張俊強(qiáng) 萬久愷 姚浩宇 范 銳

前列腺癌是老年男性常見惡性腫瘤,死亡率僅次于肺癌,對(duì)男性人群健康造成嚴(yán)重影響。目前臨床可通過手術(shù)切除腫瘤,一定程度提高患者生存率,但存在復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn),中晚期患者還可通過激素去勢(shì)治療,但多數(shù)患者易發(fā)生激素抵抗,導(dǎo)致病情惡化,嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量[1-2]。因此,迫切需要尋找有效治療藥物以延緩病情進(jìn)展,延長(zhǎng)患者生存期。近年來,隨著對(duì)天然植物藥物的深入研究,多種中草藥及其提取物被發(fā)現(xiàn)具有明顯的抗腫瘤作用。褐藻素是從海帶科植物中提取的一種類胡蘿卜素成分,具有抗炎、抗病毒、抗氧化等藥理活性[3]。既往研究顯示,褐藻素可抑制宮頸癌細(xì)胞[4]、鼻咽癌細(xì)胞[5]增殖,具有明顯抗腫瘤作用。此外,褐藻素還被證實(shí)在非酒精性脂肪肝動(dòng)物模型中具有抗氧化作用[6]。氧化應(yīng)激與腫瘤進(jìn)展關(guān)系密切,Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)/核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2)/血紅素氧合酶-1(heme oxygenase 1,HO-1)信號(hào)通路是體內(nèi)重要抗氧化應(yīng)激通路,Keap1失活可引起Nrf2高表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞增殖,誘發(fā)基因突變,在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[7]。鑒于此,本研究以前列腺癌DU145細(xì)胞為研究對(duì)象,分析褐藻素對(duì)癌細(xì)胞增殖凋亡的影響,并探討其作用機(jī)制,旨在為臨床開發(fā)相關(guān)藥物及治療前列腺癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

人前列腺癌DU145細(xì)胞株,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑和儀器

褐藻素(98%)、2,7-二氯熒光黃乙酰乙酸(2',7'-dichlorodihydronuorescein diacetate,DCFH-DA)(美國(guó)sigma公司),含有Keap1 shRNA和陰性對(duì)照Keap1 shNC基因序列的pHBLV-U6-Scramble-ZsGreen-Puro質(zhì)粒(蘇州吉瑪基因股份有限公司),丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒(南京建成生物工程研究所),兔抗人Keap1、Nrf2、HO-1、B細(xì)胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(英國(guó)Abcam公司),FITC-PI凋亡檢測(cè)試劑盒、流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司),RT-PCR儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司),酶標(biāo)儀、電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

DU145細(xì)胞常規(guī)水浴復(fù)蘇后,置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)環(huán)境為:含有10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液,37 ℃、飽和濕度、5% CO2,每2～3 d換液1次,觀察細(xì)胞融至80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代。使用對(duì)數(shù)增殖期細(xì)胞。

1.4 MTT法檢測(cè)褐藻素對(duì)DU145細(xì)胞增殖的影響

取對(duì)數(shù)增殖期DU145細(xì)胞,棄去培養(yǎng)基,PBS漂洗3遍,胰酶消化、離心,重懸細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL,96孔板中每孔加入0.1 mL細(xì)胞懸液,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,之后加入不同濃度褐藻素(1、10、20、40、80 μmol/L),另設(shè)不加褐藻素的空白組,各設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)48 h,每孔加入10 μL MTT溶液(5 g/L),繼續(xù)孵育4 h,棄上清,每孔加入150 μL二甲基亞砜,振蕩溶解結(jié)晶,使用酶標(biāo)儀于490 nm處觀察各孔吸光(A)值,計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率,細(xì)胞增殖抑制率=(1-各濃度褐藻素A值/空白組A值)×100%。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組

將對(duì)數(shù)增殖期DU145細(xì)胞,以5×105個(gè)/mL密度接種于6孔板,細(xì)胞融合至70%時(shí),棄去原培養(yǎng)基,加入新鮮培養(yǎng)基,加入3×106U含有Keap1 shRNA和Keap1 shNC基因序列的pHBLV-U6-Scramble-ZsGreen-Puro慢病毒質(zhì)粒,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,更換培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,加入嘌呤霉素篩選細(xì)胞,48 h后觀察細(xì)胞,未感染的空細(xì)胞死亡,而病毒感染細(xì)胞存活,表示轉(zhuǎn)染成功。將對(duì)數(shù)增殖期DU145細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組(常規(guī)培養(yǎng))、Keap1 shRNA組(轉(zhuǎn)染Keap1 shRNA慢病毒質(zhì)粒)、Keap1 shNC組(轉(zhuǎn)染Keap1 shNC慢病毒質(zhì)粒)、褐藻素組(使用40 μmol/L褐藻素處理)和褐藻素+Keap1 shRNA組(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Keap1 shRNA后,使用40 μmol/L褐藻素處理)。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

各組細(xì)胞以5×105個(gè)/mL密度接種于6孔板,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,棄去培養(yǎng)基,PBS漂洗,胰酶消化后,置于離心管中,1000 r/min,離心5 min,棄上清,使用PBS重懸細(xì)胞,1000 r/min離心5 min,棄上清后收集細(xì)胞,加入200 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞,加入5 μL Annexin-FITC結(jié)合懸浮細(xì)胞,室溫避光孵育10 min,之后加入10 μL PI染色液,4 ℃避光孵育10 min,1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析,檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,重復(fù)3次,取平均值。細(xì)胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平

各組細(xì)胞于6孔板中,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,胰酶消化,1000 r/min離心5 min,棄上清后收集細(xì)胞,PBS漂洗2遍,計(jì)數(shù)1×105個(gè)細(xì)胞,加入終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA染液,37 ℃孵育30 min,PBS漂洗,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度,以熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

1.8 檢測(cè)細(xì)胞中SOD、GSG-Px活力和MDA含量

各組細(xì)胞于6孔板中,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,收集培養(yǎng)上清,1500 r/min離心2 min,按照試劑盒說明書操作步驟,逐步添加試劑,均勻混合,酶標(biāo)儀測(cè)量A值,檢測(cè)細(xì)胞中SOD、GSG-Px活力和MDA含量。

1.9 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中mRNA表達(dá)

收集各組細(xì)胞,TRizol法提取總RNA,測(cè)定RNA濃度和純度。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)行PCR反應(yīng)。配制反應(yīng)體系:10 μL SYBR Prmix Ex Taq,正向引物和反向引物各0.8 μL,2 μL cDNA模板,滅菌水補(bǔ)至總體積20 μL。將配制好的溶液置于PCR儀上進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)參數(shù):95 ℃ 5 s,95 ℃ 30 s,60 ℃ 10 s,重復(fù)40個(gè)循環(huán)。以GDPAH為內(nèi)參,采用2-△△CT法進(jìn)行相對(duì)定量。實(shí)驗(yàn)所用引物序列見表1。

表1 引物序列

1.10 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中蛋白表達(dá)

收集各組細(xì)胞,PBS漂洗,加入RIPA冰上裂解30 min,12000 r/min離心15 min,收集上清,BCA法測(cè)定蛋白濃度。每孔20 μg上樣,進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳(110 V,2 h)并轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,4 ℃孵育一抗(Keap1、Nrf2、Ho-1、Bcl-2、Bax,均1∶500稀釋)過夜,TBST洗膜,室溫孵育二抗(辣根過氧標(biāo)記的IgG,1∶2000稀釋)2 h。ECL顯影、定影,使用ImageJ軟件掃描灰度并定量,以Keap1、Nrf2、Ho-1與內(nèi)參照GAPDH灰度比值作為其相對(duì)表達(dá)量。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度褐藻素對(duì)DU145細(xì)胞增殖的影響

空白組和1、10、20、40、80 μmol/L濃度褐藻素組細(xì)胞增殖抑制率分別為:0、(13.26±2.45)%、(21.33±2.79)%、(34.75±3.42)%、(49.53±3.41)%、(65.74±4.07)%。細(xì)胞增殖抑制率隨著褐藻素濃度增加而升高,呈濃度依賴性(P<0.05)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取增殖抑制率接近50%的褐藻素工作濃度,即40 μmol/L。

2.2 各組細(xì)胞凋亡率

與對(duì)照組和Keap1 shNC組比較,Keap1 shRNA組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05);褐藻素組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。褐藻素+Keap1 shRNA組細(xì)胞凋亡率高于Keap1 shRNA組,低于褐藻素組(P<0.05)。見表2,圖1。

表2 各組細(xì)胞凋亡率

2.3 各組細(xì)胞ROS水平

與對(duì)照組和Keap1 shNC組比較,Keap1 shRNA組細(xì)胞ROS水平升高(P<0.05);褐藻素組細(xì)胞ROS水平低于對(duì)照組(P<0.05);褐藻素+Keap1 shRNA組細(xì)胞ROS水平低于Keap1 shRNA組,高于褐藻素組(P<0.05)。見表3,圖2。

2.4 各組細(xì)胞SOD、GSH-Px活力和MDA含量

與對(duì)照組和Keap1 shNC組比較,Keap1 shRNA組SOD和GSH-Px活力降低,MDA含量升高(P<0.05);褐藻素組較對(duì)照組SOD和GSH-Px活力升高,MDA含量降低(P<0.05);褐藻素+Keap1 shRNA組SOD和GSH-Px活力高于Keap1 shRNA組而低于褐藻素組,MDA含量低于Keap1 shRNA組而高于褐藻素組(P<0.05)。見表4。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

2.5 各組細(xì)胞mRNA表達(dá)水平

與對(duì)照組和Keap1 shNC組比較,Keap1 shRNA組Keap1 mRNA表達(dá)降低,Nrf2和Ho-1 mRNA表達(dá)升高(P<0.05);褐藻素組Keap1 mRNA表達(dá)高于對(duì)照組,Nrf2和Ho-1 mRNA表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05);褐藻素+Keap1 shRNA組Keap1 mRNA表達(dá)高于Keap1 shRNA組低于褐藻素組,Nrf2和Ho-1 mRNA表達(dá)低于Keap1 shRNA組高于褐藻素組(P<0.05)。見表5。

表3 各組細(xì)胞ROS水平

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS水平

表4 各組SOD、GSH-Px活力和MDA含量

表5 各組細(xì)胞Keap1、Nrf2和Ho-1 mRNA表達(dá)水平

2.6 各組細(xì)胞蛋白表達(dá)水平

與對(duì)照組和Keap1 shNC組比較,Keap1 shRNA組Keap1、Bax蛋白表達(dá)降低,Nrf2、Ho-1和Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.05);褐藻素組Keap1、Bax蛋白表達(dá)高于對(duì)照組,Nrf2、Ho-1和Bcl-2蛋白表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05);褐藻素+Keap1 shRNA組Keap1、Bax蛋白表達(dá)高于Keap1 shRNA組低于褐藻素組,Nrf2、Ho-1和Bcl-2蛋白表達(dá)低于Keap1 shRNA組高于褐藻素組(P<0.05)。見表6,圖3。

3 討論

氧化還原反應(yīng)在機(jī)體內(nèi)普遍存在,氧化還原態(tài)的失衡與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程密切相關(guān)。乏氧環(huán)境、炎性因子等外界環(huán)境可導(dǎo)致細(xì)胞氧化還原失衡,使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,引起腫瘤;同時(shí)腫瘤細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激,產(chǎn)生大量ROS,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞突變和分裂,進(jìn)一步誘導(dǎo)腫瘤進(jìn)展[8-9]。氧化應(yīng)激與前列腺癌發(fā)生發(fā)展過程關(guān)系密切,參與腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、耐藥性和凋亡等過程,并可增強(qiáng)雄激素信號(hào)傳導(dǎo),促進(jìn)去勢(shì)抵抗性前列腺癌進(jìn)展,給臨床治療前列腺癌帶來極大挑戰(zhàn)[10]。

表6 各組細(xì)胞蛋白表達(dá)水平

圖3 各組細(xì)胞蛋白表達(dá)電泳圖

褐藻素是一種海洋類胡蘿卜素,可通過多種途徑對(duì)不同類型腫瘤發(fā)揮抗腫瘤作用。Wang等[11]研究顯示,褐藻素可降低乳腺癌細(xì)胞和乳腺癌裸鼠模型中微淋巴管密度,體內(nèi)外均發(fā)揮淋巴管抑制作用,可作為乳腺癌患者抗腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在途徑。Mei等[12]報(bào)道,褐藻素在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的抗增殖具有劑量和時(shí)間依賴性,可通過阻滯細(xì)胞周期誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究使用不同濃度褐藻素處理前列腺癌DU145細(xì)胞,結(jié)果顯示細(xì)胞增殖活力明顯降低,提示褐藻素對(duì)DU145細(xì)胞增殖的抑制作用,此外,褐藻素處理的細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯升高,提示褐藻素對(duì)DU145細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用,證實(shí)褐藻素可抑制DU145細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,具有潛在抗前列腺癌作用。

ROS在細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程廣泛存在,高濃度ROS可導(dǎo)致氧化還原系統(tǒng)失衡,引起細(xì)胞損傷,ROS攻擊生物膜中不飽和脂肪酸,形成MDA等脂質(zhì)過氧化物,MDA水平可反映氧化應(yīng)激損傷程度。機(jī)體內(nèi)SDO、GSH-Px等抗氧化酶可形成內(nèi)源性防御機(jī)制,使機(jī)體免受ROS引起的氧化應(yīng)激,SOD能夠催化超氧自由基,清除ROS,當(dāng)SOD活性下降時(shí),細(xì)胞易受ROS攻擊引起損傷;GSH-Px可催化過氧化氫,減少脂質(zhì)過氧化,保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。為進(jìn)一步研究褐藻素對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制,本研究對(duì)細(xì)胞中的ROS水平、SOD和GSH-Px活性及MDA含量進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果顯示,褐藻素組細(xì)胞中SOD和GSH-Px活性較對(duì)照組明顯升高,ROS水平和MDA含量明顯下降,表明褐藻素可平衡細(xì)胞氧化還原失衡狀態(tài),減少氧化應(yīng)激對(duì)腫瘤細(xì)胞的促進(jìn)作用。有研究顯示,褐藻素可通過調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路,減輕氧化應(yīng)激,改善腎纖維化[13]。Zhang等[14]研究顯示,褐藻素可通過誘導(dǎo)Sirt1,減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血中的氧化損傷,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。以上研究均提示褐藻素的抗氧化作用,本研究結(jié)果也證實(shí)褐藻素在前列腺癌DU145細(xì)胞中可通過抗氧化作用,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,可能與其類胡蘿卜素獨(dú)特的丙二烯鍵等結(jié)構(gòu)能清除ROS有關(guān),促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)氧化還原系統(tǒng)維持在相對(duì)平衡狀態(tài),進(jìn)而減少DU145細(xì)胞過度增殖,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

Keap1/Nrf2/HO-1在維持機(jī)體氧化還原平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用,Nrf2對(duì)氧化應(yīng)激高度敏感,主要受其胞質(zhì)接頭蛋白Keap1調(diào)控,Keap1可促進(jìn)Nrf2的泛素化降解過程[15]。正常情況下,Keap1和Nrf2以二聚體形式存在,氧化應(yīng)激條件下,Keap1與Nrf2解離,導(dǎo)致Keap1-Nrf2通路失活,Nrf2轉(zhuǎn)移入核,與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合,啟動(dòng)下游編碼抗氧化蛋白類HO-1等表達(dá),HO-1可保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受損傷,促進(jìn)細(xì)胞增殖,減少凋亡,并可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性[16-17]。本研究敲降Keap1表達(dá)后,相較于對(duì)照組,Keap1 shRNA組細(xì)胞Keap1 mRNA和蛋白表達(dá)降低,Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白表達(dá)升高,發(fā)生明顯氧化應(yīng)激反應(yīng),且抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)升高,促進(jìn)凋亡蛋白Bax表達(dá)降低,細(xì)胞凋亡減少,而使用褐藻素處理的細(xì)胞Keap1 mRNA和蛋白表達(dá)升高,Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白表達(dá)降低,同時(shí)Bcl-2蛋白表達(dá)降低,Bax蛋白表達(dá)升高,提示褐藻素可能對(duì)Keap1/Nrf2/HO-1通路存在調(diào)控作用,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。為闡明褐藻素對(duì)DU145細(xì)胞的作用機(jī)制,本研究在敲降Keap1表達(dá)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步聯(lián)合使用褐藻素處理,結(jié)果顯示褐藻素可使氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯減弱,證實(shí)其對(duì)Keap1/Nrf2/HO-1通路的調(diào)控作用。

綜上,Keap1/Nrf2/HO-1通絡(luò)介導(dǎo)前列腺癌DU145細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng),而褐藻素可通過激活Keap1表達(dá),進(jìn)而抑制Nrf2、HO-1表達(dá),促進(jìn)氧化還原態(tài)平衡,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,為臨床前列腺癌治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。