穆文強 尚慶茂 武瑞赟 康慎敏 李平蘭*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜花卉研究所,北京 100081)

功能性育苗基質(zhì)是在傳統(tǒng)育苗基質(zhì)基礎(chǔ)上通過添加各種植物根際促生菌制備的一類對幼苗具有抗病促生功能的育苗基質(zhì)。該類育苗基質(zhì)中富含的植物根際促生菌可以在植物根際聚集并分解難溶的礦物質(zhì)[1],可預(yù)防和控制植物病害,促進(jìn)幼苗生長[2-3],減少農(nóng)藥和化肥的使用[4-5]。使用植物根際促生菌是一種提高蔬菜產(chǎn)量和質(zhì)量的新型方法[6]。

芽孢桿菌是公認(rèn)的植物根際促生菌,貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)是芽孢桿菌屬的一個新種[7],已報道有多株性能優(yōu)良植物根際促生菌,如貝萊斯芽孢桿菌BAC03對甜菜、黃瓜、辣椒等蔬菜具有促進(jìn)幼苗生長作用[8];貝萊斯芽孢桿菌BS89可促進(jìn)植物生長,能夠分泌植物激素、鐵載體等[9];貝萊斯芽孢桿菌B006可提高茄子對氮、磷、鉀的吸收并促進(jìn)其生長[10]。目前多數(shù)研究仍集中在優(yōu)良菌株篩選、鑒定、發(fā)酵工藝優(yōu)化和小規(guī)模的苗期應(yīng)用效果上,對其協(xié)同育苗基質(zhì)的大規(guī)模應(yīng)用和如何有效的與傳統(tǒng)育苗基質(zhì)復(fù)配來最大限度發(fā)揮其有益作用的研究較少。

芽孢桿菌促生菌菌劑主要有液體和固體2種劑型,液體菌劑和水溶性強的固體菌劑在實際生產(chǎn)中,可通過混合攪拌機中的濕潤噴霧裝置將其噴灑至育苗基質(zhì)中,達(dá)到混合均勻的目的[11],該工藝操作相對簡單方便,但存在芽孢易萌發(fā),產(chǎn)品保質(zhì)期短等問題;水溶性相對弱的固體菌劑則多采用固體混拌的方式進(jìn)行混配。育苗基質(zhì)中促生菌含量為107CFU/mL時,對蔬菜幼苗的生長有顯著的促進(jìn)作用[12],對于1011CFU/g的固體菌劑,通過和傳統(tǒng)育苗基質(zhì)直接混配達(dá)到基質(zhì)含菌量為107CFU/mL時,因菌劑添加量少,稀釋倍數(shù)高,易造成固體菌劑在育苗基質(zhì)中的分布不均勻,在實際育苗過程中造成幼苗長勢不一、形態(tài)差異大等育苗事故[13]。因此,對功能性育苗基質(zhì)生產(chǎn)中固體促生菌劑與育苗基質(zhì)的混配方式及影響因素開展研究具有重要意義[14]。

γ-聚谷氨酸是一種由α-胺基和γ-羧基經(jīng)酰胺鍵連接構(gòu)成的同型聚酰胺的聚合物[15-16],具有水溶性、粘著性、易被生物降解、不含毒性和對環(huán)境友好等特點[17-18]。γ-聚谷氨酸在育苗基質(zhì)中能夠通過整合作用和吸附作用減少礦質(zhì)養(yǎng)分的沖淋率,提髙肥料的利用效率,起到肥料增效劑的作用[19-20]。γ-聚谷氨酸在小青菜、小白菜、草莓、油菜等[21-23]的應(yīng)用上,表現(xiàn)出明顯促進(jìn)生長的效果,是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用的肥料輔助劑。

本研究以育苗基質(zhì)中貝萊斯芽孢桿菌的變異系數(shù)(Coefficient of variation,CV)為評價指標(biāo),擬通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗和響應(yīng)面優(yōu)化試驗,優(yōu)化載體γ-聚谷氨酸添加量、育苗基質(zhì)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、混合轉(zhuǎn)速和混合時間等參數(shù),提升菌劑在育苗基質(zhì)中的均勻性,并測定混配后育苗基質(zhì)的理化性質(zhì),探究載體γ-聚谷氨酸添加量和混配方式對育苗基質(zhì)品質(zhì)的影響,為開發(fā)富含復(fù)合貝萊斯芽孢桿菌的功能性育苗基質(zhì)及其工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1菌劑及試劑

供試復(fù)合貝萊斯芽孢桿菌菌劑含菌量為2.56×1011CFU/g,由貝萊斯芽孢桿菌L-S 60、L-H 15和LPL-117菌株(CGMCC No.10045、10044和7749)混合發(fā)酵制備,菌株來自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院應(yīng)用微生物實驗室;γ-聚谷氨酸來自北京元嘉禾農(nóng)業(yè)科技有限公司;LB肉湯、瓊脂等購于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.2育苗基質(zhì)原料及穴盤

草炭土購自黑龍江樺美泥炭有限公司,蛭石和珍珠巖購自河北省靈壽縣京石礦產(chǎn)工廠,采用粒徑為3～6 mm園藝級。草炭土、蛭石和珍珠巖在使用前經(jīng)121 ℃滅菌60 min。

穴盤使用6×12(72孔)的塑料穴盤,單穴容積40 cm3,試驗中每個穴盤加入約3 L育苗基質(zhì),穴盤購自浙江臺州隆基塑業(yè)有限公司。

1.1.3儀器及設(shè)備

垂直流潔凈工作臺SCL-1300,北京賽伯樂實驗儀器有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱DNP-9162,上海精宏實驗設(shè)備有限公司;微型漩渦混合儀WH-3,上海滬西分析儀器廠;組合搖床MQD-S3R,上海旻泉儀器有限公司;酸度計FE20,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;混合攪拌機,鄭州科勒機械設(shè)備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1根際促生菌變異系數(shù)的測定

試驗采用的育苗基質(zhì)按V(草炭土)∶V(蛭石)∶V(珍珠巖)=3∶1∶1復(fù)配制備,將育苗基質(zhì)和攜帶菌劑的γ-聚谷氨酸載體填裝至混合攪拌機中進(jìn)行混配,混配后的育苗基質(zhì)填裝于72孔穴盤中,隨機挑選5個穴孔取樣,每個樣品25 mL。將樣品加入到含有225 mL滅菌的生理鹽水的錐形瓶中,以200 r/min低溫震蕩20 min,進(jìn)行梯度稀釋,涂布,培養(yǎng),對微生物菌落計數(shù)。每個梯度重復(fù)3次,計算微生物菌落數(shù)的平均值(M)和標(biāo)準(zhǔn)差(S),貝萊斯芽孢桿菌的變異系數(shù)(CV),計算公式為：

(1)

1.2.2育苗基質(zhì)理化性質(zhì)的測定

育苗基質(zhì)的物理性質(zhì)包括容重、總孔隙度、通氣孔隙度、持水孔隙度和最大持水量等,測定方法參照NY/T 1121.4—2006《土壤容重的測定》[24];育苗基質(zhì)pH測定采用1∶10稀釋法。

1.2.3單因素試驗

基于固體分步混配的相關(guān)研究[25-26]及本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),1011CFU/g的固體芽孢桿菌菌劑采用兩步混配方式可達(dá)到混合均勻的效果。第1次混合,將菌粉與定量的γ-聚谷氨酸載體混合,這個過程菌粉和載體量相對較少,易混合均勻;第2次混合,將含有菌劑的γ-聚谷氨酸載體加入傳統(tǒng)育苗基質(zhì)中進(jìn)行機械攪拌混合。

在兩步混配的前提下,采用單因素試驗,探究載體γ-聚谷氨酸添加量(X1)、育苗基質(zhì)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X2)、混合轉(zhuǎn)速(X3)和混合時間(X4)4個因素對貝萊斯芽孢桿菌變異系數(shù)的影響。γ-聚谷氨酸載體的添加量選取6個水平,分別為0、1、3、5、7、9 g/L;基質(zhì)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)選取5個水平,分別為15%、20%、25%、30%、35%;混合轉(zhuǎn)速選取5個水平,分別為25、30、35、40、45 r/min;混合時間選取5個水平,分別為3、4、5、6、7 min。進(jìn)行每組試驗時只改變1個因素的水平,其他因素保持不變,每組試驗在前面因素最佳的情況下進(jìn)行。

1.2.4Plackett-Burman試驗

試驗使用Design-Expert 13.0軟件,選用N=12的Plackett-Burman試驗設(shè)計。以育苗基質(zhì)中貝萊斯芽孢桿菌的變異系數(shù)為響應(yīng)值,因素和水平選取見表1。通過對4個因素效應(yīng)值、方差和貢獻(xiàn)率的分析,選出貢獻(xiàn)率前3的因素進(jìn)行最陡爬坡試驗。

表1 貝萊斯芽孢桿菌變異系數(shù)PB試驗因素和水平Table 1 Factors and levels of the PB test for the CV of Bacillus velezensis

1.2.5最陡爬坡試驗

根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果,對具有顯著性載體γ-聚谷氨酸添加量(X1)、混合轉(zhuǎn)速(X3)和混合時間(X4)的3因素進(jìn)行最陡爬坡試驗,使試驗因素水平快速逼近最優(yōu)范圍,以進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗。最陡爬坡試驗設(shè)計見表2。

表2 貝萊斯芽孢桿菌變異系數(shù)最陡爬坡試驗設(shè)計Table 2 Steepest climbing test design for the CV of Bacillus velezensis

1.2.6Box-Behnken響應(yīng)面試驗

根據(jù)最陡爬坡試驗結(jié)果,以γ-聚谷氨酸添加量(X1)、混合轉(zhuǎn)速(X3)和混合時間(X4)為自變量,貝萊斯芽孢桿菌的變異系數(shù)為響應(yīng)值進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗,探究變量對響應(yīng)值的影響,試驗因素和水平見表3。

表3 貝萊斯芽孢桿菌變異系數(shù)Box-Behnken試驗因素和水平Table 3 Factors and levels of the Box-Behnken test for the CV of Bacillus velezensis

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS(Statiatical product and service solution)軟件進(jìn)行分析,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

變異系數(shù)是指數(shù)據(jù)的離散程度,變異系數(shù)越低,表示數(shù)據(jù)離散程度越小[27]。就功能性育苗基質(zhì)而言,傳統(tǒng)育苗基質(zhì)中添加植物根際促生菌劑后,基質(zhì)中植物根際促生菌的變異系數(shù)越低,說明根際促生菌在育苗基質(zhì)中分布越均勻。試驗得到的4個的單因素試驗結(jié)果見圖1。

由圖1(a)可知,當(dāng)不使用載體,直接將菌粉與育苗基質(zhì)混配時,變異系數(shù)為23.0%,貝萊斯芽孢桿菌在基質(zhì)中分布極不均勻。將菌劑和載體γ-聚谷氨酸復(fù)配后再與基質(zhì)混配,隨著γ-聚谷氨酸添加量的增加,育苗基質(zhì)的變異系數(shù)呈現(xiàn)先降低后又升高的趨勢。當(dāng)γ-聚谷氨酸載體添加量為5.0 g/L時變異系數(shù)達(dá)到最低,響應(yīng)區(qū)間為3.0～7.0 g/L。

當(dāng)育苗基質(zhì)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%～30%時,變異系數(shù)隨水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而降低,水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過30%時,變異系數(shù)開始降低,響應(yīng)區(qū)間為25%～35%(圖1(b))。變異系數(shù)降低是因為γ-聚谷氨酸是由α-胺基和γ-羧基經(jīng)酰胺鍵連接構(gòu)成的同型聚酰胺,具有親水性[16],易吸潮結(jié)塊[28]。當(dāng)育苗基質(zhì)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)>30%時,含貝萊斯芽孢桿菌的γ-聚谷氨酸吸收育苗基質(zhì)中的水分形成塊狀,使菌劑無法均勻分布在育苗基質(zhì)中。

豎直線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差,不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05),圖2同。Vertical lines indicate standard deviation,different lowercase letters indicate significant differences between treatments (P<0.05).Same as Fig.2.圖1 單因素對貝萊斯芽孢桿菌變異系數(shù)的影響Fig.1 Effects of single factors on the CV of Bacillus velezensis

在確定γ-聚谷氨酸添加量和育苗基質(zhì)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的條件下,貝萊斯芽孢桿菌的變異系數(shù)是隨著混合轉(zhuǎn)速的升高先降低再趨于不變,當(dāng)轉(zhuǎn)速為35、40和45 r/min時,變異系數(shù)沒有顯著性差異,響應(yīng)區(qū)間為35～45 r/min(圖1(c))。隨著轉(zhuǎn)速的升高,單位時間內(nèi)攪拌次數(shù)提升,可加快不同物料間的相互滲透,有利于快速混合,此時物料混配為對流混合階段,易達(dá)到宏觀上的混配均勻[29];當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到35 r/min后,均勻性趨于穩(wěn)定,物料的混配進(jìn)入擴(kuò)散混合階段[30],變異系數(shù)在7%上下波動。

隨著混合時間的延長,貝萊斯芽孢桿菌的變異系數(shù)同樣表現(xiàn)為先降低后趨于穩(wěn)定,在混合5 min時變異系數(shù)達(dá)到最低值5.97%,響應(yīng)區(qū)間為4～6 min(圖1(d))。隨著混合時間的延長,變異系數(shù)不會顯著下降,而是趨于穩(wěn)定[31]。由單因素試驗結(jié)果得到最適γ-聚谷氨酸添加量為5 g/L,育苗基質(zhì)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%,混合轉(zhuǎn)速為40 r/min,混合時間為5 min。

2.2 Plackett-Burman試驗

使用Design-Expert 13.0軟件進(jìn)行N=12的Plackett-Burman試驗,各因素試驗組合下貝萊斯芽孢桿菌的變異系數(shù)結(jié)果見表4。

表4 貝萊斯芽孢桿菌變異系數(shù)Plackett-Burman試驗結(jié)果Table 4 Results of Plackett-Burman test of the CV of Bacillus velezensis

對Plackett-Burman試驗結(jié)果進(jìn)行效應(yīng)分析和方差分析,結(jié)果見表5和表6。

表6 貝萊斯芽孢桿菌變異系數(shù) Plackett-Burman試驗方差分析Table 6 CV of Bacillus velezensis Plackett-Burman test analysis of variance table

γ-聚谷氨酸添加量(X1)、混合轉(zhuǎn)速(X3)和混合時間(X4)的效應(yīng)為負(fù);育苗基質(zhì)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X2)的效應(yīng)為正(表5)。效應(yīng)值的大小表示該因素對試驗結(jié)果影響的強弱。由此可得,4個因素對模型影響的貢獻(xiàn)率依次為：X4>X3>X1>X2。對貢獻(xiàn)率較大的3因素進(jìn)行最陡爬坡試驗,其他因素根據(jù)效應(yīng)值取值,表現(xiàn)為正效應(yīng)的因素取高水平,表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)的因素取低水平。

表5 貝萊斯芽孢桿菌變異系數(shù)Plackett-Burman試驗效應(yīng)分析Table 5 Plackett-Burman test effect analysis of CV of Bacillus velezensis

表6中,模型P<0.000 1,模型模擬結(jié)果極顯著,說明模型選擇合適。各因素P值大小反映該因素對試驗結(jié)果影響的顯著程度。因此,選用X1、X3和X43個因素進(jìn)行最陡爬坡試驗,X2的效應(yīng)為正,選取其高水平,即35%。

2.3 最陡爬坡試驗

貝萊斯芽孢桿菌變異系數(shù)最陡爬坡試驗結(jié)果見圖2。試驗結(jié)果顯示出理想的先降低后增高的趨勢,在2號試驗點出現(xiàn)最低點,對應(yīng)的各因素參數(shù)取值為：γ-聚谷氨酸添加量6 g/L,混合轉(zhuǎn)速42 r/min,混合時間330 s。對應(yīng)的貝萊斯芽孢桿菌在育苗基質(zhì)中的變異系數(shù)為5.12%,該點為最陡爬坡試驗拐點,也是Box-Behnken試驗的中心點。

圖2 貝萊斯芽孢桿菌變異系數(shù)最陡爬坡試驗結(jié)果Fig.2 Results of the steepest climbing test of the CV of Bacillus velezensis

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面試驗

為得到離散元模型參數(shù)的最優(yōu)組合進(jìn)行Box-Behnken試驗,結(jié)果見表7。對試驗結(jié)果進(jìn)行回歸擬合后,得到以貝萊斯芽孢桿菌在育苗基質(zhì)中的變異系數(shù)(CV)為響應(yīng)值,γ-聚谷氨酸添加量(X1)、混合轉(zhuǎn)速(X3)和混合時間(X4)為變量的回歸方程：

表7 貝萊斯芽孢桿菌變異系數(shù)(CV)Box-Behnken試驗結(jié)果Table 7 Results of the Box-Behnken test of the CV of Bacillus velezensis

方程二次項系數(shù)為正值,表明回歸方程結(jié)果具有最小值,對回歸模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表8?；貧w方程的決定系數(shù)R2=0.987 4,表明方程擬合度較高;模型P<0.000 1,說明回歸方程極顯著,能夠描述因素與響應(yīng)值間的關(guān)系;模型失擬項P>0.05,失擬項不顯著,說明不存在其他主要因素影響響應(yīng)值。

表8 貝萊斯芽孢桿菌變異系數(shù)(CV)Box-Behnken試驗方差分析Table 8 Box-Behnken test of variance analysis of the CV of Bacillus velezensis

根據(jù)多元二次回歸方程,利用 Design-Expert 13.0軟件繪制響應(yīng)面試驗的等高線圖和響應(yīng)面圖(圖3),當(dāng)3個因素中任何一個因素保持在中心水平時,剩余兩個因素之間的相互作用對貝萊斯芽孢桿菌桿菌變異系數(shù)的影響呈現(xiàn)拋物面型,變化趨勢都是先減小后增大,且響應(yīng)面三維曲面圖均具有極小值點。采用Design-Expert 13.0分析計算,含貝萊斯芽孢桿菌的功能性育苗基質(zhì)最佳混配參數(shù)為：γ-聚谷氨酸添加量5.6 g/L,混合轉(zhuǎn)速42 r/min,混合時間333 s,此時貝萊斯芽孢桿菌的變異系數(shù)為4.51%。按照該工藝參數(shù)進(jìn)行驗證試驗,所貝萊斯芽孢桿菌的變異系數(shù)為4.59%,與預(yù)測值基本吻合,說明模型很好地預(yù)測了試驗結(jié)果。

2.5 功能性育苗基質(zhì)的理化性質(zhì)

復(fù)合貝萊斯芽孢桿菌菌劑與傳統(tǒng)育苗基質(zhì)經(jīng)混配后制備的功能性育苗基質(zhì)的理化指標(biāo)測定結(jié)果見表9。添加γ-聚谷氨酸載體和貝萊斯芽孢桿菌后,育苗基質(zhì)的容重和總孔隙度沒有顯著變化,氣孔隙度顯著降低,持水孔隙和最大持水量顯著提高,pH顯著降低,其孔隙度和pH分別降低10.82%和8.29%,持水孔隙和最大持水量分別提高5.68%和7.92%。經(jīng)優(yōu)化后的功能性育苗基質(zhì)各項理化指標(biāo)均符合NY/T 2118—2012《蔬菜育苗基質(zhì)》[32]規(guī)定。育苗基質(zhì)理化性質(zhì)的變化,是因為生產(chǎn)中將γ-聚谷氨酸作為復(fù)合貝萊斯芽孢菌菌劑的載體一同添加到育苗基質(zhì)中,γ-聚谷氨酸具有提升育苗基質(zhì)的持水性[33]、改善基質(zhì)理化性質(zhì)的作用[34]。

X1,γ-聚谷氨酸添加量,g/L;X3,混合轉(zhuǎn)速,r/min;X4,混合時間,s;Y,貝萊斯芽孢桿菌在育苗基質(zhì)中的變異系數(shù),%。X1,the addition amount of γ-polyglutamic acid,g/L;X3,the mixing speed,r/min;X4,the factor value of the mixing time,s;Y,the CV of Bacillus velezensis in the seedling matrix,%.圖3 部分交互因素影響貝萊斯芽孢桿菌變異系數(shù)的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.3 Contour map and response surface map of some interaction factors affecting the CV of Bacillus velezensis

表9 功能性育苗基質(zhì)理化性質(zhì)Table 9 Physical and chemical properties of functional seedling matrix

3 結(jié) 論

本研究采用γ-聚谷氨酸作為復(fù)合貝萊斯芽孢桿菌菌劑的載體,以貝萊斯芽孢桿菌在育苗基質(zhì)中的變異系數(shù)為指標(biāo),通過單因素試驗、響應(yīng)面優(yōu)化試驗確定了最佳功能性育苗基質(zhì)的混配工藝參數(shù)：γ-聚谷氨酸添加量為5.6 g/L,混合轉(zhuǎn)速42 r/min,混合時間333 s,此時,貝萊斯芽孢桿菌在育苗基質(zhì)中的變異系數(shù)為4.59%,小于《蔬菜功能性育苗基質(zhì)生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范》[35]中的規(guī)定值,符合對功能性育苗基質(zhì)生產(chǎn)中根際促生菌均勻性的要求。

經(jīng)優(yōu)化混配的功能性育苗基質(zhì)在容重和孔隙度方面與傳統(tǒng)基質(zhì)無差異,而γ-聚谷氨酸的添加顯著提升了基質(zhì)的持水孔隙和最大持水量,有利于增強蔬菜育苗期的抗旱性。本研究結(jié)果也是對目前多數(shù)功能性育苗基質(zhì)生產(chǎn)中采用先水溶固體促生菌菌劑后與傳統(tǒng)基質(zhì)混配工藝的補充,可有效降低功能性育苗基質(zhì)中的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù),減少芽孢的萌發(fā),提高芽孢桿菌的穩(wěn)定性,延長功能性育苗基質(zhì)的貯存時間。γ-聚谷氨酸載體的添加改善了傳統(tǒng)育苗基質(zhì)的理化性質(zhì),增強了其緩沖能力,研究結(jié)果對制備富含復(fù)合貝萊斯芽孢桿菌菌劑的功能性育苗基質(zhì)生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。