肖濤，李輝，羅韋，葉濤，余歡，陳友波，石鈺仕，趙德鵬，吳蕓

基于轉錄組測序篩選雞蛋綠殼性狀相關基因

1高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室/貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室/貴州大學動物科學學院，貴陽 550025；2遵義師范學院生物與農(nóng)業(yè)科技學院，貴州遵義 563006；3安順市畜牧技術推廣站，貴州安順 561000

【背景】綠殼蛋深受消費者喜愛，蛋殼綠色的深淺在市場上是影響綠殼蛋定價銷售的重要參考指標。綠殼蛋的形成受多基因共同調(diào)控，蛋殼綠色深淺不一，其分子機理尚不清楚。通過對赤水烏骨雞蛋殼腺組織進行轉錄組測序，挖掘其調(diào)控綠殼蛋蛋殼顏色深淺的候選基因以及關鍵信號通路，探究影響蛋殼顏色遺傳性，以期發(fā)展綠殼蛋的選種選育和提高經(jīng)濟效益?！灸康摹刻接懗嗨疄豕请u的遺傳基礎，并通過SLCO1B3基因分型對其進行鑒定和篩選，以期通過分子標記在青殼雞育種規(guī)劃中提供新的見解，并在后期的選擇策略中幫助控制和提高赤水烏骨雞蛋殼品質(zhì)的同質(zhì)性?！痉椒ā恳约兿档?280 日齡赤水烏骨雞為研究對象，屠宰產(chǎn)淺綠色蛋（QL）和深綠色蛋（SL）的母雞各3只，采集蛋殼腺以RNA-seq技術檢測分析，篩選與蛋殼顏色密切相關的差異表達基因（differentially expressed genes, DEGs），并對這些 DEGs進行 GO 和 KEGG 富集分析。利用qRT-PCR技術檢測與蛋殼顏色相關的 6 個候選基因的轉錄水平變化以驗證轉錄組數(shù)據(jù)可靠性?！窘Y果】在深綠組與淺綠組中共篩選到93個顯著DEGs，有 59 個基因在深綠組中顯著上調(diào)，34個顯著下調(diào)。DEGs注釋到 GO 數(shù)據(jù)庫進行比對，主要顯著性富集的是鈉離子轉運、負離子結合、肌質(zhì)網(wǎng)膜等。KEGG 分析富集程度最顯著的是醛固酮調(diào)節(jié)鈉的重吸收，以及富集的礦物質(zhì)吸收、亞油酸的新陳代謝等信號通路。通過qRT-PCR驗證，結果顯示這些基因的表達趨勢與轉錄組的測序結果一致?！窘Y論】經(jīng)功能分析，TF 基因、SCNN1 家族基因、CYP450 家族基因、SLC 家族基因和FAM 家族基因，以及醛固酮調(diào)節(jié)鈉的重吸收信號通路參與蛋殼色素合成、轉運和沉積。上述基因和信號通路可能是影響赤水烏骨雞蛋殼綠色深淺不一的候選基因和關鍵信號通路。

轉錄組測序；赤水烏骨雞；綠殼蛋；蛋殼顏色；qRT-PCR

0 引言

【研究意義】即使是已通過主效基因選純的同一群體母雞，蛋殼顏色之間也存在深淺不一的差異。市場上顏色較深型綠殼蛋價格高于顏色較淺型，消費者也更傾向于蛋殼顏色更綠更均勻的綠殼蛋。因綠殼蛋的顏色深淺直接影響了其市場價格，所以生產(chǎn)者和經(jīng)營者都亟待提高綠殼蛋蛋殼顏色深綠的均一性，以期發(fā)展綠殼蛋的選種選育和提高經(jīng)濟效益。因此，探究綠殼蛋顏色深淺不一的分子機制探究對品種分子選育發(fā)展具有重要作用，也具有巨大市場潛力。本研究旨在研究赤水烏骨雞的遺傳基礎，通過分型鑒定后再篩選，以便在綠殼蛋雞的育種規(guī)劃中通過分子標記提供新的見解，在后期的選種策略上，助力于把控和提高赤水烏骨雞蛋殼品質(zhì)均一性?！厩叭搜芯窟M展】原卟啉、膽綠素和膽綠素的鋅螯合物這3種色素在蛋殼沉積中比例不同形成不同顏色，原卟啉主要影響形成黃色、粉紅色和褐色，而膽綠素及其鋅螯合物主要形成藍色和綠色[1-3]。蛋殼顏色的形成是受多基因調(diào)控的，血紅素加氧酶（heme oxygenase，HO）、血紅素加氧酶基因（）和膽綠素還原酶A（Biliverdin Reductase A，）等基因均在蛋殼顏色形成中起到重要調(diào)控或運轉作用[4-6]。研究表明，綠殼蛋形成的分子機制主要是因內(nèi)源性逆轉錄病毒EAV-HP元件以反向插入到溶質(zhì)載體有機陰離子轉運蛋白家族成員的5′-非編碼區(qū)，啟動在蛋殼腺中特異性高表達，導致膽綠素沉積到蛋殼表面形成綠殼蛋[7]?！颈狙芯壳腥朦c】雞蛋綠殼性狀的主效基因雖已明確[8]，但通過其基因選純的母雞所產(chǎn)蛋殼綠色依舊深淺不一，其分子機理尚不清楚，相關研究較少。赤水烏骨雞又名竹鄉(xiāng)雞，是肉蛋兼用型優(yōu)良雞種，因主產(chǎn)于貴州省赤水市而得名。產(chǎn)綠殼蛋是赤水烏骨雞重要的品種特征，其所產(chǎn)蛋蛋殼顏色類型有白殼型、淺綠色殼型和深綠色殼型3種。目前關于赤水烏骨雞色素形成的分子研究已有報道[9]，但關于赤水烏骨雞綠殼蛋顏色深淺不一的分子調(diào)節(jié)機制研究鮮有報道?！緮M解決的關鍵問題】蛋殼腺是蛋殼形成器官，也是膽綠素沉積重要部位[10]，因此本研究以赤水烏骨雞為研究對象，采用RNA-seq技術對產(chǎn)深綠色蛋和淺綠色蛋母雞的蛋殼腺組織進行RNA-seq分析，篩選調(diào)控影響蛋殼顏色深淺的候選基因，通過功能分析挖掘影響綠殼蛋顏色的關鍵通路，為闡明赤水烏骨雞綠殼蛋顏色深淺不一的形成提供理論依據(jù)，也為雞、鴨甚至鳥類蛋殼顏色形成的分子機理研究提供參考。

1 材料與方法

試驗于2020年12月至2021年11月在貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室完成。

1.1 試驗動物選取

試驗于貴州省赤水市貴州竹鄉(xiāng)雞養(yǎng)殖有限公司采集300只230日齡品種特征明顯、發(fā)育正常、健康無病的赤水烏骨雞母雞，每只雞均采用翅下采血。通過血液基因組DNA試劑盒（北京天根，DP304）提取血樣中的DNA。利用上下游共 3 條引物對目標片段進行擴增（F: GGCAGAGGGTTGATCCAAA GTA，R1: GTGAGCAAGTCCCACCTATTCG，R2: ATAGAGAC AAAACCACAAAGGTAATG），產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，產(chǎn)物片段大小與目的片段大小一致，長度為884 bp或732 bp，分別為綠殼純合（SL/SL），綠殼雜合（SL/W），非綠殼純合（W/W）以此鑒定綠殼純系赤水烏骨雞[11]。根據(jù)鑒定結果選取120只綠殼純系母雞作為試驗動物。

圖1 SLCO1B3鑒定圖

1.2 雞蛋和樣品采集

所有試驗雞均采用單籠飼養(yǎng)，日常商品蛋雞飼糧飼喂。連續(xù)14 d采用NR 型蛋殼顏色色差計（南京銘奧儀器設備有限公司）測定120只純系綠殼母雞所產(chǎn)蛋的蛋殼顏色，最后選取6只（深綠色和淺綠色各3只）產(chǎn)蛋規(guī)律且顏色統(tǒng)一的280日齡赤水烏骨雞母雞，進行蛋殼腺采集，由貴州竹鄉(xiāng)雞養(yǎng)殖有限公司提供。在雞產(chǎn)蛋前2.5—3.0 h對其進行電擊、放血、解剖。屠宰后，分別采集深綠組（SL）、淺綠組（QL）蛋殼腺組織，將樣品收集在無rnase-free管內(nèi)，立即用液氮冷凍，置于-80℃保存，用于RNA提取。

1.3 提取總RNA

蛋殼腺組織中總RNA用TRIzol法提取（Invitrogen，Carsbad，CA）[12]，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測組織總RNA完整性（RNA integrity, RIN），RIN ≥8?？俁NA的濃度和質(zhì)量使用Nanodrop（2000，USA）、Agilent Bioanalyzer（G2938A，美國，安捷倫）進行檢測，保證樣品濃度≥400 ng·μL-1。

1.4 cDNA測序文庫構建、質(zhì)檢及測序

DNase I（Illumina，USA）消化樣品總RNA后，使用oligo（dT）磁珠從1μg總RNA中純化mRNA，然后在ABclonal First Strand Synthesis Reaction Buffer中進行mRNA片段化。隨后，以片段化mRNA作為模板，用隨機引物和逆轉錄酶（RNase H）合成cDNA第一鏈，再用dNTPs、RNAseH、DNA聚合酶I和緩沖液合成cDNA第二鏈，并連接接頭序列，進行PCR擴增。純化PCR產(chǎn)物，并使用Agilent Bioanalyzer4150評估文庫質(zhì)量。構建好的文庫在Illumina Novaseq6000/MGISEQ-T7測序平臺上進行測序。測序委托上海中科新生命生物科技有限公司（上海，中國）完成。

1.5 高通量測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

通過測序質(zhì)量值Phred Quality Score（Q-phred）和堿基識別出錯的概率（Probability of Incorrect Base Call）之間的換算，以測序循環(huán)為單位，對單個樣品所有Reads平行測序的堿基質(zhì)量值進行檢測，可以查看單個樣品整體的測序質(zhì)量。FASTQC軟件用于原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制，去除測序接頭序列，過濾掉低質(zhì)量和N（N表示無法確定堿基信息）比例大于5%的reads后，獲得clean reads，后續(xù)分析均基于clean reads。

1.6 差異表達基因的篩選與功能注釋

根據(jù)基因的長度計算每個基因的FPKM值（FPKM表示每百萬比對片段中比對到轉錄本每千個堿基的數(shù)量）。使用DESeq2軟件進行組間基因的差異表達分析，DEGs的默認篩選閾值為|log2FoldChange|＞1且＜0.05。

1.7 DEGs的GO、KEGG富集分析

分析時利用GO term注釋的差異基因?qū)γ總€term的基因列表和基因數(shù)目進行計算，當＜0.05時，該GO term顯著富集。將所有DEGs注釋到KEGG（http://www.kegg.jp/）數(shù)據(jù)庫中，當＜0.05時，該KEGG Pathway顯著富集。

1.8 DEGs的mRNA表達水平驗證RNA-Seq結果

為驗證RNA-seq結果的準確性和可靠性，選擇表達水平差異較大且與蛋殼顏色深淺相關的DEGs，進行qRT-PCR驗證，基因及引物信息見表 1。利用primer 5.0設計特異性引物，采用ABI公司SYBR Green Mix進行定量表達檢測，反應體系：2×Taq PCR Master Mix 5 μL，cDNA模板0.5 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddH2O補足至10 μL，每個樣本設置3個重復。采用PCR程序：UDG酶激活50℃ 2 min；95℃ 2 min；95℃ 15 s；60℃ 15 s，共40個循環(huán)，然后 95℃ 15 s；60℃ 60 s；95℃ 15 s用于記錄熔解曲線。為內(nèi)參基因。采用2-△△Ct法（比較Ct值法）計算DEGs相對表達量。

表1 差異表達基因qRT-PCR的特異性引物

2 結果

2.1 蛋殼顏色統(tǒng)計分析

連續(xù)14 d用NR 型蛋殼顏色色差計（南京銘奧儀器設備有限公司，中國）測定蛋殼顏色（ESC），蛋殼顏色值用△L*（偏白）和△a*（偏綠）表示，挑選蛋殼顏色差異極顯著且產(chǎn)蛋時間規(guī)律母雞作為屠宰對象。如表2所示，蛋殼顏色△L*值在深綠組與淺綠組中差異不顯著，而△a*值深綠組極顯著小于淺綠組，表示深綠比淺綠顏色更綠。

2.2 樣品RNA質(zhì)檢

總RNA的OD260/OD280在1.98—2.02之間，質(zhì)量較好，RIN值均大于8.5，說明RNA完整性較好，可以用于轉錄組測序文庫的構建（表3）。

2.3 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制及參考基因組比對分析

在Illumina Novaseq 6000 / MGISEQ-T7測序平臺對淺綠色組和深綠色組母雞蛋殼腺組織mRNA進行測序分析，Q20在97.20%—97.26%之間，Q30在92.37%—92.83%之間，如表4所示。對原始數(shù)據(jù)質(zhì)量控制后，樣本clean reads介于47 722 420—57 099 094之間。clean reads比對到雞的參考基因組上，樣本的Total mapped 都在91%以上，如表5所示。各項數(shù)據(jù)顯示測序質(zhì)量較好，可進行下一步生物信息學分析。

2.4 DEGs篩選和驗證

使用FPKM計算基因表達量，以| log2FC |＞1且＜0.05為篩選標準，在兩組之間獲得93個顯著DEGs，其中，相對于QL組，59個DEGs在深綠組中顯著上調(diào)，34個DEGs顯著下調(diào)（圖2）。與淺綠組相比，SLCO1B3基因在深綠組蛋殼腺組織中的表達量高于淺綠組，但并未達到顯著差異（＞0.05）。

結合形成綠殼蛋的血紅素、膽綠素等重要成分檢索分析發(fā)現(xiàn)，、SCNN1家族基因、CYP450家族基因、SLC家族基因和FAM家族基因可能與蛋殼色素的合成和沉積相關，可能是影響蛋殼顏色深淺差異的候選基因。

為驗證RNA-seq測序結果的準確性，選取上調(diào)基因和，下調(diào)基因、這6個顯著DEGs進行驗證，采用qRT-PCR方法檢測這些DEGs在兩組之間的表達趨勢（圖3），結果顯示與RNA-seq檢測結果相符。驗證了RNA-Seq結果和基因表達數(shù)據(jù)的真實性和可重復性。

表2 蛋殼顏色統(tǒng)計分析表

同列大寫字母不同表示差異極顯著（＜0.01），無字母表示差異不顯著（＞0.05）。△L*值代表亮度，其值越大，越偏向白色，反之偏向黑色；△a*值代表綠色程度，其值越小代表越綠，其蛋殼綠色與△L*和△a*的值呈現(xiàn)反比關系，即蛋殼綠色越深△L*與△a*的值越小

Different capital letters in the same column indicate extremely significant difference (＜0.01), while no letters indicate insignificant difference (＞0.05). △L* represents brightness. The larger the value is, the more it tends to white, and vice versa.△a* value represents the degree of green, and the smaller the value is, the greener the eggshell is. The eggshell green is inversely proportional to △L* and △a*, that is, the darker the eggshell green is, the smaller △L* and △a* are

表3 蛋殼腺RNA樣品的質(zhì)量檢測

表4 樣本序列質(zhì)量和比對信息統(tǒng)計

橫坐標表示基因在不同實驗組中表達倍數(shù)變化，縱坐標表示基因表達量變化的統(tǒng)計學顯著程度。左側藍色代表顯著下調(diào)基因，右側紅色代表顯著上調(diào)基因，灰色表示無顯著性差異的基因

2.5 DEGs功能富集分析

對93個DEGs 進行 GO 功能富集分析，共顯著富集到193個條目，其中生物過程（biological process, BP）132個，細胞組成（cellular component，CC）24個，分子功能（molecular function，MF）37個，前30條顯著富集到的 GO 條目如圖4所示。生物學過程中主要顯著性富集的是鈉離子轉運和單價無機陽離子轉運等，在分子功能類別中主要富集是負離子結合和離子結合等，而對于細胞組成方面，主要富集的是肌質(zhì)網(wǎng)膜和質(zhì)膜區(qū)域等。通過KEGG富集分析到69條富集通路，前20條KEGG通路條目如圖5所示，富集程度最顯著的是醛固酮調(diào)節(jié)鈉的重吸收，其富集信號通路上的主要DEGs是和，礦物質(zhì)吸收通路信號上富集的主要 DEGs是，亞油酸的新陳代謝通路信號上富集的主要 DEG 是。可見，在GO和KEGG 富集通路中主要是離子運轉及礦物的吸收。

橫坐標表示基因名稱，縱坐標表示基因表達倍數(shù)變化

表5 Reads與參考基因組比對情況統(tǒng)計表

橫坐標為-log10 處理后的P值，條目按P值從小到大升序排列。BP表示生物學過程，MF表示分子功能，CC表示細胞組分，縱坐標為具體功能描述

橫坐標表示通路對應的富集因子，縱坐標表示通路名稱。對數(shù)函數(shù)計算的 P值大小用點的顏色表示，越小越接近紅色，通路中包含的差異基因數(shù)量用散點大小表示

2.6 候選基因與蛋殼顏色相關分析

根據(jù)基因組織表達量與蛋殼顏色△a*值進行相關分析后發(fā)現(xiàn)，和與△a*差異不顯著（＞0.05）；與△a*呈極顯著正相關（＜0.01），和與△a*呈顯著正相關（＜0.05）；和與△a*呈顯著負相關（＜0.05），和與△a*呈極顯著負相關（＜0.01，表6）。

3 討論

近年來，RNA-seq技術被廣泛運用于生命科學領域[13]，這為有效挖掘雞蛋蛋殼顏色性狀相關差異表達基因和通路提供了新方向。本研究利用RNA-seq技術，篩選影響蛋殼顏色變化的差候選基因，并對DEGs 進行GO和KEGG功能富集分析，再結合膽綠素合成轉運過程，篩選到和等候選基因在深綠組中基因顯著下調(diào)，、和等候選基因在深綠組中顯著上調(diào)。通過功能富集，結果暗示離子的結合轉運以及礦物質(zhì)的吸收信號通路存在調(diào)控蛋殼顏色深淺程度的可能，且DEGs的qRT-PCR驗證結果與RNA-seq檢測測序結果相一致，這進一步證明了RNA-Seq分析結果和基因表達數(shù)據(jù)的真實性和可重復性。本研究選擇的雖是顯性純合的個體，但在深綠組表達量高于淺綠組，說明存在其他基因影響的表達，從而導致蛋殼顏色的深淺差異（表7）。將候選基因與蛋殼顏色進行相關分析，其中7個基因與蛋殼顏色具有顯著差異性，表明本試驗條件符合試驗目標，試驗結果的可靠性較高。

表6 候選DEGs與蛋殼顏色相關分析表

肩標**表示極顯著相關，*表示顯著相關

Shoulder mark ** means extremely significant correlation（＜0.01）, * means significant correlation（＜0.05）

表7 SLCO1B3表達

3.1 醛固酮調(diào)節(jié)Na+的重吸收影響蛋殼鈣化

本研究中，KEGG富集結果顯示和顯著富集在醛固酮調(diào)節(jié)鈉的重吸收信號通路上。鈉離子無電位門控通道1（）基因家族是上皮細胞鈉離子通道（epithelial sodium channel，ENaC）的編碼基因，而醛固酮和血管加壓素可調(diào)節(jié)ENaC，調(diào)控Na+的重吸收速率，對于調(diào)節(jié)血壓水平和維持Na+平衡具有重要作用[14-15]。研究表明，在蛋殼形成過程中，蛋殼色素的沉積與整個蛋殼的鈣化過程同步進行[16]。和在子宮中高度表達，尤其在蛋殼形成階段表達迅速增加，會使子宮上皮細胞Na+濃度增高，而在家禽子宮中鈉的濃度可以直接影響鈣離子的運輸和轉移[17]，從而影響蛋殼表面的鈣化[18]。本研究中和在蛋殼腺高表達，且在深綠組中表達量顯著高于淺綠組，可能是蛋殼色素的沉積與蛋殼表面的鈣化過程有關，使得蛋殼顏色產(chǎn)生差異。

3.2 SLC調(diào)節(jié)離子運轉

雞是鐵結合蛋白家族的一員，其基因主要編碼卵轉鐵蛋白，參與鐵離子的轉運和平衡[19-20]。血紅蛋白分解產(chǎn)生的血紅素被氧化、失去鐵，使卟啉環(huán)打開而形成膽綠素[21]可能影響了膽綠素的形成過程，進而影響膽綠素在蛋殼腺上皮細胞中積累以及在蛋殼中的沉積[22-23]。本研究中篩選到在深綠組中下調(diào)，而和顯著上調(diào)，此3個基因均屬于溶質(zhì)轉運載體（SLC）家族基因。SLC34家族和SLC20家族相互作用于磷酸鹽轉運[24]，同時在細胞膜上對轉運Na+、Ca2+、Fe3+等離子發(fā)揮重要作用[25]，其中對生物體鈣化具有調(diào)控作用[26]，并與富集在礦物質(zhì)吸收的信號通路上，而在調(diào)控細胞凋亡和黏附等方面具有調(diào)控作用[27]。研究表明離子轉運在蛋殼形成過程中起著關鍵作用[18]，在本研究中可能是在紅細胞衰老裂解產(chǎn)生蛋殼色素的過程中，通過SLC家族基因的運輸作用來調(diào)節(jié)蛋殼的鈣化過程，從而影響膽綠素的沉積。這與綠殼鴨蛋研究中推測家族部分基因通過小分子運輸影響蛋殼顏色差異結果相似[28]。

3.3 細胞色素P450的氧化作用

本研究發(fā)現(xiàn)細胞色素P450家族的和在淺綠組中顯著上調(diào)，而富集在亞油酸新陳代謝信號通路上。細胞色素P450 是由多個功能相關的亞鐵血紅素-硫醇鹽蛋白基因組成的超家族蛋白酶[29]，也是一種在溫和條件下就能將許多惰性化合物氧化的單加氧酶，直接影響血紅素與Fe的配位[30-31]。MIHALJEVI?等[32]研究中細胞色素P450代謝相關基因的表達可能會導致下游的α-亞麻酸代謝和花生四烯酸代謝通路的改變，張金銘[33]研究表明α-亞麻酸代謝和花生四烯酸代謝通路可反饋調(diào)控細胞色素的產(chǎn)生。推測P450家族的和可能通過氧化反應在綠殼蛋膽綠素形成過程中發(fā)揮了作用。

3.4 FAM在線粒體內(nèi)特異性表達

HESHAM[34]研究發(fā)現(xiàn)，受轉錄因子GATA-l的調(diào)控，使得其在線粒體內(nèi)特異表達，這為其參與血紅素生物合成提供了可能，并表示它是東鄉(xiāng)綠殼蛋綠殼性狀的重要候選基因。在本研究中，與淺綠組相比，在深綠組中顯著下調(diào)，推測家族基因也是影響赤水烏骨雞淺綠色綠殼蛋形成的候選基因，其可能是通過調(diào)控線粒體鐵離子轉運來參與血紅素的生物合成影響綠殼蛋色素的沉積[35-36]，但具體的調(diào)控機制仍需進一步深入研究。

4 結論

本研究通過RNA-seq技術分析了產(chǎn)深綠色蛋和淺綠色蛋的母雞蛋殼腺組織表達基因的種類和數(shù)量，篩選出調(diào)控蛋殼顏色形成的相關候選基因和通路，發(fā)現(xiàn)、SCNN1家族基因、CYP450家族基因、SLC家族基因和FAM家族基因，以及醛固酮調(diào)節(jié)鈉離子的重吸收和礦物質(zhì)吸收的信號通路在綠殼蛋的形成機制中影響著蛋殼色素合成、轉運和沉積。該候選基因和信號通路為揭示赤水烏骨雞不同綠色程度蛋殼形成的調(diào)控機制提供了理論參考，為進一步篩選奠定基礎，以期提高綠殼蛋的均一性。

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Screening of Candidate Genes for Green Shell Egg Shell Color Traits in Chishui Black Bone Chicken Based on Transcriptome Sequencing

1Key Laboratory of Animal Genetics, Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region, Ministry of Education/ Guizhou Provincial Key Laboratory of Animal Genetics, Breeding and Reproduction/College of Animal Science, Guizhou University, Guiyang 550025;2College of Biology and Agriculture Technology, Zunyi Normal University, Zunyi 563006, Guizhou;3AnshunCity Animal Husbandary Technology Extension Station, Anshun 561000, Guizhou

【Background】Green shell eggs are loved by consumers, and the green color of eggshell is an important reference index affecting the pricing and sales of green shell eggs in the market. The formation of green shell eggs is regulated by multiple genes, and the color of green shell varies. However, the molecular mechanism of green shell eggs is still unclear. In this study, transcriptomic sequencing was conducted on the eggshell gland tissue of Chishui black bone chicken, and the candidate genes and key signal pathways that regulated the depth and depth of eggshell color of green shell eggs were excavated, so as to explore the heritability of eggshell color, and to develop the seed selection and breeding of green shell eggs and improve economic benefits. 【Objective】The aim of this study was to investigate the genetic basis of Chishui black bone chicken and to identify and then screen them bygenotyping, in order to provide new insights through molecular markers in the breeding planning of green-shelled hens, and to help control and improve the homogeneity of eggshell quality of Chishui black bone chicken in the later selection strategy. 【Method】A pure 280-day-old Chishui black bone chicken was used as the research object. Three hens were slaughtered to produce light green eggs (QL) and dark green eggs (SL), and the eggshell glands were collected and analyzed by RNA-SEQ technology. Selected differentially expressed genes (DEGs) closely related to eggshell color, and analyzed for GO and KEGG enrichment. Qrt-pcr was used to detect the transcriptional level changes of six candidate genes related to eggshell color to verify the reliability of transcriptomic data. 【Result】A total of 93 DEGs were screened in SL group and QL group, among which 59 genes were up-regulated and 34 genes were down-regulated in SL group. DEGs was annotated to GO database for comparison, and sodium ion transport, negative ion binding, and sarcoplasmic reticulum were mainly enriched significantly. KEGG analysis showed that aldosterone regulated sodium reabsorption, enriched mineral absorption, linoleic acid metabolism and other signal pathways. The results of QRT-PCR showed that the expression trend of these genes was consistent with the transcriptome sequencing results. 【Conclusion】By functional analysis,gene,gene,0 gene,gene andgene, as well as the sodium reabsorption signaling pathway regulated by aldosterone, might be involved in eggshell pigment synthesis, transport and deposition. These genes and signal pathways might be candidate genes and key signal pathways affecting the different shades of green in eggshell of Chishui black bone chicken.

transcriptome sequencing; Chishui black bone chicken; green egg; eggshell color; qRT-PCR

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.08.014

2021-12-13；

2022-11-16

貴州省地方家禽產(chǎn)業(yè)聯(lián)合攻關項目（黔財農(nóng)[2020]175號）、貴州省科技支撐計劃（黔科合支撐[2019]2285號）、赤水河流域資源保護與開發(fā)研究院項目（CSH-[2019]-005）

肖濤，E-mail：798061734@qq.com。通信作者李輝，E-mail：ellenlihui@sina.cn

（責任編輯 林鑒非）