姬靖捷,陳健鑫,魏玉倩,劉樂荷,伍建榕,2*,馬曉慶,朱繼芬

(1.西南林業(yè)大學(xué) 國家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650224;2.西南林業(yè)大學(xué) 云南省高校森林災(zāi)害預(yù)警控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650224;3.云南省昆明市嵩明縣林業(yè)與草原局,云南 嵩明 651700)

0 引言

【研究意義】核桃(Juglansregia)又稱胡桃,種仁含油量高,為木本油料之王,營養(yǎng)豐富。中國核桃品種多樣,資源豐富,是當(dāng)今世界第一大核桃生產(chǎn)國[1]。當(dāng)前,核桃種植業(yè)在滇中地區(qū)已具相當(dāng)規(guī)模,昆明祿勸、玉溪及楚雄等地核桃產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)日漸壯大。核桃枝枯病在我國各大核桃產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生,嚴(yán)重時落果率達(dá)60%以上,甚至絕收,造成核桃大面積減產(chǎn),給果農(nóng)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。因此,開展核桃枝枯病病原鑒定并提出相應(yīng)防治措施對保障核桃產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有十分重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】核桃枝枯病主要危害核桃枝干,隨著核桃大量純林種植,該病呈大面積發(fā)生趨勢。LI等[3]對河南、北京和四川的核桃枝干病害進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)和假可可毛色二孢(Lasiodiplodiapseudotheobromae)是引起當(dāng)?shù)睾颂抑Ω刹『Φ牟≡?且核桃是假可可毛色二孢的新紀(jì)錄寄主。尹萬瑞[4]對四川核桃主產(chǎn)區(qū)核桃枝枯病病原進(jìn)行探究發(fā)現(xiàn),其病原菌為新殼梭孢(Neofusicoccumparvum),并在此基礎(chǔ)上篩選出70%甲基托布津、50%多菌靈和75%百菌清對核桃枝枯病菌有明顯的抑制作用,其中,以甲基托布津的EC50最小,為4.521 4 μg/mL,表明藥劑抑制最好;其次為多菌靈和百菌清,其EC50分別為4.624 0 μg/mL和7.193 0 μg/mL。KARACA等[5]對土耳其核桃枝枯病研究發(fā)現(xiàn),茶褐斑擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsisguepinii)是引起該地核桃枝枯病的病原。TROUILLAS等[6]在2009—2010年對加利福尼亞的核桃枝干枯梢病病原菌進(jìn)行研究,首次報道引起該地區(qū)核桃枝干枯梢病的病原菌為Neofusicoccummediterraneum。【研究切入點(diǎn)】從已有的報道看出,各地引起核桃枝枯病的病原存在差異,關(guān)于滇中核桃產(chǎn)區(qū)引起核桃枝枯病病原菌的研究鮮見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用組織分離、柯赫氏試驗(yàn)與形態(tài)學(xué)鑒定、分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合的方法,對采自滇中核桃產(chǎn)區(qū)的核桃枝枯病標(biāo)本進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)和鑒定,并通過菌餅刺傷接種活體枝條的方法研究滇中地區(qū)7個核桃主栽品種(漾濞核桃、三臺核桃及云新高原等)對致病菌株的抗性,以探明滇中地區(qū)核桃枝枯病的病原菌種類,為抗性主栽核桃品種選育及核桃枝枯病防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病樣 2015年,對滇中地區(qū)嵩明縣牛欄江鎮(zhèn)滇中玉麒麟核桃種植園、保山市昌寧縣、楚雄州的大姚縣和漾濞彝族自治縣各大核桃產(chǎn)區(qū)進(jìn)行核桃枝枯病病害調(diào)查,采集受害枝條進(jìn)行拍照和癥狀描述,帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 核桃枝條 7個云南核桃主栽品種漾濞核桃、漾江1號、云新云林、云新高原、三臺核桃、昌寧細(xì)香核桃及新疆核桃的2年生健康植株嫩枝,長15 cm。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離培養(yǎng) 采用常規(guī)PDA培養(yǎng)基和組織分離法進(jìn)行病原菌的分離和純化,對純化后的菌株進(jìn)行形態(tài)觀察及分子鑒定[7]。

1.2.2 致病性測定 采集健康的核桃枝條,無菌水培養(yǎng),針刺枝條皮部造成傷口,將菌餅接種在針刺部位,以無菌培養(yǎng)基菌餅接種在傷口作為對照(CK),連續(xù)觀察7 d,記錄枝條的發(fā)病狀況。

1.2.3 病原菌鑒定

1) 形態(tài)學(xué)鑒定。對病癥明顯的受害枝條徒手切片,在顯微鏡下觀察病原菌在寄主組織中的形態(tài);挑取純培養(yǎng)的菌株,觀察其菌絲及孢子形態(tài),并進(jìn)行顯微拍照[7-9]。

2) 分子生物學(xué)鑒定。采用Forensic DNA Kit試劑盒提取純培養(yǎng)菌株的DNA,于-20℃保存。以真菌總DNA為模板,采用真菌通用引物對ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR總反應(yīng)體系為50 μL,其中,2×Power Taq PCR Master Mix 25 μL,ddH2O 20 μL,上下游引物各1.5 μL,DNA 2 μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s,58℃退火40 s,72℃延伸50 s,40個循環(huán);72℃下保持10 min,最后在PCR儀中4℃保存[10]。PCR產(chǎn)物委托昆明擎科生物有限公司測序,測序結(jié)果在NCBI上用BLAST搜索同源序列。下載部分同源性較高的序列和參考序列,通過MEGA 6.0利用鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 核桃主栽品種的抗病性鑒定 采用菌餅刺傷接種活體枝條方法對7個核桃主栽品種進(jìn)行抗病性測定。選擇致病性最強(qiáng)的菌株作為代表菌株,從其培養(yǎng)7 d后的菌落上打取直徑6 mm的菌餅,分別接種到7個主栽品種供試枝條被針刺的部位,1個枝條接種3個菌餅,每個處理接種3個枝條,3次重復(fù),將接種好菌餅的枝條放到培養(yǎng)皿中置于培養(yǎng)箱(28℃,90% RH)中離體培養(yǎng),3 d后去掉菌餅,分別在接種后3 d、5 d和7 d觀察核桃枝條的發(fā)病情況并測量病斑直徑。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2010和SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃枝枯病危害癥狀

大田調(diào)查發(fā)現(xiàn),核桃枝枯病主要危害枝條,尤其以1～2年生嫩枝受害重,也可危害葉片和果實(shí)。枝條,發(fā)病初期病原菌先從頂梢嫩枝侵入,病枝皮層褪綠,然后呈淺紅褐色,病部稍凹陷;后期病害向下蔓延至枝條和主干,受害處病斑發(fā)黑,擴(kuò)散至繞枝條一周,且在病部表皮下產(chǎn)生許多突起的小粒點(diǎn),即為病原菌的分生孢子器(圖1)。葉片受害時在葉面形成黑褐色病斑,果實(shí)受害時則在青皮表面出現(xiàn)黑色斑塊,后病斑逐漸擴(kuò)大、下陷,致果實(shí)壞死早落。

注:A,自然條件下發(fā)病癥狀;B,人工接種發(fā)病初期;C,人工接種發(fā)病后期。Note:A,disease symptom of walnut branch rot under natural condition;B,early disease stage of walnut branch rot under artificial inoculation condition;C,later disease stage of walnut branch rot under artificial inoculation condition.圖 1 核桃枝枯病危害癥狀Fig.1 Hazard symptoms of walnut branch rot

2.2 病原菌鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué) 通過組織分離和純化培養(yǎng),從病部純化分離得到菌株DZHT113。形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),從受害枝條病癥明顯部位的徒手切片上可見分生孢子器呈圓球形,具孔口,器外壁光滑或有菌絲附著,分生孢子球形和線形(圖2)。該病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后,菌落呈近圓形,輪紋狀且輪紋處略有隆起,菌絲白色,棉絮狀。后期菌落變?yōu)樯詈稚?背面黑褐色。菌落平均直徑為5.6～6.1 cm;分生孢子橄欖球形,無隔,多數(shù)具2個油球,大小為(4.8～6.7)μm×(2.3～2.9)μm;NaOH顏色反應(yīng)呈黃綠色(圖3)。根據(jù)以上形態(tài)特征,初步確定該病原菌為菜豆擬莖點(diǎn)霉(Phomopsisphaseoli)。

注:A,分生孢子器;B,分生孢子器和分生孢子;C,分生孢子。Note:A,pycnidium;B,pycnidium and conidium;C,conidium.圖2 染病部位病原菌徒手切片 Fig.2 Transverse section of pathogenic fungus on the infected part

注:A,菌落;B,分生孢子兩型孢子;C,分生孢子。Note:A,colony;B,dimnorphic conidium;C,conidium.圖3 菌株DZHT113的形態(tài)特征Fig.3 Morphological characteristics of strain DZHT113

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 從圖4看出,對菌株DZHT113的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其ITS基因片段長度為750 bp。利用NCBI的BLAST進(jìn)行同源序列比對,結(jié)果表明,核桃枝枯病病原菌的ITS序列與Phomopsissp.(GenBank登錄號:KY797680)的同源性最高,達(dá)100%。在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上,菌株DZHT113與MW968601.、MT043770聚為一支,結(jié)合形態(tài)學(xué)特征,確定該病原菌為菜豆擬莖點(diǎn)霉(Phomopsisphaseoli)。

圖4 菌株DZHT113擴(kuò)增的ITS基因片段(A)及其系統(tǒng)發(fā)育樹(B)Fig.4 ITS gene (A) and phylogenetic tree (B) after the amplification of strain DZHT113

2.3 病原真菌的致病性

將分離所得目的菌株DZHT113的菌餅接種在核桃枝條被針刺的部位,培養(yǎng)7 d后,發(fā)病癥狀與田間自然條件下較一致,感病初期,幼嫩枝條出現(xiàn)紅褐色或紫褐色病斑,后顏色逐漸變深,隨著皮部枯死,病部密生顆粒狀突起物,為病原菌的子座及分生孢子器。但人工接種的核桃嫩枝病部顏色較深,可見黑色顆粒狀物(圖5),空白對照的枝干未表現(xiàn)癥狀。將人工接種的核桃嫩枝病部再分離,得到的病菌與原病菌進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn),二者形態(tài)特征相同。根據(jù)柯赫式法則,確定菌株DZHT113為引起核桃枝枯病的病原菌。

注:A,人工接種發(fā)病初期;B,人工接種未發(fā)病;C,人工接種發(fā)病后期。Note:A,early disease stage of walnut branch rot under artificial inoculation condition;B,no disease symptom of walnut branch rot under artificial inoculation condition;C,later disease stage of walnut branch rot under artificial inoculation condition.圖5 菌株DZHT113的致病性Fig.5 Pathogenicity of strain DZHT113

2.4 核桃主栽品種對菜豆擬莖點(diǎn)霉的抗病性

調(diào)查發(fā)現(xiàn),菌株DZHT113接種到健康枝條上7 d后,7個核桃主栽品種上病斑直徑為1.23～87.00 mm,漾濞核桃的病斑直徑最小,漾江1號和云新高原其次,病斑直徑分別為2.21 mm和2.34 mm,三者與云新云林均顯著小于三臺核桃、昌寧細(xì)香核桃及新疆核桃的病斑直徑;昌寧細(xì)香核桃病斑直徑最大,顯著高于除新疆核桃外的其余品種。表明,漾濞核桃、漾江1號、云新云林和云新高原對菌株DZHT113相對抗病,在接種初期病斑直徑為2～5 mm,接種7 d后病斑呈黃色至棕黃色木質(zhì)化表層;病健交界處有明顯界限,病斑拓展很慢或不再拓展。三臺核桃、昌寧細(xì)香核桃及新疆核桃相對感病,在相同條件下接種3 d后的病斑直徑就達(dá)10～25 mm,接種7 d后病斑直徑達(dá)95 mm以上,病斑拓展速度較快,顏色呈褐色至棕黑色,病健交界處無明顯的界限,呈腐爛狀。

3 討論

目前,國內(nèi)外對于核桃枝枯病的研究多針對矩圓黑盤孢菌(Melanconiumoblongum) 所致的枝枯病[11],擬莖點(diǎn)霉屬(Phomopsis)真菌引起的核桃枝枯病在世界上許多國家發(fā)生,并有相關(guān)報道[12-13]。劉靜等[14]報道,山東地區(qū)核桃枝枯病由Diaporthenobilis引發(fā),其病原菌無性階段為擬莖點(diǎn)霉屬(Phomopsis);孫俊[15]研究表明,遼寧地區(qū)核桃枝枯病由胡桃楸擬莖點(diǎn)霉(Phomopsisjuglandina)引起。在云南地區(qū),P.juglandina引起的核桃枝枯病僅在昆明曾有報道[16]。筆者在滇中地區(qū)林業(yè)有害生物普查中發(fā)現(xiàn)此病害,調(diào)查發(fā)現(xiàn),核桃受害枝條發(fā)病初期病枝皮層退綠,然后呈淺紅褐色,病部稍凹陷;后期病害向下蔓延至枝條和主干,受害處病斑發(fā)黑,擴(kuò)散至繞枝條一周,且在病部表皮下產(chǎn)生許多突起的小粒點(diǎn)。形態(tài)學(xué)鑒定其分生孢子器呈圓球形,具孔口,器外壁光滑或有菌絲附著,分生孢子橄欖球形,無隔,多數(shù)具2個油球,大小為(4.8～6.7) μm×(2.3～2.9) μm。病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后,菌落呈近圓形,輪紋狀且輪紋處略有隆起,菌絲白色,棉絮狀;后期菌落變?yōu)樯詈稚?菌落背面黑褐色。結(jié)合rDNA-ITS序列分析確定滇中地區(qū)核桃枝枯病病菌為菜豆擬莖點(diǎn)霉(Phomopsisphaseoli)。

在多次重復(fù)回接過程中發(fā)現(xiàn),擬莖點(diǎn)霉對核桃嫩枝的侵染力較強(qiáng),由此認(rèn)為,病原菌極易通過傷口侵染核桃新枝,而且在溫暖潮濕的環(huán)境中病菌極易侵染和傳播。嫩枝接種后發(fā)病癥狀與成株期核桃樹枝條自然條件下發(fā)病癥狀有所差別,可能與枝條的木質(zhì)化程度、皮層厚度及生長勢等的差異有關(guān)。

4 結(jié)論

經(jīng)分離、純化培養(yǎng),從病樣中成功分離得到致病菌株DZHT113,通過形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定該病原菌為菜豆擬莖點(diǎn)霉(Phomopsisphaseoli)。不同核桃品種對菌株DZHT113的敏感性差異顯著,其中漾濞核桃、漾江1號、云新云林和云新高原表現(xiàn)相對抗病,三臺核桃、昌寧細(xì)香核桃及新疆核桃表現(xiàn)相對感病。對于相對感病的品種應(yīng)加強(qiáng)栽培管理,做好病害的預(yù)防工作,也可通過科學(xué)的種植方法將抗感品種搭配種植,以達(dá)到防治病害的目的。