曹 莉,袁 雪,張飛娥,錢金梅,張小玲,蔡 巖

0 引言

翼狀胬肉是一種常見的眼表疾病,世界范圍內(nèi)發(fā)病率為1.3%～53%[1]。手術(shù)是治療翼狀胬肉的主要方式,但翼狀胬肉術(shù)后復(fù)發(fā)率高。有研究表明翼狀胬肉的發(fā)生發(fā)展與翼狀胬肉細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移有關(guān)[2]。臨床上通過術(shù)中使用絲裂霉素等抗代謝藥物降低翼狀胬肉的術(shù)后復(fù)發(fā)率,但這些藥物可能會引起鞏膜溶解等一系列嚴(yán)重并發(fā)癥[3]。因此,需要尋找更加安全有效的藥物來治療翼狀胬肉和降低翼狀胬肉術(shù)后復(fù)發(fā)率。姜黃素(curcumin,Cur)是從姜黃等植物的根莖中提取得到的疏水性多酚化合物,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗纖維化等作用,而無明顯毒副作用[4-7]。故本研究用姜黃素對人翼狀胬肉成纖維(human pterygium fibroblasts,HPF)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),觀察姜黃素對HPF細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響,以及對Bcl-2相關(guān)X蛋白(B-cell lymphoma-2 associated X protein,Bax)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1,CCND1)、基質(zhì)金屬蛋白酶2 (matrix metalloproteinase 2,MMP2)的mRNA與蛋白表達(dá)的影響,以期為翼狀胬肉的治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 取材收集新疆軍區(qū)總醫(yī)院全軍眼科中心在2021-11-24/12-16手術(shù)切除的翼狀胬肉組織7例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)按照診斷標(biāo)準(zhǔn)確診的位于鼻側(cè)的原發(fā)性翼狀胬肉;(2)頭部平坦,體部菲薄,無明顯充血的靜止期翼狀胬肉;(3)頭部侵入角膜2～4mm。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)復(fù)發(fā)性翼狀胬肉;(2)活動性眼部炎癥;(3)假性翼狀胬肉;(4)單眼多發(fā)的翼狀胬肉[8]。本研究遵守《赫爾辛基宣言》,通過新疆軍區(qū)總醫(yī)院倫理委員會審批(No.20210301007)。所有患者知情并簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑與儀器姜黃素(美國Sigma公司)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(美國Gibco公司)、DMEM/F12(1∶1)液體培養(yǎng)基(美國HyClone公司)、二甲基亞砜(美國Sigma公司)、CCK8試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)、Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)、動物組織總RNA提取試劑盒(成都福際生物技術(shù)有限公司)、兔抗人Vimentin抗體(ab92547, 美國Abcam公司)、兔抗人Pan Cytokeratin抗體(ab234297,美國Abcam公司)、兔抗人Bax抗體(ab182733,美國Abcam公司)、兔抗人Bcl-2抗體(ab182858,美國Abcam公司)、兔抗人Cyclin D1抗體(ab134175,美國Abcam公司)、兔抗人MMP2抗體(ab92536,美國Abcam公司)、兔抗人β-Actin抗體(bs-0061R,北京博奧森生物技術(shù)有限公司)、Alexa Fluor 488標(biāo)記驢抗兔IgG二抗(ab150073,美國Abcam公司)、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗(bs-40295G-HRP,北京博奧森生物技術(shù)有限公司)、Transwell小室(美國Corning公司)、酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)、流式細(xì)胞儀(美國BD公司)、實(shí)時熒光定量PCR儀(美國Thermo公司)、電泳儀及電轉(zhuǎn)儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1HPF細(xì)胞的體外培養(yǎng)將手術(shù)切除的翼狀胬肉頭、體、頸部組織保存于含100U/mL青霉素、100mg/L鏈霉素的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)中,在超凈工作臺上用PBS沖洗翼狀胬肉組織3次,將翼狀胬肉剪成約1mm×1mm×1mm大小的組織塊,將剪碎的組織塊平鋪于細(xì)胞培養(yǎng)皿,等待30min,待組織塊貼壁后向培養(yǎng)皿中加入含100U/mL青霉素、100mg/L鏈霉素及10%FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基,將培養(yǎng)皿放置于37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中,每2～3d換液一次,待細(xì)胞密度生長到80%～90%時采用0.25%胰蛋白酶消化傳代,取3～6代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞鑒定將HPF細(xì)胞接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞密度生長到80%后吸除培養(yǎng)基,PBS浸洗,4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15min。PBS浸洗,0.5%曲拉通X-100室溫通透細(xì)胞30min。PBS浸洗,5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)室溫封閉1h。棄封閉液,分別加入5%BSA、用5%BSA稀釋的兔抗人Vimentin抗體(1∶250)、用5%BSA稀釋的兔抗人Pan Cytokeratin抗體(1∶250),4℃孵育過夜。PBS浸洗,加入用5%BSA稀釋的Alexa Fluor 488標(biāo)記驢抗兔IgG二抗(1∶200),室溫避光孵育1h。PBS浸洗,加入DAPI避光孵育10min。PBS浸洗,使用熒光顯微鏡觀察發(fā)射波長為488nm時蛋白的表達(dá)情況。

1.2.3CCK8法檢測HPF細(xì)胞增殖情況及細(xì)胞分組使用二甲基亞砜將姜黃素粉劑配制成100mmol/L的濃儲液儲存于-20℃,使用時用完全培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度,并且各個濃度的姜黃素中均含有等量的二甲基亞砜。將HPF細(xì)胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板,設(shè)置3個復(fù)孔。HPF細(xì)胞貼壁過夜后吸除培養(yǎng)基,向培養(yǎng)孔中加入分別含0、10、20、40、80、160μmol/L姜黃素的完全培養(yǎng)基100μL。姜黃素處理HPF細(xì)胞24h后吸除培養(yǎng)基并用PBS清洗細(xì)胞1次,向培養(yǎng)孔中加入10μL CCK8反應(yīng)液與90μL DMEM/F12培養(yǎng)基,于37℃,5%CO2孵箱中孵育1.5h后使用酶標(biāo)儀測量各孔在450nm處的吸光度。計(jì)算細(xì)胞活力,并使用GraphPad 7.0軟件篩選出細(xì)胞活力為50%的姜黃素濃度,即半數(shù)抑制濃度。以細(xì)胞活力為50%左右的姜黃素濃度為高濃度處理組(40μmol/L姜黃素組),濃度遞減50%為低濃度處理組(20μmol/L姜黃素組),同時設(shè)對照組(不含姜黃素),每組用相應(yīng)濃度姜黃素處理HPF細(xì)胞24h。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測HPF細(xì)胞凋亡情況各組HPF細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)濃度姜黃素處理24h后收集細(xì)胞,用500μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞,加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI,避光孵育15min后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測HPF細(xì)胞遷移情況將HPF細(xì)胞以1×105個/孔的密度接種于Transwell小室的上室,并在上室中加入相應(yīng)濃度的姜黃素(用無血清培養(yǎng)基配制)200μL,在下室中加入含20%FBS的完全培養(yǎng)基600μL。將Transwell小室放置于37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中,24h后取出Transwell小室的上室。PBS洗滌3次,4%多聚甲醛固定細(xì)胞20min,PBS洗滌3次,0.1%結(jié)晶紫染色20min,PBS洗滌3次,用棉簽擦去上室中未遷移的細(xì)胞,PBS洗滌3次,晾干后在顯微鏡下觀察遷移細(xì)胞并隨機(jī)選取5個視野計(jì)數(shù)。

1.2.6 實(shí)時熒光定量PCR檢測各組HPF細(xì)胞Bax、Bcl-2、CyclinD1及MMP2mRNA表達(dá)各組HPF細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)濃度姜黃素處理24h后按照動物組織總RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA,按照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,按照Takara熒光定量試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)。使用2-△△Ct法計(jì)算目標(biāo)基因的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.7Westernblot法檢測各組HPF細(xì)胞Bax、Bcl-2、CyclinD1及MMP2的蛋白表達(dá)各組HPF細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)濃度姜黃素處理24h后用PBS浸洗3次。棄PBS后用RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞30min,4℃ 12000r/min離心15min后收集上清液。以BCA法對蛋白定量,上清液中加入適量體積的PBS和蛋白上樣緩沖液使得最終蛋白濃度為2μg/μL,100℃蛋白變性10min后于-80℃保存。行12% SDS-PAGE電泳,上樣量為20μL,80V電泳30min后改為100V繼續(xù)電泳1h。采用濕轉(zhuǎn)的方式(100mA,1h)將蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜上。TBST洗膜3次,5%脫脂牛奶封閉2h。TBST洗膜3次,分別加入用抗體稀釋液稀釋的兔抗人Bax抗體(1∶1000)、兔抗人Bcl-2抗體(1∶1000)、兔抗人Cyclin D1抗體(1∶1000)、兔抗人MMP2抗體(1∶1000)、兔抗人β-Actin抗體(1∶5000),4℃孵育過夜。TBST洗膜3次,加入用抗體稀釋液稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗(1∶5000)室溫孵育2h。TBST洗膜3次,滴加ECL后進(jìn)行顯色。使用Image J計(jì)算各個條帶的灰度值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS24.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料符合正態(tài)分布者采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用單因素方差分析;方差齊時,組間兩兩比較使用LSD-t法;方差不齊時,組間兩兩比較使用Tamhanr’s T2法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1HPF細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定組織塊培養(yǎng)第3～5d開始出現(xiàn)少量長梭形細(xì)胞從組織塊邊緣爬出(圖1A)。傳代至第3代后,細(xì)胞為形態(tài)均一的長梭形(圖1B)。免疫熒光染色顯示細(xì)胞波形蛋白表達(dá)陽性(圖1C),廣譜細(xì)胞角蛋白表達(dá)陰性(圖1D)。結(jié)合標(biāo)本組織來源、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及免疫熒光染色結(jié)果,可證明本研究培養(yǎng)的細(xì)胞為HPF細(xì)胞。

圖1 HPF細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 A:組織塊法培養(yǎng)的HPF細(xì)胞;B:第3代HPF細(xì)胞;C:HPF細(xì)胞波形蛋白表達(dá)陽性;D:HPF細(xì)胞廣譜細(xì)胞角蛋白表達(dá)陰性。

2.2 姜黃素對HPF細(xì)胞增殖的影響與對照組相比,濃度為10、20、40、80、160μmol/L的姜黃素均能抑制HPF細(xì)胞的增殖,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2。并且HPF細(xì)胞活力隨姜黃素濃度的增加逐漸降低。40μmol/L姜黃素處理24h后HPF細(xì)胞活力為54.18%±3.71%,該濃度接近姜黃素的半數(shù)抑制濃度(46.38μmol/L),故將高濃度組設(shè)為40μmol/L姜黃素組,低濃度組設(shè)為20μmol/L姜黃素組,同時設(shè)對照組(不含姜黃素)。

圖2 姜黃素對HPF細(xì)胞增殖的影響(n=3) aP<0.05 vs 對照組;cP<0.05 vs 20μmol/L姜黃素組。

2.3 三組HPF細(xì)胞凋亡情況比較對照組凋亡率為9.18%±0.77%,20μmol/L姜黃素組凋亡率為11.37%±0.87%,40μmol/L姜黃素組凋亡率為31.73%±0.68%,三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=771.77,P<0.05),20μmol/L和40μmol/L姜黃素組與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),40μmol/L姜黃素組與20μmol/L姜黃素組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

圖3 三組HPF細(xì)胞凋亡情況比較(n=3) A:對照組;B:20μmol/L姜黃素組;C:40μmol/L姜黃素組;D:柱狀圖;aP<0.05 vs 對照組;cP<0.05 vs 20μmol/L姜黃素組。

2.4 三組HPF細(xì)胞遷移情況比較對照組遷移細(xì)胞數(shù)為88.80±2.46個,20μmol/L姜黃素組遷移細(xì)胞數(shù)為70.00±2.91個,40μmol/L姜黃素組遷移細(xì)胞數(shù)為43.67±8.03個,三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=58.58,P<0.05),20μmol/L和40μmol/L姜黃素組與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),40μmol/L姜黃素組與20 μmol/L姜黃素組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖4。

圖4 三組HPF細(xì)胞遷移情況比較(n=3) A:對照組;B:20μmol/L姜黃素組;C:40μmol/L姜黃素組;D:柱狀圖;aP<0.05 vs 對照組;cP<0.05 vs 20μmol/L姜黃素組。

2.5 三組HPF細(xì)胞Bax、Bcl-2、CyclinD1、MMP2mRNA表達(dá)比較三組間促凋亡基因Bax、抗凋亡基因Bcl-2、增殖調(diào)控相關(guān)基因Cyclin D1、遷移相關(guān)基因MMP2的mRNA表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。20μmol/L姜黃素組Bcl-2的mRNA表達(dá)與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),與對照組比較,20μmol/L姜黃素組能上調(diào)Bax、下調(diào)Cyclin D1、MMP2 mRNA表達(dá),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比,40μmol/L姜黃素組能上調(diào)Bax、下調(diào)Bcl-2、Cyclin D1、MMP2 mRNA表達(dá),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。40μmol/L與20μmol/L姜黃素組Bcl-2和Cyclin D1的mRNA表達(dá)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),與20μmol/L姜黃素組相比40μmol/L姜黃素組能下調(diào)MMP2和上調(diào)Bax mRNA表達(dá),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2,圖5。

圖5 三組HPF細(xì)胞Bax、Bcl-2、Cyclin D1、MMP2 mRNA表達(dá)比較(n=3) aP<0.05 vs 對照組;cP<0.05 vs 20μmol/L姜黃素組。

表2 三組HPF細(xì)胞Bax、Bcl-2、Cyclin D1、MMP2 mRNA表達(dá)比較

2.6 三組HPF細(xì)胞Bax、Bcl-2、CyclinD1、MMP2蛋白表達(dá)比較三組間Bax、Bcl-2、Cyclin D1、MMP2的蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。20μmol/L姜黃素組Bax、Cyclin D1及MMP2的蛋白表達(dá)與對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),20μmol/L姜黃素組與對照組比較能下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。40μmol/L姜黃素組與對照組比較能下調(diào)Bcl-2、Cyclin D1及MMP2的蛋白表達(dá),上調(diào)Bax的蛋白表達(dá),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。40μmol/L與20μmol/L姜黃素組Cyclin D1及MMP2的蛋白表達(dá)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與20μmol/L姜黃素組相比,40μmol/L姜黃素組能下調(diào)Bcl-2的蛋白表達(dá)水平,上調(diào)Bax的蛋白表達(dá)水平,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3,圖6。

表3 三組HPF細(xì)胞Bax、Bcl-2、Cyclin D1、MMP2蛋白表達(dá)比較

圖6 三組HPF細(xì)胞Bax、Bcl-2、Cyclin D1、MMP2 蛋白表達(dá)比較(n=3) A:Western blot結(jié)果;B:柱狀圖;aP<0.05 vs 對照組;cP<0.05 vs 20μmol/L姜黃素組。

3 討論

翼狀胬肉是一種以局部球結(jié)膜纖維血管組織增生并侵犯角膜為特點(diǎn)的常見眼表疾病,可引起視力下降、進(jìn)行性散光、眼表不適等癥狀[9]。紫外線照射、抑癌基因失活、上皮—間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化等是目前公認(rèn)的翼狀胬肉發(fā)病的原因,但各因素的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究[10]。盡管學(xué)者們提出了翼狀胬肉切除+自體結(jié)膜瓣移植術(shù)、翼狀胬肉切除+結(jié)膜瓣轉(zhuǎn)位術(shù)、翼狀胬肉切除+自體角膜緣干細(xì)胞移植術(shù)、翼狀胬肉切除+羊膜移植術(shù)等新型手術(shù)方式,翼狀胬肉術(shù)后復(fù)發(fā)率仍高[11]。傳統(tǒng)中藥姜黃最早記載于《新修本草》,有破血行氣,通經(jīng)止痛的功效[12]。姜黃素作為中藥姜黃發(fā)揮藥理作用的主要活性成分,因其良好的抗腫瘤、抗纖維化等作用而無明顯毒副作用受到廣泛關(guān)注[6-7]。現(xiàn)有的研究表明姜黃素能誘導(dǎo)前列腺癌成纖維細(xì)胞的G2/M期阻滯和細(xì)胞凋亡,能抑制心臟成纖維細(xì)胞的增殖、遷移和膠原生成,能降低TGF-β1誘導(dǎo)的眼眶成纖維細(xì)胞分化并減弱眼眶成纖維細(xì)胞的促血管生成活性[13-15]。本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能抑制HPF細(xì)胞的增殖和遷移,并誘導(dǎo)其凋亡,提示姜黃素可能通過抑制HPF細(xì)胞增殖與遷移,及誘導(dǎo)HPF細(xì)胞凋亡來阻礙翼狀胬肉的發(fā)展。

姜黃素能通過抑制細(xì)胞增殖來抑制肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[16]。翼狀胬肉與具有惡性增殖能力的腫瘤有著某些相同的特性。與邊芳等[17]的研究結(jié)果相似,本研究也發(fā)現(xiàn)姜黃素能抑制HPF細(xì)胞的增殖。Cyclin D1可以通過正向調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程來促進(jìn)癌細(xì)胞增殖,而Sare等[18]研究表明姜黃素能通過下調(diào)Cyclin D1的表達(dá)來抑制肝癌細(xì)胞的增殖。與此類似,本研究證實(shí)姜黃素能抑制HPF細(xì)胞的增殖,并能下調(diào)Cyclin D1的表達(dá)水平。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞程序化死亡,抗凋亡基因Bcl-2的下調(diào)和促凋亡基因Bax的上調(diào)可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。姜黃素能上調(diào)人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞Bax/Bcl-2的比率,并能通過caspase依賴途徑和非caspase依賴途徑誘導(dǎo)人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡[19]。本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能誘導(dǎo)HPF細(xì)胞的凋亡,還能下調(diào)Bcl-2的表達(dá)水平及上調(diào)Bax的表達(dá)水平。

與腫瘤有向鄰近組織侵犯的傾向相似,翼狀胬肉有自結(jié)膜逐漸向角膜中央侵犯的傾向。MMP2可通過降解Ⅳ型膠原蛋白使基底膜形成缺損進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的遷移[20]。翼狀胬肉組織和翼狀胬肉成纖維細(xì)胞中MMP2和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)的表達(dá)高于正常結(jié)膜組[21]。紫外線照射可以增強(qiáng)HPF細(xì)胞的移行能力,而姜黃素可以抑制紫外線照射后翼狀胬肉上皮細(xì)胞中MMP2和MMP9的表達(dá)[22-23]。本研究結(jié)果表明姜黃素能抑制HPF細(xì)胞的遷移,還能下調(diào)其MMP2的表達(dá)水平。

綜上,本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可通過抑制Cyclin D1的表達(dá)來抑制HPF細(xì)胞的增殖,通過下調(diào)Bcl-2并上調(diào)Bax的表達(dá)來誘導(dǎo)HPF細(xì)胞的凋亡,通過下調(diào)MMP2的表達(dá)來抑制HPF細(xì)胞的遷移,這為姜黃素成為一種臨床治療翼狀胬肉的藥物提供了一定理論依據(jù)。