陳和明 蔡文杰 呂復(fù)兵 肖文芳 李 佐 朱根發(fā)

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 環(huán)境園藝研究所/廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新綜合利用重點實驗室,廣州 510640;2.臺灣成功大學(xué) 熱帶植物與微生物科學(xué)研究所,中國 臺南 701)

蘭科植物(Orchidaceae)有5個亞科801個屬28 237個種,是單子葉植物第一大科,約占所有被子植物種類的10%[1-2],其物種分布于世界各地,主要生長于熱帶及亞熱帶雨林,亦有部分生存于溫帶地區(qū)。我國蘭花資源十分豐富,分布于5個亞科約有190個屬1 600個種以及大量的變種,但以云南、臺灣和海南最為豐富[3-4]。目前我國蘭花品種的選育仍以選擇育種和雜交育種為主,但常規(guī)育種存在育種年限長、工作量大和育種效率低,以及易受外界環(huán)境條件影響等實際問題[2],導(dǎo)致我國蘭花品種選育較為緩慢,不能滿足日益增長的市場需求。伴隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展,構(gòu)建高密度遺傳圖譜,挖掘與目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記進行早期間接選擇,能夠大幅縮短育種周期,加快育種進程[5]。但有關(guān)蘭科植物遺傳圖譜構(gòu)建和QTL定位的研究相對較少,且多數(shù)蘭科植物遺傳組成雜合性高,遺傳背景復(fù)雜,許多重要觀賞性狀多為數(shù)量性狀基因所控制,易受環(huán)境條件的影響,一定程度上制約了蘭花分子標(biāo)記輔助育種的進程[6-7]。因此,本研究擬對有關(guān)蘭科植物遺傳圖譜的構(gòu)建與重要性狀的QTL定位的研究進展進行綜述,旨在為蘭科植物遺傳圖譜的加密、重要性狀的基因定位和分子標(biāo)記輔助育種等提供參考。

1 遺傳圖譜及相應(yīng)的分子標(biāo)記

遺傳圖譜是指以基因或遺傳標(biāo)記間重組頻率為基礎(chǔ)的染色體或基因位點的相對位置線性排列圖[8],通常以厘摩(Centi-morgan,cM)表示標(biāo)記間的距離[9]。1994年P(guān)eltier等[10]以矮牽牛構(gòu)建了第一張基于RAPD標(biāo)記和形態(tài)學(xué)標(biāo)記的花卉連鎖遺傳圖譜。早期研究主要通過擴增片段長度多態(tài)性(Amplification fragment lengthpolymorphism,AFLP)和隨機擴增多態(tài)性(Randomamplified polymorphic DNA,RAPD)等分子標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖譜,但所構(gòu)建的遺傳圖譜質(zhì)量較低,只能通過多個群體和多次作圖才能將圖譜加密;而微衛(wèi)星(Simple sequence repeat,SSR)標(biāo)記是一種共顯性標(biāo)記,廣泛應(yīng)用于不同的群體研究,但易受到標(biāo)記數(shù)量限制且標(biāo)記密度較低。隨著技術(shù)的發(fā)展,目前出現(xiàn)了單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP)標(biāo)記,它是在基因組水平上由單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性,變異類型和變異頻率豐富,其標(biāo)記的數(shù)量多且密度高,在染色體上的分布也很均勻[11]。當(dāng)前隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展和成本的不斷降低,SNP標(biāo)記已廣泛運用于高密度遺傳圖譜的構(gòu)建、重要性狀的QTL定位和基因挖掘等方面的研究[12-13]。

2 蘭科植物遺傳圖譜的構(gòu)建

2.1 親本組合

雜交組合親本的選擇對遺傳圖譜的構(gòu)建具有決定性意義,應(yīng)選擇親緣關(guān)系較遠、遺傳差異較大的親本進行雜交,以便獲得更多分離位點的F1代,進而提高圖譜密度。但雙親間的遺傳差異也不能太大,過大會抑制雜種染色體間的正常配對與重組,出現(xiàn)嚴重的偏分離現(xiàn)象,并造成雜種可育性下降或不育,影響所建圖譜的準(zhǔn)確性和可靠性;雙親間的遺傳差異也不能過小,太小則親本間多態(tài)性水平低,導(dǎo)致連鎖圖相對飽和度不高[5,14]。因此,親本選擇在遺傳差異性和雜種后代可育性都應(yīng)兼顧。從表1可以看出,所構(gòu)建的蘭科植物遺傳圖譜親本選擇均在品種或種間,其中蝴蝶蘭‘462’(Phalaenopsis‘462’)和蝴蝶蘭‘20’(P.‘20’)是蝴蝶蘭品種親本[15-16],臺灣白花蝴蝶蘭(P.aphrodite)和小蘭嶼蝴蝶蘭(P.equestris)是蝴蝶蘭種間親本[17],春石斛‘044’(DendrobiumLucky Gal)和春石斛‘051’(D.Fantasy)[18]、春石斛‘025’(D.Second Love)和春石斛‘028’(D.Sekand Rave)[19]均是春石斛品種親本,鐵皮石斛(D.officinale)和重唇石斛(D.hercoglossum)[20]、鐵皮石斛(D.officinale)和細莖石斛(D.moniliforme)[21]、鐵皮石斛(D.officinale)和鉤狀石斛(D.aduncum)[22]、金釵石斛(D.nobile)和細莖石斛(D.moniliforme)[23]、細莖石斛(D.moniliforme)和鐵皮石斛(D.officinale)[24-25]、金釵石斛(D.nobile)和大包鞘石斛(D.wardianum)[26]均是石斛種間親本,秋石斛‘0942’(D.‘0942’)和秋石斛‘32’(D.‘32’)[27]、秋石斛‘紫色火焰’(D.Mangosteen)和秋石斛‘粉紅2號’(D.Burana Pink No.2)[28]均是秋石斛品種親本,而大花蕙蘭‘玉女蘭’(Cymbidium‘Yunv’)和墨蘭‘黃葉紅花’(C.sinense‘Huangyehong’)[29]是蘭屬(Cymbidium)不同種間親本。

2.2 作圖群體

包括蘭科植物在內(nèi)的觀賞植物由于遺傳背景較復(fù)雜、雜合性高和世代周期長等特點,作圖群體的構(gòu)建比較困難。而擬測交或雙假測交(Two-way pseudo-testcross)理論[30]的提出使得高度雜合的親本之間雜交獲得的F1群體也能夠構(gòu)建遺傳圖譜。蘭花的種子極為細小,呈粉末狀,由種胚和種皮構(gòu)成,不含貯存組織胚乳,缺乏營養(yǎng)物質(zhì),在自然條件下很難萌發(fā)[31],只能通過人工授粉雜交的方式獲得種子并采用組織培養(yǎng)無菌播種的方法繁殖種苗[32-33],從而獲得雜種F1代,即作圖群體。遺傳圖譜的精度是由作圖群體的大小所決定。當(dāng)構(gòu)建的群體越小,則遺傳圖譜精度越低且圖距越大,基因定位時很難檢測到重組事件,并引起標(biāo)記偏分離現(xiàn)象的產(chǎn)生;當(dāng)作圖群體越大,則遺傳圖譜精度越高且圖距越小,有利于緊密連鎖位點的區(qū)分,但作圖費用和工作量增大。因此,構(gòu)建蘭花遺傳圖譜時,應(yīng)根據(jù)親本的遺傳差異、群體分離情況、標(biāo)記類型以及作圖目標(biāo)等確定作圖群體大小,但從已有的蘭科植物作圖群體來看,群體的數(shù)量在88～190株之間(表1),與林木的遺傳圖譜基本一致[34]。

2.3 作圖軟件

在構(gòu)建遺傳圖譜的過程中需要利用相關(guān)的計算機軟件進行作圖處理。作圖的算法大多采用Allard的計算公式和表格法[35],目前主要的作圖軟件有Mapmaker[36-37]、JionMap[38]和HighMap[39]等。其中,Mapmaker軟件應(yīng)用最為廣泛,但缺乏對原始數(shù)據(jù)的檢查與分析,無法得到連鎖圖圖型文件,影響作圖的精度,而MapDraw很大程度上彌補了Mapmaker在繪圖方面的不足[40];JionMap軟件操作簡便,功能強大,可用于標(biāo)記數(shù)量較多的遺傳圖譜的構(gòu)建,主要適用于F2、BC、RIL、DH和CP等類型的分離群體[40];HighMap軟件能夠處理更多、甚至上萬的標(biāo)記進行構(gòu)圖,主要包括連鎖分群、標(biāo)記排序、基因型糾錯和圖譜評估等部分,是基于高通量測序構(gòu)建高密度遺傳圖譜的理想軟件[24],其運算速度、標(biāo)記的排序和圖譜質(zhì)量等方面遠勝其他作圖軟件。從已構(gòu)建的蘭科植物遺傳圖譜來看,2007—2017年其作圖軟件主要采用Mapmaker 3.0和Mapdraw 2.1、JoinMap 3.0和JoinMap 4.0,相對應(yīng)的分子標(biāo)記主要是SRAP、ISSR、RAPD、EST-SSR和SSR等,而2018—2022年主要采用HighMap軟件,相對應(yīng)的分子標(biāo)記是SNP,表明蘭科植物作圖精度越來越高(表1)。

3 蘭科植物遺傳圖譜研究現(xiàn)狀

蘭科植物遺傳圖譜的研究較晚。2007年黃少玲[18]以春石斛‘044’(D.Lucky Gal)ב051’(D.Fantsy)的90株F1代個體作為作圖群體,利用RAPD標(biāo)記構(gòu)建了國內(nèi)外第一張?zhí)m科春石斛遺傳圖譜,該圖譜產(chǎn)生了121個RAPD標(biāo)記,分布于9個連鎖群上,覆蓋基因組總長度為6 568.7 cM,平均圖距為50.11 cM,為蘭科遺傳圖譜構(gòu)建提供了基礎(chǔ)。但該圖譜標(biāo)記較少,圖距較大,不能用于后續(xù)QTL定位研究。為了構(gòu)建更好的石斛遺傳圖譜,Xue等[20]、趙紅燕[21]和Feng等[23]增加了標(biāo)記類型,趙丹[19]、Lu等[22]、任羽[27]和潘宏兵[28]不但增多了標(biāo)記類型還擴大了作圖群體,他們所構(gòu)建石斛圖譜的圖距相對于黃少玲[18]的較小,精度有所提高,但仍然存在標(biāo)記較少,圖距較大,飽和度不高的問題(表1)。為了構(gòu)建更高密度的石斛遺傳圖譜,2018年劉玉洋[24]及Lu等[25]以細莖石斛(D.moniliforme)作為母本,鐵皮石斛(D.officinale)作為父本構(gòu)建了111株F1代的作圖群體,利用SLAF-seq技術(shù)對石斛雙親及其雜交后代進行簡化基因組高通量測序,開發(fā)了大量石斛全基因組多態(tài)性SNP標(biāo)記,繪制了第一張石斛高密度遺傳圖譜。該圖譜包含8 573個SNP標(biāo)記,分布于19條連鎖群,總圖距為2 737.49 cM,平均圖距為0.32 cM。2019年Li等[26]利用石斛(D.noble)×大苞鞘石斛(D.wardianum)的100株個體的F1群體進行作圖,采用RNA測序(RNA-seq)技術(shù)進行高通量測序,繪制了另一張石斛高密度遺傳圖譜,該圖譜包含9 645個SNP標(biāo)記,同樣分布于19個連鎖群,總長度為3 612.12 cM,平均標(biāo)記間隔為0.41 cM。

除石斛外,在蘭屬和蝴蝶蘭方面也構(gòu)建了遺傳圖譜。陳起馨[29]以大花蕙蘭‘玉女蘭’(Cymbidium‘Yunv’)×墨蘭‘黃葉紅花’(C.sinense‘Huangyehong’)的F1群體94個個體為作圖群體,利用SSR標(biāo)記從墨蘭轉(zhuǎn)錄組和大花蕙蘭轉(zhuǎn)錄組中獲得78個SSR標(biāo)記,采用Mapmaker/EXP 3.0作圖軟件構(gòu)建出包含13個連鎖群和56個SSR標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜,總圖距為1 608.90 cM,平均圖距為32.15 cM,構(gòu)建了第一張?zhí)m屬SSR分子標(biāo)記遺傳圖譜。許申平[15]及Xu等[16]報道了第一張蝴蝶蘭遺傳連鎖圖譜,利用AFLP標(biāo)記對蝴蝶蘭‘462’×蝴蝶蘭‘20’的88個F1個體植株進行連鎖作圖,其中蝴蝶蘭‘462’連鎖圖產(chǎn)生了175個AFLP標(biāo)記,分布于14個連鎖群,總圖距為878.3 cM,平均圖距為5.0 cM;蝴蝶蘭‘20’連鎖圖產(chǎn)生了122個AFLP標(biāo)記,分布于15個連鎖群,總圖距為820.3 cM,平均圖距為6.7 cM。陳起馨[29]構(gòu)建的蘭屬遺傳圖譜圖距較大,而Xu等[16]構(gòu)建的蝴蝶蘭圖譜飽和度不高,與劉玉洋[24]和Li等[26]采用SNP標(biāo)記構(gòu)建的高密度石斛遺傳圖譜相比,還需要更多的標(biāo)記和更大的群體來構(gòu)建更全面的遺傳圖譜。因此,2022年Hsu等[17]利用臺灣白花蝴蝶蘭(P.aphrodite)×小蘭嶼蝴蝶蘭(P.equestris)的117株F1群體進行作圖,采用全基因組測序技術(shù)(GWAS)進行高通量測序,繪制了第一張蝴蝶蘭高密度遺傳圖譜。該圖譜包含113 517個SNP標(biāo)記,分布于27個連鎖群,總長度為15 192.05 cM,平均圖距為0.13 cM(表1)。

4 蘭科植物重要性狀的QTL定位

4.1 葉片相關(guān)性狀的QTL定位

葉片是綠色植物積累有機物質(zhì)的重要場所,對植株的生長發(fā)育具有十分重要的作用。據(jù)報道蝴蝶蘭葉長與葉面積具有很高的相關(guān)性,其開花率與葉面積呈正相關(guān)[41-42]。在葉片相關(guān)性狀的基因定位方面,許申平等[43]以蝴蝶蘭雜交組合P.‘462’×P.‘20’后代為材料,對88個單株F1的葉長、葉寬和株幅3個性狀進行了初步的QTL定位研究(表2)。結(jié)果表明,在父本中共檢測到60個QTL,分布于8個連鎖群上,包括控制葉長性狀的20個QTL,控制葉寬性狀19個QTL,控制株幅性狀21個QTL;在母本中共檢測到28個QTL,分布于5個連鎖群上,包括控制葉長性狀10個QTL,控制葉寬性狀8個QTL,控制株幅性狀10個QTL;且統(tǒng)計分析表明蝴蝶蘭葉長與株幅間具有顯著相關(guān)性,2個性狀調(diào)控基因位點在MLG-1、MLG-2、MLG-3、MLG-8、MLG-9、FLG-3和FLG-6連鎖群上都有QTL重疊現(xiàn)象,呈現(xiàn)出同一或相近連鎖群的現(xiàn)象,即性狀相關(guān)度高的QTL大多聚集在同一連鎖群的相近或相同區(qū)域內(nèi),而且具有相關(guān)功能的基因成簇分布的現(xiàn)象[44-46]。這是蝴蝶蘭的首個QTL研究,為今后蝴蝶蘭基因克隆與分子標(biāo)記輔助育種等提供依據(jù)。

表2 蘭科植物相關(guān)性狀QTL定位Table 2 QTL mapping for related characters in Orchidaceae

4.2 花色相關(guān)性狀的QTL定位

花色是蘭科植物重要的觀賞性狀之一[47]。花色調(diào)控是一個復(fù)雜的過程,影響花色的因素很多：植物品種[48]、糖轉(zhuǎn)運[49]、環(huán)境應(yīng)激[50]、逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子激活[51]、類胡蘿卜素和花青素生物合成途徑[52]以及調(diào)控基因如MYB家族[53]和MADS-box家族[54]等。Hsu等[17]在對NCBI nr數(shù)據(jù)庫進行BLAST搜索后,從10個QTL中鑒定出唇瓣黃色(LipYel)、唇瓣紅色(LipMag)、花瓣紅色(PetalMag)和花瓣紅色區(qū)(PetalMagArea)等4個不同顏色相關(guān)性狀的35個候選基因。其中,6個QTL中的26個候選基因與3個不同性狀的PetalMagArea、PetalMag和LipMag相關(guān),這些基因分別包括與PetalMagArea性狀顯著相關(guān)的SNP S2_195281745和S5_43813578周圍的MYB52基因和MYB11啟動子區(qū)。MYB家族中的不同基因具有通過調(diào)節(jié)花青素生物合成來確定紅色花部組織的功能。并在S2_195281745、S5_45647571和S5_45345022 的QTL中分別鑒定了MADS-box家族基因AGL65、MADS5和MADS4,這些基因可能不僅調(diào)節(jié)花形態(tài)發(fā)生,而且參與花青素生物合成途徑。同時,位于LipYel性狀的4個QTL中的9個候選基因包括黃酮3-羥化酶(F3H)基因和磺基喹諾糖基轉(zhuǎn)移酶SQD-2基因,以及在PetalMag性狀的QTL S5_45647571中也發(fā)現(xiàn)了F3H的一個短片段。因此,F3H可能參與蝴蝶蘭紅色和黃色的調(diào)控。這是蝴蝶蘭遺傳圖譜和花色相關(guān)QTL的首次報道。

4.3 花朵萼片相關(guān)性狀的QTL定位

花朵數(shù)量遺傳學(xué)研究揭示了自然選擇是如何在數(shù)量性狀QTL位點上運作[55-57]。任羽等[58]對石斛蘭花萼相關(guān)的4個性狀(中萼片長、中萼片寬、側(cè)萼片長和側(cè)萼片寬)進行了QTL定位,在母本的遺傳連鎖圖譜上檢測到9個QTL,其中中萼片長1個、中萼片寬3個、側(cè)萼片長2個和側(cè)萼片寬3個,獲得緊密連鎖的標(biāo)記2個(M10E3-146和M8E8-284);在父本的遺傳連鎖圖譜上檢測到6個QTL位點,其中中萼片長2個、中萼片寬1個、側(cè)萼片長2個和側(cè)萼片寬1個。同時還發(fā)現(xiàn)4個性狀之間在連鎖群存在共區(qū)域的現(xiàn)象,在母本圖譜上檢測到的側(cè)萼片寬Lsw3位點與中萼片長Dsl位點和側(cè)萼片長Lsl2位點位于相鄰區(qū)段;中萼片長Dsl位點和側(cè)萼片長Lsl2位點在16連鎖群上位于R6R10-1121-M10E5-96同一區(qū)段內(nèi);在父本圖譜上檢測到的中萼片長的2個位點和側(cè)萼片長的2個位點都位于同一區(qū)段內(nèi)。這與已經(jīng)報道的花器官大小QTL的共區(qū)域現(xiàn)象是一致的[59-61]。

4.4 石斛莖及多糖相關(guān)性狀的QTL定位

石斛的莖是石斛主要藥用和食用部位。Li等[26]利用高密度遺傳圖譜鑒定了3個與莖長和莖粗相關(guān)的eQTL(Expression quantitative trait locus,一類能夠影響基因表達量的遺傳位點),其中2個eQTL與莖長相關(guān),分別位于LG3和LG19上,共有33個標(biāo)記;另一個eQTL與LG13的莖粗相關(guān)。這3個eQTL分布在不同的連鎖群上,每個eQTL解釋的表型變異在11.74%～19.85%。劉玉洋[24]及Lu等[25]利用構(gòu)建的高密度遺傳圖譜檢測到11個與石斛莖總多糖含量(STPC)相關(guān)的QTL,表型貢獻率在8.10%～11.80%,平均貢獻率為9.15%,其中STPC-9表型貢獻率最高,是主效QTL。11個QTL分別位于6個連鎖群上,其中LG2連鎖群上有4個,LG15和LG19連鎖群上分別有2個,LG5、LG11和LG13連鎖群上分別有1個。石斛莖及多糖含量STPC相關(guān)的QTL定位,為以后石斛堿、黃酮和酚類等石斛重要活性成分相關(guān)的QTL定位奠定了基礎(chǔ)。

5 展 望

目前已構(gòu)建的蘭科植物遺傳圖譜,總圖距越來越高且相鄰分子標(biāo)記間的平均圖距越來越小,為圖譜的實際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ),但作圖群體較小始終是個問題。在構(gòu)建遺傳圖譜時,為了能夠檢測到減數(shù)分裂時的重組事件,需要一定數(shù)量的群體。徐云碧等[62]認為構(gòu)建圖譜的理論群體數(shù)量應(yīng)>150個,當(dāng)需要檢測到的重組率達到0.3時,則群體數(shù)量至少需300個[63-64]。目前已構(gòu)建的蘭科植物遺傳圖譜群體數(shù)量在88～190之間,其中<150的有11個,<300 有2個。一般認為標(biāo)記間的平均距離<10 cM,則圖譜能夠用于QTL定位;而標(biāo)記間的平均圖距<1 cM,則圖譜能夠用于基因精細定位或基因克隆[65]。當(dāng)前已構(gòu)建的13個蘭科植物遺傳圖譜,其中7個可以用于QTL定位,僅有3張圖譜可用于精細定位或基因克隆,分別是春石斛[24-26]和蝴蝶蘭[17]。在重要性狀的QTL定位方面,雖然在蝴蝶蘭葉片、花色,石斛蘭萼片大小及石斛莖及多糖含量等相關(guān)性狀進行了基因定位,但還有很多性狀如花朵大小、花朵數(shù)、花香、花型、花斑和抗寒耐熱性等方面均未涉及。因此,基于已構(gòu)建的蘭科植物遺傳圖譜,今后應(yīng)加強以下3個方面的科研工作：1)已構(gòu)建的作圖群體偏小,大部分群體數(shù)量小于150個,為構(gòu)建更飽和及分布更均勻的遺傳圖譜,必須擴大作圖群體,才能夠滿足蘭科植物的深入研究;2)已構(gòu)建的遺傳圖譜標(biāo)記間的平均距離多數(shù)較大,且均勻性不夠好,給基因定位、基因克隆和分子標(biāo)記輔助育種等帶來較大困難,應(yīng)完善圖譜,使其更加飽和;3)觀賞價值高的性狀,如花數(shù)、花香和花型等方面應(yīng)深入研究,結(jié)合遺傳圖譜加快育種進程。