童超，劉官源

（余干縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，江西 余干 335100）

畜牧業(yè)是我國經(jīng)濟社會發(fā)展中的重要內(nèi)容，并且隨著人們生活質(zhì)量不斷提升，對于牛羊肉、禽肉、乳制品的需求量也不斷增加，因此為滿足人們生活的基本需求，則要保證我國畜牧業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展。而畜牧獸醫(yī)工作對于畜牧業(yè)的發(fā)展起到了關(guān)鍵性的作用，其能夠不斷完善防疫體系以及提高地方畜牧業(yè)生產(chǎn)力，本文則主要針對畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域的一種基因修飾技術(shù)——基因敲除技術(shù)展開研究。

1 基因敲除技術(shù)內(nèi)涵

基因敲除技術(shù)是指將生物的受體細胞基因組以及DNA（脫氧核糖核酸）之中相近或者相同的序列基因同源組合，重構(gòu)至受體細胞的基因組之中，并獲得表達的一種外源DNA 導入技術(shù)。其運作原理是：在基因的某個序列已知但功能未知的狀態(tài)之下，進一步改變生物遺傳基因的結(jié)構(gòu)，讓其能夠喪失某一種特定的功能，當此功能被屏蔽了以后，就可以對生物體造成一定的影響，便于對生物基因的生物學功能進行推測，在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域主要應(yīng)用于動物的基因修飾與模型建立。

2 畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域基因敲除技術(shù)的研究歷程與分類

2.1 研究歷程介紹

在20 世紀80 年代，基因同源重組技術(shù)和胚胎干細胞技術(shù)得到了快速的發(fā)展，在此技術(shù)之上，衍生出了基因敲除這種全新的分子生物技術(shù)。到了20 世紀90 年代，基因敲除與嵌入技術(shù)成了畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域的最新外源DNA 導入技術(shù)，而基因敲除技術(shù)也是基因打靶技術(shù)之中的一種，與基因同源重組之間有著較多的相似之處。通過該種方法可以使得基因的突變更加具有精準度和指向性，也可以糾正一些機體的基因突變問題，能夠有效解決牲畜隨機組合的盲目性以及偶然性。

2.2 技術(shù)分類解析

當前基因敲除技術(shù)主要分為兩種形式：一種是不完全性基因敲除技術(shù)，另一種則是完全性基因敲除技術(shù)。不完全性基因敲除技術(shù)是指相關(guān)技術(shù)人員通過重組與定位系統(tǒng)的方式，從而在特定的空間以及時間之內(nèi)，將基因進行敲除。當前主要的重組與定位系統(tǒng)有四種形式，分別為：Cre/LoxP 系統(tǒng)（噬菌體），Gin/Gix 系統(tǒng)，F(xiàn)LP/FRT 系統(tǒng)（酵母細胞），R/RS 系統(tǒng)。完全性基因敲除技術(shù)是指利用同源重組的方式，從而將細胞或者動物個體之中的靶基因活性完全敲除。

3 基因敲除技術(shù)在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域的具體應(yīng)用形式

3.1 基本操作步驟

在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域，通過基因敲除技術(shù)，對動物進行轉(zhuǎn)基因行為的操作流程可以參考圖1：

圖1 基因敲除操作步驟

第一步，獲得干細胞?；蚯贸夹g(shù)起初的實驗對象是鼠類，鼠品系129 及其雜合體是理想的實驗動物。通過試驗證明該種技術(shù)，對鼠品系的基因敲除技術(shù)，也可以應(yīng)用于其他畜牧動物身上，并具有良好的成效。動物的遠交系遺傳背景十分復雜，在實驗的過程中結(jié)果往往不夠理想，并且在進行基因敲除的步驟之中，由于回交次數(shù)的不同，最終結(jié)果的重復性不佳。因此，為解決制作動物模型標準不夠統(tǒng)一的情況，則要直接利用C57BL/6 ES 細胞進行基因敲除的實驗，以便可應(yīng)用于畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域工作之中動物的免疫學、神經(jīng)學研究以及疾病治療。

第二步，載體的構(gòu)建?；蚯贸妮d體是由目的基因與細胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA 分子重組帶入到標記基因載體中構(gòu)成的，在進行敲除的過程中所要實施的目的不同，因此在載體的設(shè)計上也有許多不同的設(shè)計方法，例如插入型載體或者替換性載體。依照實驗目的不同，其所要敲除的載體也分為全基因敲除、不完全基因敲除、基因敲入或者誘導性基因敲除等多種形式。

第三步，基因的導入。在基因?qū)氕h(huán)節(jié)，畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域多使用電穿孔的方式開展，雖然注射命中概率要較低一些，但便于使用。相比而言，顯微注射命中概率就會更高一些，但是難度也較大，對于技術(shù)人員的專業(yè)要求較高。而進行基因?qū)脒@一步驟的主要原因在于需要將基因敲除的載體通過以上兩種形式導入到同源的ES 細胞之中，這樣才能保證外源DNA 和ES 基因組之中的對應(yīng)部分發(fā)生反應(yīng)，通過同源重組，能夠?qū)⑤d體之中的DNA 與內(nèi)源基因組整合，從而得以表達。在篩選的過程中會利用培養(yǎng)基開展，使用方法共分為兩種形式，一是正選擇法（選擇群體中生存能力與育性較高的個體，并留下子代，擴散至整個群體中）；二是負選擇法（當群體之中出現(xiàn)了不利基因時，攜帶該種基因的個體將會在群體中淘汰），利用白喉毒素A 亞基（DTA）進行陰性篩選，然后將其導入到動物的囊胚之中，所得到的囊胚將會被植入到假孕動物的體內(nèi)，最終發(fā)育成為嵌合體動物。

第四步，性狀的改變。通過觀察嵌合體動物并加大對其生物學性狀的研究，了解動物在基因敲除以前和基因敲除以后所產(chǎn)生的變化，才能真正地獲得目的基因。當前在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域之中的牛、羊、豬等大型哺乳類動物身上，利用此種方法，均能夠改善動物的基因，但犬類的生殖以及生理特點較為特殊，因此需要通過自體移植的方式，從而解決犬類的基因敲除問題。

3.2 動物模型建立

通過對鼠類的測試，使得大型的畜牧哺乳類動物和家禽類等在基因敲除方面有了重大的突破，并且通過對相關(guān)動物的生物學性狀與機理進行觀察，發(fā)現(xiàn)與人類的遺傳性疾病也有著許多的相似之處。例如：在對In-certi 敲除小鼠OA1 的實驗之中，據(jù)觀察發(fā)現(xiàn)，小鼠的眼球底部存在黑色素不足的情況，這與其他動物和人類的眼白化病1 型發(fā)病機制有著較強的相似性，因此在后期的實驗過程中可對動物基因之中的此部分進行敲除，建立一個機能較好，并且少有遺傳性疾病的動物模型。在進行實驗的過程中還發(fā)現(xiàn)通過對實驗體的LDL 受體以及載脂蛋白E 基因進行敲除，能夠有效解決動物的早期心臟病問題，應(yīng)用于畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域之中，能夠進一步提升動物模型建立的質(zhì)量。

3.3 功能基因組學的研究

就功能基因重組方面而言，通過相關(guān)實驗以及文獻資料表明，對動物的P53 以及P21 基因進行敲除，最終所建立的模型能夠起到調(diào)節(jié)細胞周期的作用，不僅如此，還可以對克隆的細胞實現(xiàn)修復作用，因此應(yīng)用于相關(guān)畜牧動物的身上，可以提高動物的代謝能力，減少疾病的出現(xiàn)。部分畜牧動物由于長期的勞作以及所處生長環(huán)境較為復雜，提前出現(xiàn)了衰老的跡象，這也使得所飼養(yǎng)動物的經(jīng)濟價值降低，并且也為獸醫(yī)的防疫工作提高了難度。然而，在實驗的過程中發(fā)現(xiàn)，導致這一問題出現(xiàn)的基因為K1，在重組的過程中則可以通過ApoE（載脂蛋白E）培育轉(zhuǎn)化出生長因子B1 基因動物的方式，從而有效調(diào)節(jié)動物的淋巴細胞增生能力，強化動物的基因質(zhì)量，進一步推動地方畜牧業(yè)生產(chǎn)力的提升。

3.4 藥理學的研究

在藥理學之中應(yīng)用基因敲除技術(shù)的主要原因在于，動物的基因以及所處的生長環(huán)境不同，即便是處于同一生長環(huán)境之內(nèi)，當出現(xiàn)疾病時，獸醫(yī)治療的效果也是具有差異的，而為了能夠提高治療與防疫工作的實效性，可以尋求新的治療方法，需要將基因敲除技術(shù)與藥理學進行研究，從而對動物的基因狀況進行改善，使得動物能夠充分吸收藥物，快速痊愈。例如：在檢查的過程中許多動物的身上都存在寄生蟲，通過CRISP/Cas 基因敲除技術(shù)，則能夠進一步抑制動物身上的寄生蟲生長，并且對于弓形蟲的感染有著顯著的治療效果。

3.5 免疫學的研究

無論是對于人類還是動物而言，其免疫系統(tǒng)是重要的機體執(zhí)行模塊，就畜牧領(lǐng)域的動物來說，對其所處的生長環(huán)境不能進行統(tǒng)一調(diào)控，很大程度上會受到經(jīng)濟、氣候等客觀因素的影響，因此只有保證動物的免疫系統(tǒng)穩(wěn)定，才能夠從根本上減少瘟疫和疾病類問題的出現(xiàn)。在此過程中也可以參照人類的免疫系統(tǒng)，對所養(yǎng)殖動物的免疫系統(tǒng)進行修復，從而最大程度地優(yōu)化動物基因。例如：相關(guān)研究人員在實驗的過程中，對實驗體的K 青鏈恒定區(qū)CK 進行了基因敲除，并利用人體基因之中的CK 基因片段對其進行重構(gòu)，結(jié)果在純合體檢測中，B 淋巴細胞內(nèi)便出現(xiàn)了人的CK 抗體，進一步提高了動物的免疫系統(tǒng)抵御能力。

3.6 疾病預防治療

不同動物的生理構(gòu)造不同，因此在患病時，有許多動物存在特殊病狀，有時很難在防疫的過程中達到預防和及時治療的效果，此時可通過基因敲除技術(shù)解決相關(guān)問題。例如：在相關(guān)實驗之中，小鼠很容易感染朊病毒，而通過對其Prion 基因進行敲除，有效改善了小鼠感染朊病毒的情況，并且也不存在其他的副作用。因此就畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域而言，可以通過基因敲除技術(shù)，來解決部分動物所存在的特殊病狀問題，這樣不僅可以提高該種動物的生長質(zhì)量，還可以提升地方動物防疫水平。

4 畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域利用基因敲除技術(shù)應(yīng)用案例分析

當前基因敲除技術(shù)在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用不僅起到了預防動物出現(xiàn)大規(guī)模疾病和改善動物基因的作用，還被廣泛應(yīng)用于對特定動物種類進行擴繁養(yǎng)殖，其不僅能夠提高地方畜牧業(yè)的經(jīng)濟收入，改善農(nóng)民的生活質(zhì)量，還能夠以新農(nóng)村建設(shè)為基點，創(chuàng)建地方畜牧業(yè)特色，使畜牧動物能夠充分適應(yīng)當?shù)丨h(huán)境。

4.1 技術(shù)應(yīng)用的動因

以我國西北部欠發(fā)達地區(qū)畜牧業(yè)之中常出現(xiàn)的羊的擴繁問題為例，像寧夏等地區(qū)由于民族變遷史較為復雜，加之所處地理環(huán)境，則多以半農(nóng)半牧為主，而灘羊就是該地常見的畜牧品種之一。灘羊的特點是在尾部積有大量的脂肪，而這也進一步影響到了羊肉的質(zhì)量以及其繁殖能力，但由于灘羊肉的風味獨特，并且膻味較淡，且裘毛皮具有柔韌性較強以及保暖性較高的特點，具有較高的經(jīng)濟價值。因此，為能夠改善灘羊基因所存在的體格較小、生長發(fā)育遲緩以及繁殖能力較低等問題，可以通過基因敲除的方式，改善灘羊的基因，加快其繁殖效率，培養(yǎng)出體型較大、繁殖質(zhì)量較高的品種，推動地方畜牧業(yè)的發(fā)展，改善地方牧民經(jīng)濟收入水平。

4.2 實驗材料與方法

在進行實驗以前，需要根據(jù)地方羊基因改良目標以及實驗體的特點選定敲除的方式，因此此種基因敲除技術(shù)具有較強的目的性，采用了條件性定點敲入的方式，來改變?yōu)┭虻男誀?。其實驗的材料分別為：①試驗羊群。選擇當?shù)氐囊粋€繁殖場，并分為實驗組以及對照組，主要選擇的對象為具有繁殖能力的母羊，而在配種上則可以選擇MSTN 基因敲除突變較為優(yōu)質(zhì)的公羊，例如M1500451、M1721、M172011 等。②實驗設(shè)備主要有以下幾種：生物顯微鏡、電子天平、電熱鼓風干燥箱、水浴鍋、冰箱、高壓蒸汽滅菌器、羊用假陰道等。③在試劑的選擇上主要有氯前列醇鈉、孕馬血清促性腺激素、青霉素等。

所采用的實驗方法是先利用公羊母羊進行試情分類，然后進行分析處理與分類，并進行誘導發(fā)情，具體的數(shù)據(jù)信息可參考表1 內(nèi)容。

表1 試情、母羊發(fā)情情況

表中“248”表示自然發(fā)情的母羊總數(shù)；“287”為試情母羊總數(shù)；發(fā)情周期不正常與不發(fā)情的母羊總共有39 只；兩次誘導發(fā)情測試以后發(fā)情的母羊共有27 只。

4.3 實驗結(jié)果與分析

在經(jīng)過了第一次和第二次的誘導發(fā)情以后，最終共有275 只母羊發(fā)情，占最終發(fā)情母羊比例的95.82%，而在測試過程中仍有4.18%的母羊存在不發(fā)情的情況，出現(xiàn)這種情況可能是母羊自身基因問題和營養(yǎng)不良等情況所導致的，因此為能夠進一步節(jié)約成本和實踐經(jīng)歷，則建議在選定與重組的過程中淘汰此類母羊。并且基因敲除的陽性羊為72只，而其中有4 只的MSTN 基因敲除公羊后代的陽性占比均可以超過30%，而雜合體公羊的后代更具有增殖和快速生長的優(yōu)勢，因此在擴繁的過程中采用MSTN 基因敲除的灘涂羊個體陽性后代比陰性后代更有優(yōu)勢。

5 結(jié)語

綜上所述，基因敲除技術(shù)是人類在20 世紀最偉大的發(fā)明之一，其克服了原有的牲畜隨機整合的盲目性以及偶然性，能夠從根本上解決部分畜牧牲畜所存在的基因疾病、適應(yīng)能力差、繁育能力低等問題，對于提高地方的畜牧業(yè)生產(chǎn)力起到了關(guān)鍵性的作用。當前由于我國在畜牧獸醫(yī)方面的高質(zhì)量復合型技術(shù)人才缺口較大，此項技術(shù)還未被普遍應(yīng)用，在未來其傳播以及推廣也是重點工作之一。