彭海霞，卡得艷，張?zhí)煨?，周?mèng)蝶，吳林楠，辛轉(zhuǎn)霞，趙惠賢，馬猛

過(guò)量表達(dá)小麥增加花器官的大小

1西北農(nóng)林科技大學(xué)風(fēng)景園林藝術(shù)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100；3西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100

【目的】利用表達(dá)模式分析、轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)和細(xì)胞學(xué)觀察等策略，解析調(diào)控花器官大小的功能和機(jī)制，為作物遺傳改良提供基因資源和理論基礎(chǔ)?！痉椒ā扛鶕?jù)EnsemblPlants基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中不同物種CYP78A家族成員的序列信息，對(duì)小麥和其他物種中的同源基因進(jìn)行序列比對(duì)和進(jìn)化分析；利用生物信息學(xué)分析小麥的基因和蛋白結(jié)構(gòu)，以及不同器官的表達(dá)模式；通過(guò)在擬南芥中組成型過(guò)表達(dá)和生殖器官局部特異性過(guò)表達(dá)的策略，明確具有調(diào)控花器官大小的功能；利用顯微鏡觀察不同轉(zhuǎn)基因擬南芥花器官的細(xì)胞學(xué)特征，解析調(diào)控花器官大小的細(xì)胞學(xué)機(jī)制；利用小麥轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)策略，明確調(diào)控小麥穗部大小等其他穗部性狀的功能；利用323份小麥品種的單倍型數(shù)據(jù)與穗部表型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，探析不同小麥品種表達(dá)量的高低對(duì)穗部大小等其他穗部性狀的影響?！窘Y(jié)果】小麥與擬南芥的基因和蛋白序列相似性較低，但基因和蛋白結(jié)構(gòu)相似性較高。小麥和擬南芥均在多個(gè)器官?gòu)V泛表達(dá)，但在花器官中表達(dá)量最高。相較于野生型，在擬南芥中組成型過(guò)表達(dá)能導(dǎo)致花器官增大，花瓣面積顯著增加13.5%—35.4%；而且僅在胚珠局部特異性過(guò)表達(dá)也足以導(dǎo)致擬南芥花器官增大，花瓣面積顯著增加9%—22.1%；相反，擬南芥突變體的花器官則顯著小于野生型，花瓣面積顯著減少27%。在擬南芥中組成型過(guò)表達(dá)導(dǎo)致花瓣表皮細(xì)胞大小較野生型顯著增加49%—54%，細(xì)胞數(shù)目較野生型顯著減少11%—19%，局部特異性過(guò)表達(dá)也導(dǎo)致花瓣表皮細(xì)胞大小較野生型顯著增加20%—49%，細(xì)胞數(shù)目較野生型顯著減少8%—24%。在小麥中組成型過(guò)表達(dá)導(dǎo)致小麥穗長(zhǎng)增加7.9%—8.9%，穎殼面積增大9.6%—14.7%，穗粒數(shù)增加12.4%—23.8%，小穗數(shù)和小穗粒數(shù)呈現(xiàn)不同程度的變化。單倍型分析結(jié)果顯示，在323份小麥品種中，具有較高表達(dá)量的小麥品種比具有較低表達(dá)量的小麥品種的穗長(zhǎng)更長(zhǎng)，小穗粒數(shù)更多，小穗數(shù)更少，而穗粒數(shù)無(wú)顯著差異。【結(jié)論】以一種非細(xì)胞自制的模式促進(jìn)花器官生長(zhǎng)，小麥和擬南芥過(guò)量表達(dá)該基因均能導(dǎo)致花器官的增大。

小麥；；過(guò)量表達(dá)；花器官大??；細(xì)胞擴(kuò)張

0 引言

【研究意義】花器官的大小是植物的一個(gè)關(guān)鍵形態(tài)特征，影響植物交配系統(tǒng)進(jìn)化和繁殖[1]。在作物中，花器官直接產(chǎn)生了人類所需的大部分食物，其大小深刻影響著作物的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)[2]。因此，研究花器官大小相關(guān)基因和解析其調(diào)控機(jī)制具有重要理論意義和實(shí)踐價(jià)值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物器官的發(fā)育基于2個(gè)不同的過(guò)程：細(xì)胞的增殖和擴(kuò)張。它們分別通過(guò)影響細(xì)胞數(shù)量和大小來(lái)調(diào)控植物器官的形態(tài)建成和大小[3]。其中，植物對(duì)花器官大小的調(diào)控主要通過(guò)對(duì)細(xì)胞增殖或擴(kuò)張的持續(xù)時(shí)間和比率來(lái)實(shí)現(xiàn)[4]。目前，研究發(fā)現(xiàn)影響花器官大小的基因主要涉及泛素途徑、植物激素信號(hào)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等途徑[5]。其中，涉及泛素途徑的基因大多負(fù)調(diào)控花器官的大小。如E3泛素連接酶BIG BROTHER（BB）、泛素受體DA1、E3泛素連接酶DA2等，均通過(guò)限制細(xì)胞增殖來(lái)調(diào)節(jié)花器官的大小[6-8]。植物激素信號(hào)廣泛參與多種器官（包括花器官在內(nèi)）大小的調(diào)控。如擬南芥花瓣（）的表達(dá)受茉莉酸信號(hào)的調(diào)節(jié)，通過(guò)限制有絲分裂后細(xì)胞的擴(kuò)張，調(diào)節(jié)花瓣的生長(zhǎng)，而且該基因還與生長(zhǎng)素響應(yīng)基因（）互作，共同調(diào)節(jié)花瓣的發(fā)育和大小[9-11]。此外，在擬南芥花發(fā)育過(guò)程中，ABCE四類基因的不同組合能夠協(xié)同調(diào)控萼片（A+E）、花瓣（A+B+E）、雄蕊（B+C+E）和心皮（C+E）的發(fā)育。其中，A類基因（）編碼AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子，E類基因（）編碼MADS結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子，其在整個(gè)花器官發(fā)育中均有表達(dá)，協(xié)同調(diào)控花器官發(fā)育的不同過(guò)程[12-13]。細(xì)胞色素P450家族是植物中最大的基因家族之一，廣泛參與植物各項(xiàng)生理活動(dòng)[14]。其中，CYP78A亞家族成員具有調(diào)節(jié)多種器官發(fā)育的功能。如，擬南芥CYP78A亞家族包含6個(gè)成員，其中，功能的喪失導(dǎo)致葉面積、角果長(zhǎng)度和種子大小降低[15-18]。和同源性較高，雙缺變體表現(xiàn)出胚發(fā)育和葉片起始異常[19-20]。、和同源性較高，和雙缺突變體均表現(xiàn)為外珠被發(fā)育停滯，進(jìn)而導(dǎo)致種子大小和育性降低[21-22]。其中，和均通過(guò)控制母性表皮的細(xì)胞增殖影響種子的大小[22-24]。水稻CYP78A亞家族包含8個(gè)成員，其中，（）主要通過(guò)控制分生組織的活性影響葉片的起始和穗分枝的形成[25-26]。（）則通過(guò)控制胚乳細(xì)胞的凋亡調(diào)節(jié)種子的大小[27-29]。小麥CYP78A亞家族包含4個(gè)成員，通過(guò)調(diào)控種皮細(xì)胞增殖影響籽粒的大小[30]。過(guò)表達(dá)能促進(jìn)種皮細(xì)胞增殖，進(jìn)而導(dǎo)致籽粒增大。而且，僅在母性表皮中特異過(guò)表達(dá)，就足以導(dǎo)致籽粒增大、單株產(chǎn)量增加[31]。另一方面，CYP78A家族基因調(diào)控器官發(fā)育可能涉及激素代謝。如，水稻可能參與脂肪酸和生長(zhǎng)素的合成代謝途徑[25, 32]；擬南芥和小麥在調(diào)節(jié)器官生長(zhǎng)及衰老過(guò)程中均檢測(cè)到生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素含量的變化[17, 31, 33]。因此，推測(cè)CYP78A亞家族成員依賴下游一個(gè)可移動(dòng)的激素類促生因子，促進(jìn)其表達(dá)部位附近器官的生長(zhǎng)[17, 34-35]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】小麥?zhǔn)侵匾募Z食作物之一。麥穗是一種特殊的花或果實(shí)器官，其大小直接影響小麥的產(chǎn)量。趙惠賢課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，盡管小麥和擬南芥具有相似的調(diào)控植物株型和種子大小的功能，但小麥僅能部分回補(bǔ)擬南芥的功能缺失表型。而且小麥和擬南芥在調(diào)控葉片大小、葉起始速率等方面存在顯著的差異，表明具有一定的保守性，但在不同物種間的功能存在分化[17, 36]。此外，小麥?zhǔn)欠窬哂姓{(diào)控花器官的功能仍然未知，在調(diào)控花器官發(fā)育方面是否仍然具有物種間的保守和分化也有待揭示?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)比較分析小麥和擬南芥的結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式，解析在物種間功能保守和分化的潛在基礎(chǔ)；進(jìn)一步系統(tǒng)調(diào)查轉(zhuǎn)基因植株花器官的表型，明確小麥和擬南芥具有正調(diào)控花器官大小的功能，及其調(diào)控機(jī)制的差異，為進(jìn)一步揭示調(diào)控植物器官大小的功能和機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為作物遺傳改良提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

擬南芥材料均以哥倫比亞野生型（Columbia）為遺傳背景。擬南芥功能缺失突變體購(gòu)自Arabidopsis Biological Resources（突變體編號(hào)：Salk_024697C）。T2組成型啟動(dòng)子和胚珠特異型啟動(dòng)子（promoter of）驅(qū)動(dòng)的過(guò)表達(dá)擬南芥（::和::）由趙惠賢實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建，其中，::3個(gè)株系（::、::-3和::-6）和::5個(gè)株系（::、::、::、::和::）均為純合株系。轉(zhuǎn)基因材料的構(gòu)建和鑒定詳見前期研究[17, 36]。上述材料均置于溫室（晝16 h/夜8 h，70%相對(duì)濕度，130—170 μmol·m-2·s-2光照強(qiáng)度）培養(yǎng)。

小麥材料均以春麥JW1為遺傳背景。JW1為濟(jì)麥22和fielder雜交選育的新品系。T3組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小麥（::）由趙惠賢實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建，其中，::2個(gè)株系（::和::）均為純合株系。轉(zhuǎn)基因材料的構(gòu)建和鑒定詳見前期研究[31]。上述材料均置于溫室（晝16 h/夜8 h，30%—60%相對(duì)濕度，300—500 μmol·m-2·s-2光照強(qiáng)度）培養(yǎng)。

1.2 CYP78A5的生物信息學(xué)分析

從EnsemblPlants（https://plants.ensembl.org/）查詢下載不同物種CYP78A家族成員的序列。利用DNAMAN（https://www.lynnon.com）軟件分析序列相似性。利用InterProScan（https://www.ebi.ac.uk/interpro/ search/sequence/）在線軟件分析蛋白結(jié)構(gòu)，利用TMpred（https://sbcb.bioch.ox.ac.uk/TM_noj/TM_noj. html）和PROSITE（https://web.expasy.org/docs/swiss- prot_guideline.html）軟件分析蛋白保守結(jié)構(gòu)域，使用SwissModel（https://swissmodel.expasy.org/）軟件預(yù)測(cè)蛋白三維結(jié)構(gòu)。利用CLUSTAL W（https://www.ebi. ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。各器官的表達(dá)模式數(shù)據(jù)來(lái)源于EnsemblPlants（https:// plants.ensembl.org/）。

1.3 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的鑒定

轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性擬南芥植株的鑒定：用200 mg·L-1Basta溶液噴施轉(zhuǎn)基因擬南芥（長(zhǎng)出2片真葉），隔一天噴施一次（共3次），葉片仍為綠色的植株為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性擬南芥，可用于后續(xù)表型觀察。

轉(zhuǎn)基因小麥純合株系的鑒定：在小麥3葉期，用200 mg·L-1Basta溶液涂抹小麥第一片葉，7 d后，葉片仍為綠色的植株為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小麥，可用于后續(xù)表型觀察。

1.4 花器官的形態(tài)學(xué)觀察

將野生型擬南芥和篩選獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)擬南芥種植于溫室，待擬南芥開花后，對(duì)花器官形態(tài)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，記錄花器官的整體或花瓣局部形態(tài)。采集主莖上完全開放的花朵，拍照，利用Image J（National Institutes of Health）軟件測(cè)量花瓣面積，每個(gè)株系至少檢測(cè)6個(gè)單株，每個(gè)單株不少于3朵花。

將野生型小麥以及篩選獲得的陽(yáng)性::小麥種植于溫室中，待植株抽穗并揚(yáng)花12 d后，對(duì)其穗部進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，記錄穗部的整體或外穎殼局部形態(tài)。利用Image J軟件測(cè)量穎殼投影面積，每個(gè)株系至少采樣檢測(cè)6個(gè)單株，每個(gè)單株不少于4個(gè)穎殼。

1.5 擬南芥花瓣的細(xì)胞學(xué)觀察

選取溫室下長(zhǎng)勢(shì)健康的野生型、突變體以及::和::轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，待植株開花后，收集其主莖上相同位置且完全開放花朵的花瓣樣品，4℃卡諾固定液（Carnoy Fix Soution，Coolaber，北京）浸泡20 min，然后使用梯度酒精（30%、50%、75%、95%和100%）浸泡30 min，至完全脫色。光學(xué)顯微鏡觀察并采集花瓣中部圖像，利用Image J軟件測(cè)定細(xì)胞面積，并計(jì)算表皮的細(xì)胞總數(shù)目（表皮的細(xì)胞總數(shù)目=花瓣面積/細(xì)胞面積）。每個(gè)株系至少測(cè)量6個(gè)單株，每個(gè)單株不少于3朵花（12個(gè)花瓣），每個(gè)花瓣中部選取不少于10個(gè)細(xì)胞用于上述細(xì)胞學(xué)觀察。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用-Test算法進(jìn)行數(shù)據(jù)間差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 CYP78A5在花器官高表達(dá)且在物種間基因結(jié)構(gòu)保守

小麥基因組包含3個(gè)擬南芥的同源基因，分別為（TraesCS2A01G175700.1）、（TraesCS2B01G201900.1）和（TraesCS2D01G183000.1），其核苷酸序列相似性極高，大于98%（圖1-A和圖2-A）。進(jìn)化分析顯示，CYP78A亞家族成員廣泛存在于陸生植物，其中，小麥與水稻和擬南芥序列相似性較高（圖1-A—B）。

為了解析小麥與擬南芥在調(diào)控多種器官發(fā)育方面表現(xiàn)出相似功能的原因，進(jìn)一步分析小麥與擬南芥的基因和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，小麥與擬南芥的編碼區(qū)均由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子組成。和同編碼區(qū)的差異主要體現(xiàn)在第二個(gè)外顯子和內(nèi)含子存在不同程度的缺失（圖1-B）。小麥與擬南芥的編碼蛋白序列相似性較低（約55%），但都包含N端的疏水區(qū)域和C端的氧結(jié)合結(jié)構(gòu)域及血紅素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（圖1-B和圖2-A）。蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，小麥與擬南芥的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)相似性較高（圖2-B）。

進(jìn)一步對(duì)小麥與擬南芥在器官間的表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，小麥與擬南芥在各器官中均廣泛表達(dá)，其中，小麥與擬南芥在各器官中的表達(dá)模式極為相近，尤其是在早期的花和幼穗中表現(xiàn)出極為相似的高表達(dá)水平（圖1-C）。以上結(jié)果表明，小麥與擬南芥的基因和蛋白序列相似性較低，但蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式相似性較高，可能是小麥與擬南芥在調(diào)控多種器官發(fā)育方面表現(xiàn)出功能保守和分化的潛在基礎(chǔ)。

2.2 過(guò)量表達(dá)TaCYP78A5導(dǎo)致擬南芥花器官增大

鑒于小麥與擬南芥均在發(fā)育初期的花器官中高表達(dá)，可能均參與調(diào)控花器官的大小。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這個(gè)推測(cè)，通過(guò)調(diào)查前期構(gòu)建的::轉(zhuǎn)基因擬南芥株系花器官的特征，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，組成型過(guò)表達(dá)（::）能夠?qū)е禄ㄆ鞴俚娘@著增大。與之相對(duì)應(yīng)的是，擬南芥突變體植株卻表現(xiàn)出明顯的花器官減小（圖3-A—H）。

為進(jìn)一步驗(yàn)證對(duì)花器官的調(diào)控是否以非細(xì)胞自制方式促進(jìn)其表達(dá)部位周圍器官的生長(zhǎng)，通過(guò)對(duì)前期構(gòu)建的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系::花器官的表型觀察。發(fā)現(xiàn)僅在胚珠中特異性過(guò)量表達(dá)就足以導(dǎo)致花器官顯著增大（圖3-B和圖3-F）。

A：TaCYP78A5（由TaCYP78A5-A推導(dǎo)的蛋白序列）和其他CYP78A家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析；B：TaCYP78A5-A、TaCYP78A5-B和TaCYP78A5-D的外顯子和內(nèi)含子構(gòu)造，黑色表示蛋白編碼區(qū)，裂開的地方表示缺失區(qū)域，黃色、藍(lán)色和紅色分別表示編碼疏水區(qū)、氧結(jié)合位點(diǎn)和亞鐵血紅素結(jié)合位點(diǎn)的序列；C：擬南芥AtCYP78A5和小麥TaCYP78A5的器官表達(dá)模式

進(jìn)一步對(duì)不同基因型植株的花瓣面積進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，與野生型相比，::和::植株的花瓣面積分別顯著增大13.5%—35.4%和9%—22.1%，而突變體的花瓣面積則顯著縮小27%（圖3-I—J）。

綜上，的表達(dá)能夠以一種非細(xì)胞自制的模式促進(jìn)花器官的增大。

2.3 過(guò)量表達(dá)TaCYP78A5促進(jìn)擬南芥花瓣細(xì)胞的擴(kuò)張

為了進(jìn)一步解析調(diào)控花器官大小的細(xì)胞學(xué)機(jī)制，分別調(diào)查了上述不同基因型擬南芥花瓣的表皮細(xì)胞特征。結(jié)果顯示，與野生型相比，隨著花瓣面積的增加，組成型過(guò)表達(dá)（::）導(dǎo)致表皮細(xì)胞大小顯著增加49%—54%，而其細(xì)胞數(shù)目較野生型卻顯著減少11%—19%（圖4-A—H）。相似的，局部特異性過(guò)表達(dá)（::）也導(dǎo)致花瓣表皮細(xì)胞大小和花瓣面積同步增加（增加20%—49%），花瓣表皮細(xì)胞數(shù)目呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)（減少8%—24%）（圖4-A—I）。與之相反，與野生型相比，突變體植株的花瓣細(xì)胞面積顯著增加19.9%，細(xì)胞數(shù)目卻減少37.8%（圖4-H—I）。以上結(jié)果表明，的過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致的花器官增大主要?dú)w因于細(xì)胞的擴(kuò)張。

2.4 過(guò)量表達(dá)TaCYP78A5導(dǎo)致小麥穗部增大

為了明確在小麥和擬南芥中對(duì)花器官的調(diào)控作用是否保守，即在小麥中是否也能夠正向調(diào)控花器官大小，對(duì)前期構(gòu)建的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小麥（::）的穗部特征進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，與野生型相比，小麥組成型過(guò)表達(dá)導(dǎo)致小麥穗長(zhǎng)顯著增加7.9%—8.9%（圖5-A和圖5-E）。通過(guò)詳細(xì)調(diào)查小麥揚(yáng)花后12 d的穗部表型，發(fā)現(xiàn)在小麥中的過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致小穗和穎殼同步增大，其中，穎殼面積（由外穎殼最大投影面積表示）顯著增大9.6%—14.7%（圖5-B和圖5-I）。增大的穗部可為種子的生長(zhǎng)提供更大的物理空間[2]，這與過(guò)表達(dá)導(dǎo)致種子增大的表型相符（圖5-B和圖5-D）。此外，組成型過(guò)表達(dá)導(dǎo)致小穗數(shù)呈現(xiàn)不同程度的下降（圖5-G），而小穗粒數(shù)呈現(xiàn)不同程度的上升，但差異不顯著（圖5-H）。最終伴隨著穗部的增大，過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的穗粒數(shù)顯著高于野生型，增加12.4%—23.8%。可見，與在擬南芥中對(duì)花器官大小的調(diào)控作用相似，在小麥中也能夠調(diào)控穗部的大小和其他穗部性狀。

A—H：植株花器官的形態(tài)；I—J：植株花瓣面積的統(tǒng)計(jì)（n＞36），以花瓣最大投影面積作為花瓣面積；*和**分別表示在P＜0.05和P＜0.01水平時(shí)的差異顯著。下同。A—D的標(biāo)尺為0.5 cm；E—H的標(biāo)尺為500 μm

2.5 不同小麥品種TaCYP78A5的表達(dá)對(duì)小麥穗部增大的影響

為了進(jìn)一步明確不同小麥品種中的表達(dá)量是否會(huì)影響穗部性狀，通過(guò)對(duì)具有較高表達(dá)量的小麥品種（簡(jiǎn)稱小麥）和較低表達(dá)量的小麥品種（簡(jiǎn)稱小麥）穗部性狀進(jìn)行調(diào)查。結(jié)果顯示，小麥（共計(jì)265個(gè)小麥品種）的穗長(zhǎng)顯著高于小麥（共計(jì)58個(gè)小麥品種），穗長(zhǎng)增加約5%（圖6-A—B）。此外，與轉(zhuǎn)基因植株的表型一致（圖5），擁有較高表達(dá)量的小麥小穗數(shù)顯著低于小麥，而小穗粒數(shù)顯著高于小麥（圖6-C—D）。最終導(dǎo)致在籽粒增大的同時(shí)，穗粒數(shù)不變（圖6-E）。進(jìn)一步證明表達(dá)量的高低影響穗部大小和穗部其他性狀。

A：植株花瓣的形態(tài)；B—E：植株花瓣中部表皮細(xì)胞的形態(tài)；F—G：植株花瓣中部表皮細(xì)胞面積的統(tǒng)計(jì)（n＞50）；H—I：植株花瓣表皮細(xì)胞數(shù)目的統(tǒng)計(jì)（n＞50）。A的標(biāo)尺為500 μm；B—E的標(biāo)尺為50 μm

3 討論

3.1 不同物種間CYP78A5母性調(diào)控花器官大小功能的保守和分化

花是種子植物所特有的繁殖器官，是植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)向生殖生長(zhǎng)的重要階段。在植物特別是異花授粉的植物中，花器官的大小影響了植物繁殖的成功率[37]。大花通常含有更多的花蜜，而且比小花更顯眼，通常能增加傳粉者的訪問(wèn)頻率。因此，無(wú)論是在植物物種內(nèi)部還是在物種之間，傳粉者被大花吸引的行為可以施加強(qiáng)烈的定向選擇，使異交植物傾向于產(chǎn)生更大的花[38]。因此，在群體遺傳學(xué)中如果把能否成功繁殖作為適合度的組成部分，人們發(fā)現(xiàn)植物對(duì)較大花朵的定向選擇在不同物種間普遍存在[39]。盡管小麥、水稻等主要農(nóng)作物是自花授粉，花器官的大小不再是繁殖成功率的決定因素。但是花器官的大小也影響著最終果實(shí)或種子的大小。如子房是花器官的主要組成部分，在多個(gè)麥類作物中觀測(cè)到子房大小與最終籽粒大小之間存在強(qiáng)烈的正相關(guān)性[40-42]。因此，前期趙惠賢課題組僅在小麥子房中特異性過(guò)表達(dá)就足以導(dǎo)致子房和籽粒的同步增大[31]。而且，無(wú)論是自花授粉還是異花授粉植物，揚(yáng)花前母性生殖器官的發(fā)育狀況都會(huì)對(duì)揚(yáng)花后子代果實(shí)或者種子的發(fā)育產(chǎn)生巨大的影響，而這種母性控制被認(rèn)為在被子植物中廣泛存在[2, 43]。

A—C：揚(yáng)花后12 d的穗部、穎殼和小穗表型；D：揚(yáng)花后30 d的籽粒表型；E—I：揚(yáng)花后12 d的穗長(zhǎng)、穎殼面積、小穗數(shù)、小穗粒數(shù)和穗粒數(shù)的統(tǒng)計(jì)（n＞8），所有植株均在溫室中采用相同條件種植。A—D的標(biāo)尺為1 cm

被認(rèn)為是一種潛在的母性促生因子，主要通過(guò)促進(jìn)器官母性表皮細(xì)胞增殖或擴(kuò)張來(lái)調(diào)控器官的大小[17-18, 31, 23]。小麥和水稻是擬南芥的直系同源基因，它們具有保守的結(jié)構(gòu)域（圖2）[44]，且都可以部分恢復(fù)擬南芥的突變表型[28]。在擬南芥和小麥中，均在籽粒發(fā)育階段的母性表皮中高表達(dá)；的過(guò)量表達(dá)能夠促進(jìn)母性表皮細(xì)胞的增殖，引起珠被和種皮的協(xié)同增大，并最終導(dǎo)致種子增大[16, 31]。番茄的功能缺失會(huì)導(dǎo)致果皮的細(xì)胞數(shù)目降低，果實(shí)變小[45]。過(guò)量表達(dá)小麥能夠通過(guò)延長(zhǎng)母性表皮細(xì)胞增殖的時(shí)間來(lái)促進(jìn)葉片的增大[17]。本研究發(fā)現(xiàn)在小麥或擬南芥中過(guò)量表達(dá)均能導(dǎo)致花器官和穗部的增大（圖3和圖5）。其中，過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致擬南芥花瓣表皮細(xì)胞大小也較野生型顯著增加49%—54%，細(xì)胞數(shù)目較野生型顯著減少11%—19%。利用胚珠特異性啟動(dòng)子局部特異性過(guò)表達(dá)[46]，也導(dǎo)致擬南芥花瓣表皮細(xì)胞大小增加20%—49%，花瓣表皮細(xì)胞數(shù)目減少8%—24%，表明小麥的過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致花器官增大主要?dú)w因于母性表皮細(xì)胞的擴(kuò)張。與之相反，擬南芥突變體植株的花瓣細(xì)胞面積顯著增加19.9%，細(xì)胞數(shù)目卻減少37.8%（圖4），表明擬南芥功能缺失導(dǎo)致的花器官變小主要?dú)w因于母性表皮細(xì)胞增殖的降低。同樣，擬南芥和小麥均能正調(diào)控葉片大小，而在調(diào)控葉片起始率和葉片數(shù)目上功能存在差異[17]。上述研究結(jié)果表明，不同物種間在調(diào)控器官大小方面功能保守，但在調(diào)控母性表皮細(xì)胞增殖或擴(kuò)張的機(jī)制可能存在差異。

A：小麥Ap-HapⅠ和Ap-HapⅡ的穗部表型；B—E：小麥Ap-HapⅠ（n=265）和Ap-HapⅡ（n=58）穗長(zhǎng)、小穗數(shù)、小穗粒數(shù)和穗粒數(shù)的統(tǒng)計(jì)。表型數(shù)據(jù)來(lái)源于323個(gè)小麥品種在5個(gè)環(huán)境點(diǎn)的平均值

穗部是母體植株為后代種子發(fā)育提供的載體，穗部的發(fā)育狀況會(huì)直接影響著種子大小和數(shù)目[2]。與之相對(duì)應(yīng)的，無(wú)論是在小麥或擬南芥中過(guò)量表達(dá)，都會(huì)導(dǎo)致花器官和種子的同步增大（圖3和圖5）[16, 18, 31]?；ㄆ鞴倩蛩氩康脑龃竽軌蚪o后期種子的發(fā)育提供更大的物理空間上限[2]，而這很可能是過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致花器官和種子同步增大的原因之一。另一方面，有限的資源使得母體植株會(huì)協(xié)調(diào)種子的大小和數(shù)目[47]。轉(zhuǎn)基因表型和單倍型分析結(jié)果均表明，表達(dá)量的變化還會(huì)影響小穗數(shù)、穗粒數(shù)和小穗粒數(shù)等與種子數(shù)目直接相關(guān)的穗部性狀（圖5和圖6）?？傊?，花器官大小的調(diào)控可能是母體植株協(xié)調(diào)種子大小和數(shù)目的手段之一，而不同物種間可能通過(guò)調(diào)控花器官的大小來(lái)影響種子大小、數(shù)目乃至產(chǎn)量。

3.2 TaCYP78A5調(diào)控器官大小可能涉及植物激素代謝途徑

除環(huán)境因素以外，花器官的大小主要受內(nèi)在遺傳因素控制。其中生長(zhǎng)素作為一種最基本的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，廣泛參與了包括花器官在內(nèi)的多種器官發(fā)育的調(diào)控[4]。在擬南芥中組成型過(guò)表達(dá)生長(zhǎng)素誘導(dǎo)基因（）能夠延長(zhǎng)細(xì)胞分裂的時(shí)間，進(jìn)而導(dǎo)致花器官增大；而功能缺失則會(huì)導(dǎo)致花器官變小[48]。生長(zhǎng)素響應(yīng)基因（）的突變會(huì)產(chǎn)生更大的花瓣，而花瓣大小的增加是由細(xì)胞大小和細(xì)胞數(shù)量同時(shí)增加所致[49]。前人推測(cè)家族成員依賴于下游一個(gè)類似植物激素的促生因子，以非細(xì)胞自制方式促進(jìn)其表達(dá)部位周圍器官的生長(zhǎng)[17, 34-35]。然而，關(guān)于是否涉及生長(zhǎng)素代謝途徑一直存在爭(zhēng)議，因?yàn)橥庠瓷L(zhǎng)素處理不能恢復(fù)突變體葉起始速率加快的表型[16]。并且突變體中不僅檢測(cè)到生長(zhǎng)素含量變化，也檢測(cè)到細(xì)胞分裂素等其他植物激素的含量存在波動(dòng)[33]。

然而，實(shí)驗(yàn)室前期利用代謝組學(xué)、激素含量測(cè)定和生長(zhǎng)素響應(yīng)標(biāo)記基因::檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小麥和擬南芥突變體，均發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素含量發(fā)生了明顯的變化[31, 36]。相似的生長(zhǎng)素累積現(xiàn)象在玉米過(guò)表達(dá)植株中也被檢測(cè)到[25, 50]。本研究發(fā)現(xiàn)僅在胚珠中特異性過(guò)表達(dá)就足以導(dǎo)致整個(gè)花器官的增大和開花時(shí)間的延長(zhǎng)，表明是以一種非細(xì)胞自制的模式調(diào)控花器官的發(fā)育和大小。而這種非細(xì)胞自制的作用模式是植物激素的典型特征[51]。此外，前人研究發(fā)現(xiàn)具有類似生長(zhǎng)素維持植株頂端優(yōu)勢(shì)及延緩器官衰老的功能[20, 25, 36, 52]。小麥過(guò)量表達(dá)會(huì)加強(qiáng)植株的頂端優(yōu)勢(shì)[31]；擬南芥功能缺失會(huì)導(dǎo)致頂端優(yōu)勢(shì)降低[16, 19]。小麥過(guò)表達(dá)會(huì)推遲開花時(shí)間[31]；而本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)不僅能夠增加擬南芥花器官的大?。▓D3），還能夠延長(zhǎng)開花時(shí)間和延緩衰老（未展示）。上述結(jié)果均表明，調(diào)控器官大小可能涉及植物激素代謝途徑。然而，CYP78A基因家族成員作為一種細(xì)胞色素單加氧酶，盡管有證據(jù)表明其在脂肪酸等次生代謝物的合成中發(fā)揮著重要作用[16, 18]，但是否以及如何參與植物激素代謝仍需要更強(qiáng)有力的證據(jù)來(lái)證明。

4 結(jié)論

小麥在幼穗中高表達(dá)，在擬南芥和小麥中過(guò)量表達(dá)均能導(dǎo)致花器官和穗部的顯著增大，不同小麥品種中表達(dá)量的升高有利于穗長(zhǎng)的增加，表明正調(diào)控花器官大小。

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Overexpression of wheatincreases flower organ size

1College of Landscape Architecture and Art, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi;2College of Life Sciences, Northwest A & F University, Yangling 712100, Shaanxi;3College of Agronomy, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi

【Objective】The function and mechanism ofregulating flower organ size was preliminarily analyzed by means of expression pattern analysis, transgenic overexpression and cytological observation. The results provide genetic resources and theoretical basis for crop genetic improvement. 【Method】According to the sequence information of CYP78A family members of different species in EnsemblePlants genome database, sequence alignment and evolutionary analysis were carried out for the homologous genes ofwere analyzed by bioinformatics. Through the strategy of constitutive overexpression and local specific overexpression in reproductive organs of, it is clear thathas the function of regulating flower organ size. The cytological characteristics of flower organs of different transgenicwere observed under microscope, and the cytological mechanism ofregulating flower organ size was analyzed. The function ofexpression on spike size and other spike traits of different wheat accessions. 【Result】The gene and protein sequence similarity of wheatandis low, but the gene and protein structure similarity is high. Wheatandare widely expressed in many organs, but highly expressed in flower organs. Compared with wild type, the constitutive overexpression ofcould lead to the enlargement of flower organs and a significant increase in petal area of 13.5%-35.4%. Moreover, the specific overexpression ofonly in the ovule was enough to cause the enlargement of the flower organ of, and the petal area increased significantly by 9%-22.1%. On the contrary, the flower organ ofmutant was significantly smaller than that of wild type, and the petal area was significantly reduced by 27%. The constitutive overexpression ofinresulted in a significant increase in the size of petal epidermal cells by 49%-54% compared with wild type, and a significant decrease in the number of cells by 11%-19% compared with wild type. Locally specific overexpression ofinalso resulted in a significant increase in the size of petal epidermal cells by 20%-49% compared with wild type, and a significant decrease in the number of cells by 8%-24% compared with wild type. The constitutive overexpression ofexpression level had longer spike length, more grains per spikelet and fewer spikelets per spike than wheat accessions with lowerexpression level, but there was no significant difference in grain number per spike. 【Conclusion】promoted the growth of flower organs in a non cellular self-made mode. The overexpression ofcould lead to the enlargement of flower organs.

wheat;; overexpression; flower organ size; cell expansion

2022-11-28；

2023-02-22

國(guó)家自然科學(xué)基金（32072003，32072059）

彭海霞，E-mail：penghaixia@nwafu.edu.cn。通信作者馬猛，E-mail：mengma5@nwafu.edu.cn

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.09.002

（責(zé)任編輯 李莉）