侯燕紅，段新慧，欒旭輝，周 凱，韓 博，姜 華，何承剛

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

野豌豆屬(ViciaL.)是豆科(Leguminosae)野豌豆族(Viciae)的一年、兩年或多年生草本植物，由林奈建于1753 年，中國現(xiàn)有本屬植物43 種5 變種[1]。該屬植物具有清香味，可作野生蔬菜食用；其吸收磷肥能力強，又被廣泛用作綠肥作物；有的還可以入藥[2]；最重要的是其生育周期短、蛋白質(zhì)含量高和適口性好，被世界各國作為優(yōu)良牧草廣泛栽培。但由于其植株形態(tài)差異較大且沒有具體的鑒定依據(jù)，給該屬植物的識別帶來了較大的困難。國內(nèi)外諸多學(xué)者先后從細(xì)胞學(xué)[3]、花粉學(xué)[4]、解剖學(xué)[5]、分類學(xué)[6]和分子生物學(xué)[7]等方面對其進行了研究，為深入了解本屬植物資源奠定了良好的基礎(chǔ)。

葉片作為植物直接接受光照的器官，其形態(tài)特征相對保守和穩(wěn)定，對植物系統(tǒng)的分類研究具有重要意義[8]。史傳奇等[9]深入研究了東北豆科山羊豆族4 屬25 種植物葉的形態(tài)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)托葉質(zhì)地、托葉與葉柄聯(lián)合程度及小葉葉緣是否反卷等特征可作為棘豆屬的識別特征。DOGAN 等[10]將葉片形態(tài)與花和果實形態(tài)特征相結(jié)合，運用數(shù)量分類學(xué)方法證明葉長、小葉數(shù)、托葉形狀及葉軸末端是否具卷須等葉片形態(tài)特征對土耳其山黧豆屬組間劃分具有重要作用。鄭太坤等[11]對4 種野豌豆屬植物的研究表明：通過小葉形狀可區(qū)分部分野豌豆屬植物。常媛飛等[12]通過對野豌豆屬14 個牧草幼苗形態(tài)多樣性指標(biāo)的研究，提出五葉期株高和莖柔毛密度等指標(biāo)可作為本屬植物分類鑒定的依據(jù)。植物葉表皮微形態(tài)特征也同樣具有重要的分類價值，可為植物在種及亞種水平上的分類提供依據(jù)[13-14]。許少祺等[15]對山野豌豆和大葉野豌豆的葉片微形態(tài)進行研究，發(fā)現(xiàn)其葉表皮微形態(tài)結(jié)構(gòu)之間有所不同。雒宏佳[16]研究了野豌豆屬植物葉表皮微形態(tài)特征，提出葉表皮微形態(tài)特征可為區(qū)分種提供依據(jù)。還有學(xué)者對29 種野豌豆屬植物葉表皮微形態(tài)特征進行了觀察，發(fā)現(xiàn)這些特征在屬內(nèi)組間沒有明確的規(guī)律性，但可為探討該屬種間的分類學(xué)及親緣關(guān)系提供依據(jù)[17]。植物葉片的宏觀形態(tài)和微觀形態(tài)在分類學(xué)上均具有重要意義，但是前人對野豌豆屬植物分類的研究較為單一，目前，將葉片宏觀形態(tài)和微觀形態(tài)結(jié)合對其分類的研究還比較缺乏，因此，本研究以云南9 份野豌豆屬牧草資源為材料，對其葉片的宏觀形態(tài)和微觀形態(tài)進行研究，通過相關(guān)性、遺傳多樣性、主成分和聚類方法，分析各材料葉片性狀間的主要差異，得出野豌豆屬植物的葉片形態(tài)特征鑒別依據(jù)，為進一步研究本屬植物分類及系統(tǒng)學(xué)提供形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為9 份野豌豆屬植物資源的種子(表1)。將挑選出來的優(yōu)質(zhì)種子種植于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)草學(xué)系植物生長室，自種植之日開始觀察、記錄其形態(tài)特征，并進行正常養(yǎng)護管理。

表1 供試材料與來源Tab.1 Test materials and their sources

1.2 觀測項目

1.2.1 宏觀性狀

從植物出苗時開始觀察并測量植物葉片的宏觀性狀，指標(biāo)測量和記錄參考常媛飛等[12]的方法，每次測量重復(fù)5 次。五葉期后觀察記錄小葉形狀、莖柔毛密度、小葉尖端鋸齒情況和卷須柔毛密度等性狀指標(biāo)。上述質(zhì)量性狀采用賦值的方法進行記錄，測量指標(biāo)和賦值方法參考常媛飛等[12]的方法(表2)。

表2 野豌豆屬葉片宏觀和微觀性狀測定指標(biāo)Tab.2 Measurement indexes of leaf macroscopic and microscopic traits inVicia

1.2.2 微觀性狀

分別取各野豌豆屬植物中部成熟健康的葉片1～2 片，撕取葉片下表皮制成臨時裝片。用光學(xué)顯微鏡在40 倍物鏡下對20 個視野中的細(xì)胞形狀和氣孔器類型等指標(biāo)進行觀察、測量并拍照，各指標(biāo)測定標(biāo)準(zhǔn)見表2。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2019 對各性狀進行統(tǒng)計，9 種材料的宏觀性狀變異系數(shù)及遺傳多樣性指數(shù)的計算參照王繼師等[18]的方法；采用SPSS 26 對所有性狀進行主成分分析、相關(guān)性分析和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片宏觀性狀分析

9 份材料宏觀性狀的差異和遺傳多樣性分析結(jié)果見表3。9 份材料的小葉尖端均有鋸齒，小葉相對大小差異明顯，小葉背面顏色大多較正面顏色淡。14 個指標(biāo)的變異范圍在0.00%～49.13%之間，其中小葉尖端鋸齒的變異系數(shù)為0.00%，即種間無差異，莖柔毛密度的變異系數(shù)高達49.13%；遺傳多樣性指數(shù)范圍在0.00～1.06 之間，其中最小的是小葉尖端鋸齒，最大的是莖柔毛密度，其余性狀的遺傳多樣性指數(shù)均小于1.00。

表3 宏觀性狀的變異分析及遺傳多樣性分析Tab.3 Variation analysis and genetic diversity analysis of macroscopic traits

2.2 葉片微觀形態(tài)分析

由表4 可知：蘭花苕子2 的氣孔長度顯著大于除四籽野豌豆和光葉紫花苕2 外的其他材料(P＜0.05)，毛葉苕子的氣孔長度最小(20.51 μm)；四籽野豌豆、蘭花苕子1、蘭花苕子2、光葉紫花苕2 和箭筈豌豆1 的氣孔寬度差異不顯著(P＞0.05)，且均顯著大于光葉紫花苕1 和毛葉苕子(P＜0.05)；光葉紫花苕1 的氣孔器顯著大于蘭花苕子1、光葉紫花苕2 和箭筈豌豆1 (P＜0.05)，且后三者之間差異不顯著(P＞0.05)，其余6 個材料間差異也不顯著(P＞0.05)；箭筈豌豆1 的氣孔指數(shù)顯著大于其他材料(P＜0.05)，四籽野豌豆的氣孔指數(shù)最小(4.68%)；箭筈豌豆1 的氣孔密度顯著大于其他材料(P＜0.05)，多葉野豌豆和箭筈豌豆2 之間差異不顯著(P＞0.05)，且顯著高于除箭筈豌豆1 外的其他材料(P＜0.05)；9 個材料的細(xì)胞形狀、垂周壁式樣和氣孔器類型均一致。

表4 野豌豆屬植物葉片下表皮植紋特征Tab.4 Characteristics of leaf lower epidermal plant print ofViciaspecies

2.3 葉片形態(tài)主成分分析

由于小葉尖端鋸齒情況、細(xì)胞形狀、垂周壁式樣和氣孔器類型無差異，故以上指標(biāo)不進行主成分分析和相關(guān)性分析。

由表5 可知：前5 個主成分特征值大于1，累計貢獻率達到92.02%，包含了13 個葉片宏觀形態(tài)和5 個葉表皮微形態(tài)的絕大部分信息。5 個主成分中載荷較高的性狀為莖柔毛密度、小葉柔毛密度、托葉大小、氣孔指數(shù)和氣孔密度。

表5 野豌豆屬葉片形態(tài)的主成分載荷矩陣和累計貢獻率Tab.5 Principal component loading matrix and cumulative contribution rate of leaf morphological inVicia

2.4 葉片形態(tài)相關(guān)性分析

由表6 可知：小葉形狀與莖柔毛密度、小葉柔毛密度、氣孔指數(shù)和氣孔密度均呈極顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.01)；莖柔毛密度與小葉尖端形狀和小葉柔毛密度呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)，且與托葉大小、氣孔指數(shù)和氣孔密度呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)；托葉大小與托葉有無鋸齒呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)；氣孔指數(shù)與氣孔密度呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)。

表6 野豌豆屬植物宏觀和微觀形態(tài)性狀的相關(guān)性Tab.6 Correlation of leaf macroscopic and microscopic traits inVicia

2.5 葉片形態(tài)聚類分析

由圖1 可知：相對距離為15 時，9 份野豌豆屬植物可以聚為2 類：四籽野豌豆單獨成為一類，其余8 份野豌豆屬植物聚成第2 類；相對距離為11 時，9 份野豌豆屬植物可以聚為4 類：第1 類群由蘭花苕子2、蘭花苕子1、光葉紫花苕1 和光葉紫花苕2 組成，第2 類群由毛葉苕子組成，第3 類群由箭筈豌豆1、箭筈豌豆2 和多葉野豌豆組成，第4 類群由四籽野豌豆組成。

圖1 9 份野豌豆屬材料葉片形態(tài)的聚類結(jié)果Fig.1 Morphological clustering results of leaf in nineVicia

3 討論

本研究對9 份供試材料的葉片、柔毛和卷須等宏觀性狀及下表皮微觀性狀的差異進行對比分析，結(jié)果表明：不同種間野豌豆屬牧草葉片形態(tài)差異較大，有利于分類。植物葉片形態(tài)往往可區(qū)分物種，本研究中四籽野豌豆葉片為橢圓形，毛葉苕子葉片為長橢圓形，箭筈豌豆葉片為長橢圓形，該結(jié)果與王燕紅等[19]的調(diào)查結(jié)果一致，表明野豌豆屬植物葉片形態(tài)表現(xiàn)較為穩(wěn)定。除四籽野豌豆與毛葉苕子的托葉無鋸齒外，其余7 種野豌豆屬植物托葉均有鋸齒，與《中國植物志》中的記載一致。四籽野豌豆小葉不被毛，蘭花苕子和光葉紫花苕小葉被毛稀疏，毛葉苕子小葉被毛密集，這與植物本身的植株特征相吻合。供試9 份材料托葉形狀多樣，種間變異大，光葉紫花苕托葉形狀為半箭頭形，與劉云波等[20]的研究結(jié)果一致?！吨袊参镏尽分杏涊d野豌豆屬植物成株多有卷須并且分支，但本研究中僅有四籽野豌豆出現(xiàn)分支，推測是由于本研究觀測時間較早，其余植株尚未形成卷須分支，表明野豌豆屬植物的卷須是隨著時間的推移而日漸成熟并發(fā)達。野豌豆屬植物的葉片形態(tài)差異一般較大，對其進行研究有利于野豌豆屬植物的快速鑒別。葉片表皮微形態(tài)的研究顯示：9 份野豌豆屬植物材料的表皮細(xì)胞均為不規(guī)則形，垂周壁式樣均為深波狀，氣孔器類型均為無規(guī)則形，這與史傳奇等[21]和雒宏佳[16]的研究結(jié)果一致。9 份野豌豆屬材料的氣孔大小種間差異不大，氣孔指數(shù)與氣孔密度種間有明顯差異，有研究表明：氣孔指數(shù)與氣孔密度反映植物對干旱環(huán)境的適應(yīng)性，二者值越大則植物的抗旱能力越強[22]，本研究中多葉野豌豆和箭筈豌豆的氣孔密度與氣孔指數(shù)均較大，推測這2 種植物抗旱性較強。

對野豌豆屬9 份材料的18 個指標(biāo)進行主成分分析發(fā)現(xiàn)：莖柔毛密度、小葉柔毛密度、托葉大小、氣孔指數(shù)和氣孔密度在其對應(yīng)成分中載荷較高，包含本研究所有形態(tài)性狀的絕大部分信息，反映出各材料間的遺傳差異，故可以將這5 個指標(biāo)作為區(qū)分野豌豆屬不同種的依據(jù)。野豌豆屬植物各形態(tài)性狀間也會互相影響和隨之變化。葉片形態(tài)相關(guān)性分析中，小葉柔毛密度與托葉大小和有無鋸齒呈顯著正相關(guān)，與尚宏芹[23]對辣椒形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果不同，這可能是由于植物不同所致；莖柔毛密度與小葉柔毛密度呈極顯著正相關(guān)，這與常媛飛等[12]的研究結(jié)果一致。

野豌豆屬植物葉片宏觀和微觀形態(tài)的聚類分析結(jié)果顯示：第1 分支由光葉紫花苕和蘭花苕子(也稱廣布野豌豆)組成，與毛葉苕子(也稱長柔毛野豌豆)聚為一類，說明這3 種植物間的遺傳關(guān)系較近。夏振岱[24]將長柔毛野豌豆和廣布野豌豆劃分在細(xì)葉野豌豆組中；劉博文等[25]對43 份野豌豆屬種子的形態(tài)聚類分析也將長柔毛野豌豆與廣布野豌豆聚為一類；賀蓉等[26]應(yīng)用聚類分析方法對華北地區(qū)野豌豆屬進行研究，發(fā)現(xiàn)長柔毛野豌豆與廣布野豌豆親緣關(guān)系較近，這些研究結(jié)果均與本研究結(jié)果相似。在夏振岱[24]的分類系統(tǒng)中，四籽野豌豆和多葉野豌豆屬于四籽野豌豆組，但本研究中四籽野豌豆單獨聚為一支，有可能是植株受到了環(huán)境的影響產(chǎn)生了變異，導(dǎo)致該現(xiàn)象的原因還有待進一步深入研究。

4 結(jié)論

9 份野豌豆屬牧草的葉片形態(tài)表現(xiàn)出豐富的差異性，其中莖柔毛密度、小葉柔毛密度、托葉大小、氣孔指數(shù)和氣孔密度5 個指標(biāo)可以為野豌豆屬植物的分類鑒定提供依據(jù)。