兩組之間存在顯著性差異(P<0.05);“**”表示兩組之間存在顯著性差異(P< 0.01);“***”表示兩組之間存在顯著性差異(P<0.001).A.hepatopancreas; B.muscle; C.intestine; D.heart; E.stomach; F.periopod; G.pleopod; H.gill; “*” indicates significant difference between the two groups (P<0.05); “**” indicates significant difference between the two groups (P<0.01); “***” indicates significant difference between the two groups (P<0.001).

3 討 論

3.1 FcBMP-7基因的生物信息學(xué)分析

BMP-7蛋白作為TGF-β蛋白超家族中的一員,是Ozkaynak等[25]于牛成骨蛋白提取物中分離的一種新型轉(zhuǎn)化生長因子。筆者通過cDNA末端快速擴增技術(shù)擴增克隆得到了FcBMP-7基因全長cDNA,對FcBMP-7蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的分析發(fā)現(xiàn),該蛋白的信號肽長度為31位氨基酸,在羧基末端有一個重要的TGF-β多功能結(jié)構(gòu)域(第307～413位氨基酸),即成熟肽,該結(jié)構(gòu)域可控制多種細胞的增殖、生長、分化等功能。信號肽與成熟肽之間的第32～307位氨基酸稱為前肽。與其他已知物種的BMP-7蛋白序列比對分析后發(fā)現(xiàn),在此TGF-β保守結(jié)構(gòu)域中,有7個高度保守的半胱氨酸殘基,與人BMP-7蛋白單體的半胱氨酸殘基結(jié)構(gòu)相同, 可以形成3對鏈內(nèi)二硫鍵, 剩余的1個半胱氨酸參與鏈間二硫鍵形成[26]。以上分析表明,FcBMP-7蛋白含有TGF-β蛋白超家族的特征序列,是TGF-β蛋白超家族中的多功能分泌性蛋白。對中國明對蝦BMP-7蛋白與其他物種BMP-7蛋白的氨基酸序列進行聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn),即使經(jīng)過漫長的進化和演變,對蝦類BMP-7蛋白和脊椎動物BMP-7蛋白仍具有較高的同源性,表明該基因在整個動物界可能保持著相似的生理功能。

3.2 FcBMP-7基因的表達情況分析

近年來,對BMP-7基因的研究多集中在臨床疾病[27-28]、軟骨形成[29-31]以及各組織纖維化[32-33]等,對其在肌肉生長和發(fā)育中作用的研究相對較少[34]。為探明BMP-7基因在蝦類肌肉生長發(fā)育中作用,筆者分析了FcBMP-7基因在中國明對蝦早期發(fā)育不同階段以及生長速率具有顯著差異的2種規(guī)格幼蝦不同組織中的表達水平。

3.2.1 FcBMP-7基因在中國明對蝦幼體不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄水平

本試驗中國明對蝦幼體不同發(fā)育時期的表達結(jié)果顯示,FcBMP-7基因在中國明對蝦早期發(fā)育的5個時期均有表達,特別是在無節(jié)幼體時期開始顯著高表達,在糠蝦幼體期顯著增加并達到表達高峰,仔蝦期表達量逐漸降低。中國明對蝦作為甲殼類的典型動物,具有其獨特的發(fā)育模式,主要是肌肉系統(tǒng)的生成和完善。中國明對蝦的肌肉從無節(jié)幼體時期開始陸續(xù)生成[35-36],糠蝦幼體期是肌肉生成的重要階段,直到仔蝦期形成了較為完善的肌肉系統(tǒng)[37]。肌肉生成的過程與FcBMP-7基因的表達變化規(guī)律一致,由此推測FcBMP-7基因可能在對蝦早期變態(tài)期的肌肉發(fā)生過程中發(fā)揮一定的作用,有待于后期進行深入的研究進行驗證。

3.2.2 FcBMP-7基因在中國明對蝦2種規(guī)格幼蝦不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平

通過分析中國明對蝦2種規(guī)格幼蝦不同組織的表達結(jié)果發(fā)現(xiàn),FcBMP-7基因在中國明對蝦的各組織中廣泛性表達,表明FcBMP-7基因并不具備組織特異性表達特征,可能在對蝦體內(nèi)具有多種生理功能。值得注意的是,(3.95±0.08) g幼蝦FcBMP-7基因的表達量除了在肝胰腺中高于(1.55±0.12) g幼蝦外,在其他組織部位中的表達量均低于(1.55±0.12) g組幼蝦(鰓差異不顯著),與BMP-7基因在擬穴青蟹卵黃發(fā)育中的表達量隨著卵黃的成熟而呈逐漸降低的趨勢[38]相符合,并且存在明顯的組織差異性。Yan等[39]對比分析了與本試驗相同的2種規(guī)格幼蝦不同組織部位(肌肉、心臟、步足、游泳足、鰓)肌纖維的數(shù)量與直徑,結(jié)果顯示,在肌肉、游泳足和步足等組織部位中,兩組間肌纖維的數(shù)量與直徑差異顯著。雖然(3.95±0.08) g幼蝦的肌纖維數(shù)量明顯少于(1.55±0.12) g幼蝦,但是前者肌肉纖維的直徑明顯大于后者。綜合分析上述結(jié)果顯示:FcBMP-7基因可能參與調(diào)控肌纖維的數(shù)量與生長,作為調(diào)節(jié)因子參與了中國明對蝦幼蝦的肌肉生長過程。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果初步表明,FcBMP-7基因在中國明對蝦肌肉的發(fā)生及生長過程中具有一定的表達水平,推測FcBMP-7基因可能作為調(diào)節(jié)因子參與了中國明對蝦幼蝦肌肉發(fā)生和幼蝦肌肉生長過程。該結(jié)果可為進一步研究FcBMP-7基因的功能提供重要的理論資料,同時為解析中國明對蝦肌肉生長發(fā)育的調(diào)控機制提供線索。