秦 梅 湯新明 龔玉姣 史芳蕓 王 思 索 勛*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學 科學技術發(fā)展研究院/中國農(nóng)業(yè)大學學報編輯部,北京 100193;2.中國農(nóng)業(yè)科學院 北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193;3.中國農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院,北京 100193)

球蟲病是世界范圍內(nèi)畜禽的主要傳染病之一,是由艾美耳屬球蟲(Eimeria)中的一種或多種寄生原蟲感染引起的疾病,具有較高的發(fā)病率和死亡率。在畜牧生產(chǎn)中,以雞球蟲病危害最甚,每年給養(yǎng)雞業(yè)帶來超過100億英鎊的損失[1]。抗球蟲藥的大規(guī)模使用可有效控制球蟲病的暴發(fā)和流行,保障養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展。然而,耐藥蟲株的出現(xiàn)、藥物殘留和食品安全等問題越來越引起人們的關注,高效球蟲病疫苗將成為球蟲病防控的主力。目前,商品化的雞球蟲病疫苗主要為活卵囊疫苗[2-3],該疫苗可激發(fā)宿主產(chǎn)生高效且持久的保護性免疫應答[4-11]。但是由于活卵囊疫苗存在一定致病性、貨架期短和生產(chǎn)成本高等缺點[12],亞單位或基因工程疫苗繼而成為球蟲病疫苗研究領域的熱點。研究表明,重組蛋白、DNA疫苗或活載體疫苗等均能激發(fā)宿主產(chǎn)生一定的免疫應答,卻達不到活卵囊疫苗的免疫保護效果。高效保護記憶性免疫應答是球蟲病病原感染宿主和球蟲病疫苗設計的基礎。球蟲活卵囊疫苗與球蟲重組蛋白疫苗、DNA疫苗、活載體疫苗激發(fā)免疫應答的本質(zhì)區(qū)別是什么?如何激發(fā)宿主產(chǎn)生高效保護記憶性免疫應答?這一科學問題的深入思考及解析對球蟲病疫苗的研發(fā)具有很重要的指導意義。因此,本研究重點從免疫學角度解析球蟲感染后產(chǎn)生保護性記憶免疫應答的機制并提出在新型球蟲疫苗設計中誘導產(chǎn)生保護記憶性免疫應答的可行策略及評價疫苗效果的新思路,為開發(fā)高效的球蟲病疫苗提供科學依據(jù)。

1 球蟲感染的獲得性免疫應答

1.1 體液免疫應答

艾美耳球蟲感染激發(fā)宿主產(chǎn)生球蟲特異的IgM、IgG和IgA抗體[13-14],其在保護性免疫應答中的作用尚存在爭議。有研究表明,抗體在宿主抗球蟲感染中作用很小[9,15-16],如切除法氏囊的雞群可以抵抗小劑量50或500個柔嫩艾美耳球蟲感染[17]。也有研究認為抗體在免疫保護中起著很重要的作用[18-21],如雞群通過口服、靜脈注射或皮下注射免疫活卵囊球蟲疫苗后,在高峰期激發(fā)產(chǎn)生的IgG 抗體可以提供97%的免疫保護[22],將免疫過活卵囊球蟲疫苗雞群的卵黃抗體轉(zhuǎn)移給未免疫過的雞群后可以產(chǎn)生100%免疫保護[10,23]。

艾美耳球蟲編碼約8 600個蛋白質(zhì),基因組大小約為50～60 Mb[2,24]。免疫蛋白質(zhì)組學研究顯示,在656個蛋白質(zhì)中,有101個蛋白質(zhì)被柔嫩艾美耳球蟲感染雞群的特異性血清識別[24],表明艾美耳球蟲感染后激發(fā)的體液免疫應答具有復雜性。以上數(shù)據(jù)揭示抗體在球蟲感染中也發(fā)揮重要作用,但不能確定是直接作用還是間接作用,有關特異性抗體是否介導球蟲抗原交叉遞呈尚需要進一步研究,解析這一現(xiàn)象,將對免疫學領域乃至生物學領域有關免疫功能或更大的生物學功能冗余和疊加機制有更加深入的理解,是具有重要科學價值的研究方向。

1.2 細胞免疫應答

T細胞介導的細胞免疫應答在宿主抗球蟲感染中占主導地位。研究發(fā)現(xiàn),CD4+αβ T細胞在初次感染中起著重要的作用,但對再次感染的記憶免疫應答作用不是很明顯[16,25]。然而,蠕型艾美耳球蟲(E.vermiformis)感染MHC II CD4+T細胞缺陷的小鼠可激發(fā)產(chǎn)生95%的免疫保護[16,25]。

CD8+T 細胞的細胞毒性(CTL)途徑在球蟲感染中發(fā)揮重要作用。CD8+CTLs通過釋放溶胞顆粒物—顆粒酶蛋白酶、穿孔素和抗菌肽顆粒溶素殺滅人類胞內(nèi)病原如克氏錐蟲(Trypanosomacruzi)、剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)和利什曼原蟲(Leishmania)等[26]。CD8+T細胞在抵抗球蟲初次感染中的作用不是必需的,但在再次感染中更重要[11,23]。研究表明,雞感染柔嫩艾美耳球蟲后,盲腸組織中的穿孔素、顆粒酶A和FasL mRNA 表達量在初次感染后10 d和再次感染后的1～4 d均顯著增加[27-28]。

除了IFN-γ介導的Th1細胞反應是雞球蟲病的主要免疫反應,Th17和調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)在雞球蟲病的腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面也發(fā)揮著重要作用[5]。IL-17是Th17細胞免疫應答的標志,在球蟲感染中具有促炎作用,但作用機制尚不清楚。雞的CD4+CD25+T細胞被認為是Treg細胞,可通過產(chǎn)生大量的IL-10、TGF-β、CTLA-4和LAG-3抑制激活的免疫細胞[29]。研究表明,Treg細胞對艾美耳球蟲感染后激發(fā)產(chǎn)生的保護性免疫反應的調(diào)節(jié)很關鍵,其分泌的IL-10在雞球蟲感染中發(fā)揮著重要作用[5]。Treg細胞還可通過抑制誘導組織發(fā)生炎性反應的Th17細胞減輕艾美耳球蟲感染導致的腸道病理變化[5]。

艾美耳球蟲感染宿主后激發(fā)產(chǎn)生的免疫應答是多方面的,尤其在再次感染中,多種效應機制協(xié)同發(fā)揮作用,有效控制艾美耳球蟲的入侵、發(fā)育、復制和逃避,共同降低疾病的嚴重程度[16,23,30]。因此,設計或開發(fā)一種可產(chǎn)生多種協(xié)同效應的保護性免疫應答的高效抗球蟲病疫苗至為關鍵。

2 球蟲感染的高效保護性免疫應答的效應機制

免疫反應的最主要特征是識別自身和非自身,以及免疫記憶。無論是細胞免疫還是體液免疫,免疫記憶是任何疫苗研發(fā)工作的基礎[31]。免疫記憶也是疫苗產(chǎn)生高效保護性免疫應答的基礎。多項研究表明,被球蟲感染過的雞群可以在短時間內(nèi)產(chǎn)生高效免疫反應,抑制球蟲的早期發(fā)育[32-35],并進一步揭示出球蟲病活卵囊疫苗的腸道保護性免疫應答機制[4-5,11,36-37]。不同類型球蟲病疫苗激發(fā)產(chǎn)生的保護性免疫應答機制模擬圖如圖1所示。

2.1 多種效應因子共同協(xié)作參與保護性記憶免疫應答

在球蟲感染中,與未感染的宿主相比,被球蟲感染過的宿主在短時間內(nèi)即可迅速產(chǎn)生大量的免疫效應因子[15,23,38-40],有利于抑制球蟲子孢子的早期發(fā)育[41-42]。早期研究表明,雞群再次感染巨型艾美耳球蟲與初次感染巨型艾美耳球蟲相比,在再次感染的早期,外周血中的中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞數(shù)量顯著增多,這些先天性免疫細胞在抵抗球蟲再次感染的早期發(fā)揮重要作用[43]。

細胞因子在激發(fā)和維持記憶性T細胞的免疫功能過程中也發(fā)揮著至關重要的作用[31]。如 IFN-γ 通過IL-15維持記憶性CD8+T細胞免疫應答,CD4+T細胞需要IL-12的刺激分化為功能性Th1型細胞[31]。在未感染的宿主早期階段,只有NK細胞、ILC1(Group 1 innate lymphoid cell)、巨噬細胞或樹突狀細胞分泌一定量的IFN-γ,遠遠不足以抑制初次感染球蟲后子孢子進入裂殖生殖。在艾美耳球蟲初次感染中,IFN-γ是調(diào)節(jié)Th1型保護性免疫應答過程中很重要的免疫效應因子[5]。IL-17A 在球蟲感染中上調(diào)表達,參與球蟲子孢子和裂殖體的成熟和遷移,IL-17A中和抗體處理雞群后,裂殖體體積縮小4.3倍,裂殖子的數(shù)量減少11倍[44]。

(a)Naive免疫狀態(tài)：亞單位疫苗和DNA疫苗免疫雞群后,腸道對雞球蟲的再次感染需經(jīng)較長時間產(chǎn)生保護性免疫應答,參與免疫反應的免疫因子包括NK細胞、ILC1、巨噬細胞、樹突狀細胞和IFN-γ等,不足以抑制球蟲子孢子入侵腸道后進入第一代裂殖生殖。(b)Primed免疫狀態(tài)：活卵囊疫苗免疫后的雞群誘導產(chǎn)生的記憶保護性免疫應答可抑制球蟲子孢子的早期發(fā)育。雞球蟲特異性抗體可以在先天性免疫效應細胞和補體的作用下中和、調(diào)理和溶解入侵宿主細胞前的球蟲子孢子;子孢子抗原激活腸道DC細胞,招募在腸道微環(huán)境中長期存在的組織常駐記憶細胞(TRM)、循環(huán)的效應記憶細胞(TEM)和中心記憶性T細胞(TCM),均以更快的方式參與艾美耳球蟲的早期防御中,記憶性T細胞會迅速產(chǎn)生IFN-γ,初次免疫產(chǎn)生的CD4+T細胞會更好地維持記憶性CD8+T細胞,這樣多種效應免疫因子協(xié)調(diào)作用,共同抑制球蟲子孢子在腸道上皮或隱窩中發(fā)育成第一代裂殖體,進而抵抗球蟲的再次感染,產(chǎn)生完全保護。(a) In naive chickens,after immunizing chickens with subunit vaccine and DNA vaccine,intestinal reinfection of chicken coccidia requires a long time to generate protective immune response.Limited involvers,including NK cells,ILC1,macrophages,dendritic cells and IFN-γ,cannot suppress the schizogony of numerous sporozoites,thus may first generation of schizonts are present.(b) In primed chickens,the memory protective immune response induced by chickens immunized with live oocysts vaccine can inhibit the early development of sporozoites.First,the specific antibody of chicken coccidia can neutralize,opsonize and lysis the sporozoites before invading host cells with the help of innate immune effector cells and complements.Second and most importantly,the sporozoite antigen activates intestinal D cells,recruits tissue resident memory cells (TRM),circulating effector memory cells (TEM) and central memory T cells (TCM) that exits in the intestinal microenvironment for a long time,and all participate in the early defense of Eimeria in a faster manner.The memory T cells will rapidly produce IFN-γ.The CD4+T cells produced by the initial immunization will better maintain the memory CD8+T cells.Such multiple effective immune factors work in concert to jointly inhibit the development of the first generation schizonts of sporozoites in the intestinal epithelium or crypt,thus resisting the reinfection of coccidia and generating complete protection.圖1 不同種類的球蟲病疫苗激發(fā)產(chǎn)生的保護性免疫應答機制模擬圖Fig.1 Diagram of protective immune responses to anticoccidial infection after immunization with different type of coccidian vaccines

在腸道微環(huán)境中長期存在的組織常駐記憶細胞(Tissue-resident memory T cells,TRM)在遇到同源抗原或病原時可迅速增殖[45-46]。循環(huán)的效應記憶細胞(Effector memory T cells,TEM)被招募至發(fā)生炎性反應的組織中。中心記憶性T細胞(Central memory T cells,TCM)會迅速參與艾美耳球蟲的早期防御。通過靜脈注射CD4或CD8單克隆抗體處理的小鼠初次感染E.vermiformis后,對再次感染時激發(fā)產(chǎn)生的記憶性免疫應答幾乎沒有影響[23],這表明相對于TEM和TCM細胞,更有利于產(chǎn)生保護性免疫應答的TRM很難被注射的抗體完全清除,少量的TRM可以迅速增殖抵抗球蟲的再次感染[47]。CD4+T細胞對記憶性CD8 T細胞的產(chǎn)生和維持具有重要作用[48-49]。E.pragensis初次感染小鼠時,與用CD8單克隆抗體處理小鼠相比,CD4單克隆抗體處理的小鼠對再次感染極度敏感[23]。αβ T 細胞在球蟲初次感染和再次感染中均起重要作用。用TGD(Targeted gene disruption)處理的小鼠對鐮形艾美耳球蟲(E.falciformis)的初次感染和再次感染極度敏感[16,50]。與αβ T細胞相同,γδ T細胞具有長時間記憶能力,并能迅速擴增和產(chǎn)生IFN-γ[51]。此外,γδ T細胞不受MHC限制,更有助于抵抗艾美耳球蟲感染。研究表明,抗原量和細胞因子是調(diào)節(jié)T細胞記憶應答產(chǎn)生、維持和發(fā)揮效應功能過程中的兩大關鍵因素,還有助于記憶性T細胞向效應記憶細胞的轉(zhuǎn)換[31]。

2.2 抑制球蟲早期發(fā)育是產(chǎn)生保護性記憶免疫應答的重要特征

球蟲早期內(nèi)源性發(fā)育對產(chǎn)生保護性記憶免疫應答至關重要[52]。在球蟲早期發(fā)育中,子孢子完全保護性抗原被免疫細胞遞呈出來,這類早期抗原是研發(fā)亞單位或重組疫苗的靶標抗原。球蟲特異性抗體在先天性免疫效應細胞和補體的作用下中和、調(diào)理和溶解入侵宿主細胞的球蟲子孢子[13,34,53-54],球蟲特異性的抗體可以將入侵腸道的球蟲子孢子數(shù)量減少50%[34-35]。當次級淋巴器官中的一些記憶性B細胞遇到相同抗原后,可迅速分化為高親和力的漿細胞,迅速增強清除病原的效率和效果,而不需要像初次感染時經(jīng)歷長時間的體細胞超突變和親和力成熟,降低免疫應答的效果[55]。這也證實了球蟲特異性抗體在球蟲感染中具有減少子孢子數(shù)量且發(fā)揮記憶保護性應答的作用。

在球蟲子孢子發(fā)育的早期階段,除布氏艾美耳球蟲和早熟艾美耳球蟲子孢子在入侵處發(fā)育外,其他5種艾美耳球蟲子孢子則轉(zhuǎn)移到隱窩上皮處發(fā)育。細胞記憶性免疫應答可抑制球蟲子孢子從腸道上皮細胞到腸隱窩細胞的移行。初次感染巨型艾美耳球蟲的雞群會阻止60%的球蟲子孢子自腸道固有層上皮內(nèi)細胞或巨噬細胞轉(zhuǎn)運到腸隱窩細胞發(fā)育為第一代裂殖體[56]。球蟲的寄生部位不同也會產(chǎn)生不同的記憶性免疫反應。巨型艾美耳球蟲的寄生部位小腸除了含有淋巴濾泡還有Peyer’s 結(jié)。小腸這種獨特的微環(huán)境與大腸相比會形成一群更高效的記憶性免疫細胞。無論子孢子從腸上皮細胞到隱窩的移行是否受到抑制,初次感染過的宿主都會抑制裂殖生殖。球蟲再次感染48或60 h后,只有少數(shù)子孢子發(fā)育成第一代裂殖體,而且大多數(shù)子孢子在初次感染的宿主體內(nèi)發(fā)育達不到滋養(yǎng)體階段[32,35-56]。

3 當前球蟲疫苗的研發(fā)現(xiàn)狀與存在問題

目前獲得許可的疫苗如滅活疫苗、重組亞單位疫苗、DNA疫苗等絕大多數(shù)均以激發(fā)宿主產(chǎn)生體液免疫應答為主,共同點是相對安全,但是激發(fā)宿主產(chǎn)生細胞免疫應答的能力較低。這些疫苗與球蟲病活卵囊疫苗相比,在激發(fā)保護性記憶免疫應答方面存在本質(zhì)區(qū)別,因而限制了其在預防以細胞免疫應答為主的病原引發(fā)疾病中的廣泛應用。

3.1 球蟲病活卵囊疫苗

首個球蟲病活卵囊疫苗(Coccivac?;Schering-Plough,Union,NJ)于20世紀50年代初在美國上市[57]。研發(fā)原理是基于雞群在初次感染后激發(fā)產(chǎn)生保護性記憶免疫應答并可經(jīng)再次感染免疫保護力大大增強[58]。目前在全球范圍內(nèi),商業(yè)化生產(chǎn)的至少有10種不同的活卵囊球蟲病疫苗,區(qū)別在于艾美耳球蟲的種類(野生蟲株或減弱蟲株)、疫苗中蟲株的組合和免疫途徑。減毒球蟲病活卵囊疫苗免疫雞群不僅可以產(chǎn)生持久性抗原,還可以誘導MHCI類抗原呈遞且刺激CD8+T細胞保護性免疫反應,對雞群的生產(chǎn)性能影響較小。其缺點是貨架期短,生產(chǎn)成本較高。出于疫苗安全性、成本及免疫范圍的考慮,目前亞單位疫苗、DNA疫苗和活載體疫苗替代球蟲病活卵囊疫苗是研究的重要方向。

3.2 亞單位疫苗

球蟲病亞單位疫苗CoxAbic?是純化的親和配子體抗原(Affinity-purified gametocyte antigens,APGA,含有Gam56、Gam82和其他大豆凝集素結(jié)合蛋白)和弗氏佐劑乳化而成,通過肌肉注射免疫蛋雞。產(chǎn)生針對APGA特異性的母源抗體轉(zhuǎn)移給子代,減輕球蟲感染子代后的危害,接種該疫苗的子代卵囊排出可減少45%～80%[59]。保護性母源抗體可在母體內(nèi)維持至少4個月,在子代體內(nèi)最高可達3周[60]。

研究表明,分別融合表達Toll樣受體5配體或鞭毛素FliC和柔嫩艾美耳球蟲IMP1(EtIMPI)的重組亞單位疫苗經(jīng)2次免疫雞群,其可誘導產(chǎn)生較強的分泌IFN-γ的T細胞記憶性免疫應答,并減少88%的球蟲卵囊排出[61]。但是,此項研究檢測的是免疫后雞群外周血中T細胞免疫應答,至于腸道上皮細胞是否可產(chǎn)生保護性記憶免疫應答完全阻止球蟲卵囊的排出尚不清楚。另外,大腸桿菌表達的重組抗原破壞了原有的蛋白結(jié)構(gòu)和蛋白的親和性。因此,很多重組的球蟲亞單位疫苗并沒有完全激發(fā)宿主產(chǎn)生保護性免疫應答,降低了疫苗的保護效率,這與缺少球蟲特異性的腸道CD8+TRM細胞密切相關[62]。

3.3 DNA疫苗

編碼艾美耳球蟲抗原的DNA疫苗也是球蟲病疫苗研究的熱點,其優(yōu)勢在于可以同時激發(fā)體液和細胞免疫應答,通過融合免疫佐劑增強抗原的免疫原性或?qū)NA疫苗與其他疫苗聯(lián)合免疫是DNA疫苗中常用的策略。如編碼巨型艾美耳球蟲ROMs的DNA疫苗可以激發(fā)宿主產(chǎn)生較強的體液和細胞免疫應答,不僅顯著提高脾臟中CD4+/CD3+和CD8+/CD3+淋巴細胞的數(shù)量,還可提高IFN-γ、IL-2 和IL-17的表達量,并減少76%的卵囊排出[63]。很多真核表達載體、球蟲的免疫性抗原和免疫輔助分子的不同組合在DNA疫苗基礎研究中取得了一些進展。含有非甲基化CpG基序的短ODN已被證明是哺乳動物模型中可激發(fā)先天性免疫應答和適應性免疫應答的免疫保護劑[64]。如在載體骨架中加入CpG基序可以通過Toll樣受體9的配體激活DC細胞,誘導細胞毒性T細胞和分泌IFN-γ的T細胞分化,可減少42%～76%球蟲卵囊排出[65]。在球蟲病DNA疫苗研發(fā)中,高效的免疫佐劑表達同一抗原的異源性的Prime-Boost免疫策略以及將記憶性T細胞招募至腸道部位產(chǎn)生高效的記憶性免疫應答的策略[66],均是DNA疫苗在設計中需要重點考慮的。

3.4 病毒和細菌載體疫苗

基于病毒、細菌和真菌為載體表達球蟲抗原的活載體疫苗研究已取得了很大進展,但均未商業(yè)化。表達柔嫩艾美耳球蟲棒狀體蛋白的雞痘病毒活載體疫苗皮下免疫后只是激發(fā)宿主產(chǎn)生部分保護,降低39.6%～41.7%的卵囊排出[67]。表達源于柔嫩艾美耳球蟲TLR激動劑的轉(zhuǎn)基因腺病毒活載體疫苗激發(fā)宿主產(chǎn)生高效的先天性免疫應答和很強的腸道CD8+TRM細胞免疫應答[43],提示腺病毒載體可能是球蟲疫苗研發(fā)中很有潛力的候選載體。雞痘病毒載體和腺病毒載體最大的區(qū)別是后者可以在宿主腸道內(nèi)復制,與球蟲感染的部位相同,可以獲得持續(xù)性抗原,建立更好的腸道記憶性免疫應答,疫苗激發(fā)保護性免疫應答的部位是疫苗設計中的關鍵因素之一。表達柔嫩艾美耳球蟲5401抗原的沙門氏菌載體疫苗通過口服免疫可誘發(fā)一定水平的體液和細胞免疫應答,并減少48.4%～57.5%球蟲卵囊的排出[68]。融合表達柔嫩艾美耳球蟲AMA1、IMPI和MIC3的重組釀酒酵母菌疫苗口服免疫雞群后可顯著降低盲腸中球蟲基因組的拷貝數(shù)[69-70]。因此,在病毒或細菌載體球蟲疫苗設計中,高效遞送系統(tǒng)的選擇是首要的,高效的遞送系統(tǒng)可在腸道中激發(fā)CD8+TRM高效保護性記憶免疫應答[71]。

3.5 球蟲載體疫苗

鑒于球蟲病疫苗設計中產(chǎn)生高效保護記憶性免疫應答部位的考慮,重組艾美耳球蟲技術的發(fā)展為基于活卵囊為載體的疫苗控制腸道病原微生物提供了一個非常有價值的模型[2,72-75]。重組艾美耳球蟲作為疫苗載體的研究在技術和設計策略上已取得了突破性進展[76-77],其作為疫苗載體表達并運送異源抗原的免疫保護性抗原具有多重優(yōu)勢：1)艾美耳球蟲具有自限性感染與嚴格的宿主特異性,基于活卵囊為載體的疫苗將具有很高的生物安全性[78];2)艾美耳球蟲是一種真核生物,基因組較大,可攜帶較大容量的異源抗原基因,具有通過翻譯后修飾維持異源抗原天然結(jié)構(gòu)和免疫原性的能力[79-81];3)抗原的遞呈途徑與天然抗原一致;4)經(jīng)口免疫省時省力,對雞群應激小。

在柔嫩艾美耳球蟲子孢子表面表達剛地弓形蟲表面抗原1(TgSAG1)可以抵抗T.gondiiRH株的感染[82]。表達巨型艾美耳球蟲IMP1蛋白或AMA1蛋白的轉(zhuǎn)基因柔嫩艾美耳球蟲可以抵抗雞群巨型艾美耳球蟲的感染[73,83-85]。通過基因修飾可提高中低免疫原性艾美耳球蟲(如毒害艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲)的免疫原性及降低其致病性,為開發(fā)新型球蟲疫苗提供了新思路。研究表明,由柔嫩艾美耳球蟲載體表達的分子佐劑如雞IL-2[86],融合表達雞免疫球蛋白Fc片段和其C端錨定的糖基磷酸酯酰肌醇(Glycosyl phosphatidy linositol,GPI)[87]也增強了雞群對野生艾美耳球蟲感染的抵抗作用。以上研究表明,艾美耳球蟲經(jīng)基因修飾作為一種新的球蟲疫苗載體具有可行性。

綜上,目前很多處于研究階段的球蟲病疫苗不能誘導產(chǎn)生腸道高效的TRM細胞記憶性免疫應答,因而不能提供更高效的免疫保護。在疫苗設計中不僅要考慮抗原量和疫苗組分,還要考慮激發(fā)免疫應答的部位和疫苗評價時間點。因為在腸道相關淋巴樣組織(Gut-associated lymphoid tissue,GALT)中只有初次遇到球蟲抗原的淋巴細胞表達腸道歸巢分子,才會更有利于對腸道TRM細胞記憶性免疫應答的形成[88]。因此,通過皮下或肌肉途徑免疫的候選球蟲疫苗不會誘導產(chǎn)生歸巢的淋巴細胞,即使疫苗誘導產(chǎn)生了很強的系統(tǒng)性體液和細胞免疫應答,腸道對球蟲的再次感染沒有記憶性,是難以完全抵抗球蟲感染的。優(yōu)化現(xiàn)有球蟲病疫苗的設計思路以提升宿主腸道內(nèi)產(chǎn)生高效的記憶性免疫應答為目標的策略值得優(yōu)先考慮。抑制球蟲早期發(fā)育是產(chǎn)生保護性記憶免疫應答的重要特征,評價候選球蟲病疫苗的時間點也是需要重點考慮的。

4 球蟲疫苗設計策略

4.1 關注產(chǎn)生高效保護性記憶免疫應答的水平閾值

目前大多數(shù)疫苗需要對宿主進行多次免疫以誘導產(chǎn)生足夠的抗體介導保護性免疫,在以細胞免疫為主的疾病動物模型中,若要激發(fā)產(chǎn)生保護性記憶免疫應答,需要效應性T細胞或CD8+T細胞數(shù)量的閾值[31]。如在嚙齒動物瘧疾中,需要達到每百萬個脾細胞中約400個分泌IFN-γ的特異性CD8+T細胞的閾值水平才可阻止子孢子的感染[89]。保護性免疫應答還包含記憶性CD8+T細胞的數(shù)量和質(zhì)量的閾值,保護性免疫應答水平與記憶性CD8+T細胞數(shù)量之間的關系已被確認[90-92],記憶性CD8+T細胞的質(zhì)和量決定記憶性CD8+T細胞介導的免疫保護水平[92]。研究發(fā)現(xiàn),若將肝臟中李斯特菌數(shù)量降低100倍需要記憶性CD8+T細胞數(shù)量達到10 000個[91];若將脈絡炎腦膜病毒滴度顯著降低需要記憶性CD8+T細胞數(shù)量達到85 000個[93];肝期瘧原蟲感染產(chǎn)生長期免疫需要記憶性CD8+T細胞的數(shù)量是細菌或病毒病原體感染產(chǎn)生長期免疫保護的100～1 000倍[90]。

在新型球蟲病疫苗的設計中,由于球蟲基因組的復雜性,約6 000～10 000個蛋白質(zhì)編碼基因,很難預測刺激高效免疫反應的真正保護性抗原[94],因此,首先要尋找球蟲早期發(fā)育階段的優(yōu)質(zhì)免疫抗原,然后要考慮產(chǎn)生高效保護性記憶免疫應答的雞群免疫狀態(tài),均與免疫系統(tǒng)識別抗原的質(zhì)和量緊密相關。亞單位疫苗、活載體疫苗或DNA疫苗免疫雞群后,免疫系統(tǒng)僅能識別特定的1個或幾個球蟲抗原,抵抗球蟲再次感染的能力極弱,此時雞群處于“Naive”狀態(tài),達不到產(chǎn)生保護性免疫應答的閾值。雞活卵囊疫苗免疫雞群后,其免疫系統(tǒng)能夠快速高效地識別球蟲抗原,高效抵抗球蟲的再次感染,此時雞群處于“Primed”狀態(tài),可達到產(chǎn)生保護性免疫應答的閾值,具體閾值水平的數(shù)值尚需進一步研究。這2種狀態(tài)對雞群產(chǎn)生高效保護性記憶免疫應答水平至關重要。

4.2 關注產(chǎn)生高效保護性記憶免疫應答的主要部位

腸道是激發(fā)產(chǎn)生高效保護性記憶免疫應答的部位,腸道DC細胞的激活是腸道T細胞歸巢的必要條件[88],可激發(fā)宿主產(chǎn)生腸道CD8+TRM細胞免疫應答。在疫苗設計中需要建立腸道DC細胞和T淋巴細胞之間的免疫突觸,用抗原傳輸系統(tǒng)將抗原靶向腸道DC細胞。在建立腸道DC細胞和T淋巴細胞間的連接突觸時,方法和途徑也有很多,如DC細胞表面的不同受體,CCR5受體,CXC4趨化因子受體(CXCR4)或C型凝集素受體都可以與HIV囊膜蛋白gp120結(jié)合,還可以結(jié)合DC細胞內(nèi)吞受體(如DEC205和Clec9A)特異性單克隆抗體[95]。一項瘧疾疫苗研究表明,利用重組腺病毒將抗原肽通過DC細胞表面受體Clec9A的單克隆抗體靶向肝臟中的瘧疾特異性TRM,通過這種策略將在脾臟中的抗原肽遷移至肝臟中形成抗原肽特異性的TRM[96]。這種策略在其他疾病疫苗研發(fā)中應用較多。在新型球蟲疫苗的研發(fā)中,用抗原傳遞系統(tǒng)如病毒、細菌、球蟲活載體或抗體介導[97]、納米顆粒釋放[98]和將抗原靶向DC細胞為開發(fā)球蟲新疫苗提供了巨大潛力。在疫苗設計中有3個關鍵點：一是抗原肽的選擇;二是如何將抗原肽引入腸道DC細胞,被識別并進行處理;三是被DC細胞識別并處理過的抗原肽能否刺激產(chǎn)生特異性的T細胞免疫應答。交互抗原肽的選擇和抗原肽與DC細胞之間的交互方式是最關鍵的,這就需要進一步探究球蟲在感染過程中抗原被DC細胞遞呈途徑,DC細胞又如何將抗原遞呈給腸道T細胞的,只有解析清楚這些途徑,才能為球蟲疫苗研發(fā)提供新的思路。

球蟲激發(fā)宿主產(chǎn)生保護性免疫應答的機制是高效球蟲病疫苗設計和研發(fā)的理論依據(jù),新型球蟲病疫苗應能在腸道激發(fā)質(zhì)優(yōu)量足的對早期感染有記憶性的保護性免疫應答,這樣才可以在球蟲感染早期阻斷子孢子以及第一代裂殖生殖的發(fā)育,進而阻斷第二代和/或第三代大量裂殖生殖的完成,阻止后期裂殖生殖對腸道的嚴重破壞,實現(xiàn)基于免疫學理論的球蟲病的科學防控。

5 球蟲病疫苗評價標準

評估球蟲病疫苗或藥物效果的指標眾多,包括死亡率、體重損失、飼料轉(zhuǎn)化率、病變積分、紅細胞壓積、血清或血漿類胡蘿卜素和卵囊生成等。最常見的指標是前四項,其他指標不同研究者取舍不同[29,99-102]。研制中的球蟲病疫苗有活卵囊疫苗、亞單位疫苗、DNA疫苗和載體疫苗四大類,評價標準一般設計為免疫一周或兩周后的體液免疫、細胞免疫和黏膜免疫水平,以及免疫攻蟲的卵囊排出量。依據(jù)球蟲產(chǎn)生高效保護性記憶免疫應答的機制,本研究提出評價體系應最終以抵抗球蟲早期感染階段的免疫保護力為主來評價。免疫后的攻蟲劑量視疫苗類型不同而不同,如產(chǎn)生較弱免疫水平的重組蛋白疫苗可降低攻蟲劑量。

在球蟲感染宿主后產(chǎn)生保護性免疫應答的多種效應機制中,對第一代裂殖生殖的抑制是記憶性免疫應答抵抗球蟲感染最重要的特征。本研究提出球蟲感染后子孢子發(fā)育成第一代裂殖體的數(shù)量應作為有效記憶性免疫應答的指標,其評估具體時間可以根據(jù)雞球蟲種類的不同而定。如針對柔嫩艾美耳球蟲感染的疫苗,可以以球蟲感染后第3天第一代裂殖體的數(shù)量作為評價未來艾美耳球蟲疫苗的標準。從長遠來看,新型球蟲病疫苗需要生產(chǎn)更簡單,但必需要達到與活卵囊疫苗相當?shù)拿庖咝Я?。這種疫苗評價標準的優(yōu)勢在于大大節(jié)省飼養(yǎng)成本和空間,也很大程度上減少了攻蟲后野毒蟲株產(chǎn)生的卵囊對設施的污染。

6 結(jié) 論

新型球蟲病疫苗的突破將取決于3個方面：1)保護性記憶免疫應答水平的閾值;2)高效保護性記憶免疫應答的部位,不僅選擇可激發(fā)腸道免疫系統(tǒng)的球蟲早期抗原,還要考慮誘導腸道保護性記憶免疫應答的可能途徑;3)評價球蟲免疫效果的時間點以是否在球蟲感染早期抑制子孢子發(fā)育為第一代裂殖體為主。