趙亞培 張向苗 王秋冬

食管癌是消化道常見惡性腫瘤,手術(shù)、放射治療和化療是目前主要治療手段,然而其臨床療效均不甚理想[1]。有研究報(bào)道m(xù)iR-153可顯著促進(jìn)食管癌KYSE450細(xì)胞和乳腺癌MCF-7細(xì)胞自噬[2]。KLF7在人口腔鱗狀細(xì)胞癌中的過度表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[3];KLF7高表達(dá)與胃癌預(yù)后不良相關(guān),敲低KLF7抑制胃癌細(xì)胞遷移[4]。腸道富集的Kruppel樣因子在食管鱗狀細(xì)胞癌中下調(diào)表達(dá),與其進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)[5]。然而miR-153-3p與KLF7調(diào)控對食管癌細(xì)胞研究機(jī)制不清楚,本實(shí)驗(yàn)通過miR-153-3p和KLF7的相關(guān)表達(dá)載體研究其對食管癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移的影響、其靶向調(diào)控關(guān)系以及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人正常食管上皮細(xì)胞株HEEC和人食管癌細(xì)胞EC9706、Eca-109、EC-1、TE-1購自上海弘順生物科技有限公司。胎牛血清(FBS)、RPMI-1640培養(yǎng)基購自賽默飛世爾科技中國有限公司;LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒購自美國Invitrogen公司;凋亡試劑盒購自碧云天生物;兔抗人KLF7多克隆抗體、兔抗人p-STAT3多克隆抗體、兔抗人STAT3多克隆抗體、兔抗人β-actin多克隆抗體和山羊抗兔IgG購自上海煊翎生物;白細(xì)胞介素IL-6試劑盒購自上海聯(lián)科生物;載體質(zhì)粒購自北京普瑞金科技有限公司;雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞活化 食管癌細(xì)胞(EC9706、Eca-109、EC-1、TE-1)、正常食管上皮細(xì)胞株HEEC培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%FBS)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染、分組 取對數(shù)生長期細(xì)胞EC9706,用anti-miR-con、anti-miR-153-3p、miR-con、miR-153-3p、si-con、si-KLF7轉(zhuǎn)染細(xì)胞,分別為anti-miR-con組、anti-miR-153-3p組、miR-con組、miR-153-3p組、si-con組、si-KLF7組;將miR-153-3p與pcDNA、miR-153-3p與pcDNA-KLF7共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,記為miR-153-3p+pcDNA組、miR-153-3p+pcDNA-KLF7組。

1.2.3 RT-qPCR檢測KLF7 mRNA和 miR-153-3p水平 總RNA提取提取后,反轉(zhuǎn)錄cDNA,根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行PCR。相對表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。

1.2.4 Western Blot檢測Kruppel樣因子7(KLF7)、磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(p-STAT3)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)蛋白表達(dá) 加入裂解液提取總蛋白,蛋白濃度用BCA法測定。隨后進(jìn)行電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉1 h,4 ℃加一抗(1∶1000)過夜后,PBS洗膜,加二抗(1∶2000)37 ℃孵育2 h,加入顯影液顯影,利用蛋白條帶的吸光度計(jì)算蛋白表達(dá)量。

1.2.5 MTT檢測細(xì)胞活性 分別在細(xì)胞培養(yǎng)的24 h、48 h、72 h時(shí),加入MTT溶液,培養(yǎng)2 h后,加DMSO混勻,在490 nm波長條件下用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光值。

1.2.6 細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞培養(yǎng)48 h后重懸細(xì)胞。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn):取濃度為(1×105個(gè)/mL)細(xì)胞懸液100 μL接于Transwell上室,下室加500 μL含血清的培養(yǎng)液,培養(yǎng)24 h,加入固定液固定20 min,PBS沖洗,加入結(jié)晶紫染色,顯微鏡觀察并拍照。

侵襲實(shí)驗(yàn):1∶4比例加培養(yǎng)液稀釋Matrigel,包被Transwell上室,后續(xù)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 ELISA法檢測IL-6的表達(dá) 取以上各組細(xì)胞,離心取上清,后續(xù)步驟嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.8 熒光素酶報(bào)告基因檢測miR-153-3p對KLF7的靶向調(diào)控 構(gòu)建KLF7的3′UTR野生型、突變型基因載體WT-KLF7和MUT-KLF7,取對數(shù)期EC9706細(xì)胞,待細(xì)胞生長至80%融合時(shí)將WT-KLF7和MUT-KLF7分別與miR-con和miR-153-3p轉(zhuǎn)染細(xì)胞。按照說明書進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 食管癌細(xì)胞中KLF7、miR-153-3p的表達(dá)

人食管癌細(xì)胞系中KLF7 mRNA和蛋白表達(dá)高于正常食管上皮細(xì)胞HEEC,miR-153-3p表達(dá)水平低于HEEC(P<0.05)(圖1,表1)。可見,在食管癌細(xì)胞中miR-153-3p呈低表達(dá),KLF7呈高表達(dá)。

圖1 Western blot檢測食管癌細(xì)胞中KLF7蛋白的表達(dá)

2.2 miR-153-3p對EC9706細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲影響

與miR-con組相比,miR-153-3p組食管癌細(xì)胞EC9706活力、遷移和侵襲數(shù)量降低(P<0.05)(表2)。可見,miR-153-3p過表達(dá)抑制食管癌細(xì)胞EC9706的增殖、遷移和侵襲。

2.3 miR-153-3p抑制食管癌細(xì)胞EC9706中IL-6/STAT3信號通路

與miR-con組相比,miR-153-3p組食管癌細(xì)胞EC9706中IL-6含量顯著降低,p-STAT3表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)(圖2,表3)。

2.4 miR-153-3p靶向KLF7

圖3為KLF7與miR-153-3p存在結(jié)合位點(diǎn)。miR-153-3p組WT-KLF7熒光素酶活性低于miR-con組(P<0.05);而MUT-KLF7熒光素酶活性差異不顯著,見表4。 miR-153-3p組KLF7表達(dá)水平顯著低于miR-con

表1 食管癌細(xì)胞和人正常食管上皮細(xì)胞中miR-153-3p和KLF7的表達(dá)

組;anti-miR-153-3p組KLF7表達(dá)水平高于anti-miR-con組(P<0.05),見表5。

2.5 沉默KLF7抑制食管癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和IL-6/STAT3信號通路

si-KLF7組食管癌細(xì)胞與si-con組相比,細(xì)胞活力、遷移和侵襲、KLF7、IL-6、p-STAT3表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)(圖4,表6)?？梢?沉默KLF7抑制食管癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和IL-6/STAT3信號通路。

2.6 過表達(dá)KLF7部分逆轉(zhuǎn)miR-153-3p抑制食管癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和IL-6/STAT3信號通路與miR-con組相比,miR-153-3p組食管癌細(xì)胞中KLF7表達(dá)水平、細(xì)胞活力、遷移和侵襲數(shù)量、IL-6含量、p-STAT3表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與miR-153-3p+pcDNA組相比,miR-153-3p+pcDNA-KLF7組中KLF7表達(dá)水平、細(xì)胞活力、細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)、IL-6含量、p-STAT3表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(圖5,表7)。

表2 miR-153-3p抑制食管癌細(xì)胞EC9706的增殖和轉(zhuǎn)移

圖2 Western blot檢測食管癌細(xì)胞中p-STAT3和STAT3蛋白的表達(dá)

表3 miR-153-3p抑制食管癌細(xì)胞EC9706中IL-6分泌、p-STAT3和STAT3蛋白的表達(dá)

圖3 KLF7與miR-153-3p 互補(bǔ)的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表5 miR-582-5p 調(diào)控KLF7蛋白的表達(dá)

圖4 Western blot檢測食管癌細(xì)胞中KLF7、p-STAT3和STAT3蛋白的表達(dá)

圖5 Western blot檢測食管癌細(xì)胞中KLF7、p-STAT3和STAT3蛋白的表達(dá)

表6 沉默KLF7抑制食管癌細(xì)胞EC9706增殖、遷移、侵襲、IL-6分泌、p-STAT3和STAT3蛋白的表達(dá)

表7 過表達(dá)KLF7和轉(zhuǎn)染miR-153-3p對食管癌細(xì)胞EC9706增殖、遷移、侵襲、IL-6、p-STAT3和STAT3蛋白水平的影響

3 討論

食管癌在全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均較高,其侵襲性強(qiáng),預(yù)后差,確診時(shí)多為晚期和轉(zhuǎn)移性食管癌,難治愈[6];分子靶向治療成為其新的治療方式[7]。miRNA參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程,如miR-153通過靶向Snail抑制肝細(xì)胞癌的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[8]。circRNA_0084043通過靶向調(diào)控miR-153-3p/Snail軸促進(jìn)惡性黑素瘤細(xì)胞進(jìn)展[9]。miR-153-3p過表達(dá)明顯降低了急性淋巴細(xì)胞白血病的細(xì)胞增殖,遷移和侵襲[10]。敲低CASC15表達(dá)可以介導(dǎo)miR-153-3p/KLF5通路抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程[11]。在本研究結(jié)果中,miR-153-3p在食管癌細(xì)胞中低表達(dá),上調(diào)miR-153-3p表達(dá)可以降低細(xì)胞活性、遷移、侵襲數(shù)量。提示上調(diào)miR-153-3p抑制食管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

KLF7是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子,在癌癥發(fā)展中起著重要作用;上調(diào)KLF7表達(dá)可以促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移侵襲,如膠質(zhì)瘤細(xì)胞[12],下調(diào)KLF7表達(dá)可以抑制坐骨神經(jīng)損傷后的施萬細(xì)胞[13]和非小細(xì)胞肺癌的癌細(xì)胞[14]的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),KLF7食管癌細(xì)胞中高表達(dá),沉默KLF7可降低細(xì)胞活性和遷移、侵襲數(shù)量。說明KLF7在食管癌可能作為促癌因子起作用,沉默KLF7可抑制食管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。miR-153-3p靶向調(diào)控KLF7,過表達(dá)KLF7能部分回復(fù)miR-153-3p對EC9706細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用。說明miR-153-3p通過調(diào)控KLF7影響食管癌細(xì)胞進(jìn)展。

白細(xì)胞介素6(Interleukin-6,IL-6)是一種重要的炎性因子,與其受體結(jié)合可以激活STAT3,而異常活化的STAT3在腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[15]。IL-6/STAT3信號通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),研究發(fā)現(xiàn)伊拉霉素C通過抑制IL-6誘導(dǎo)的STAT3磷酸化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制三陰性乳腺癌的遷移和侵襲[16]。miRNA-26b抑制IL-6/STAT3信號通路的激活促進(jìn)肝癌細(xì)胞自噬[17]。協(xié)同刺激分子B7-H4活化了IL-6/STAT3信號通路,并促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-153-3p過表達(dá)和沉默KLF7均降低了p-STAT3表達(dá)水平,且抑制IL-6的分泌。說明miR-153-3p過表達(dá)和沉默KLF7抑制了IL-6/STAT3信號通路的激活。而過表達(dá)KLF7逆轉(zhuǎn)了miR-153-3p對IL-6/STAT3信號通路的抑制作用,說明miR-153-3p可能通過調(diào)控KLF7進(jìn)而抑制IL-6/STAT3信號通路抑制食管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

過表達(dá)miR-153-3p可通過調(diào)控KLF7/IL-6/STAT3通路抑制食管癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲。