陳家歡，李丹丹，孫 艷，王藝蕾，王 鐸，孔 杰，劉曉玲*

1.中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室，北京 100005；2.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院 檢驗科，北京 100730；3.長治醫(yī)學院，山西 長治 046000

某些組織、細胞容易被波長488 nm激光器激發(fā)而產(chǎn)生自發(fā)熒光,其發(fā)射光譜通常對異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)通道產(chǎn)生干擾[1-2],降低該通道的信噪比。流式細胞術(flow cytometry)主要通過采集熒光信號來解讀生物學信息,自發(fā)熒光作為額外的熒光信號在傳統(tǒng)流式細胞儀上不易被分析,從而影響流式結果。凋亡經(jīng)常會導致FITC通道背景熒光增強。膜聯(lián)蛋白V(annexin V,AV)聯(lián)合碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色是一種廣泛應用的流式檢測細胞凋亡的經(jīng)典方法。因此本研究以凋亡作為模型研究自發(fā)熒光在不同流式細胞儀檢測的異同。

流式細胞儀的配置是影響流式數(shù)據(jù)分辨率和準確性的關鍵因素。近幾年推出的全光譜流式細胞儀(spectral flow cytometers)可將自發(fā)熒光作為一種單獨的熒光信號來解析[3-4]。本研究旨在比較傳統(tǒng)和光譜流式細胞儀對自發(fā)熒光樣本凋亡數(shù)據(jù)解析的差異,同時為研究細胞凋亡提供方法學的參考,提高實驗效率及其數(shù)據(jù)的準確性。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝腹水腺癌細胞系(SK-hep-1)、RPM1640培養(yǎng)基、胎牛血清、0.05%胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液、青鏈霉素(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心)。FITC或別藻藍素(allophycocyanin,APC)標記的annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒(BioLegend公司)。

1.2 方法

1.2.1 單細胞懸液制備:細胞匯合度達 80%～90%時進行單細胞制備(6 cm培養(yǎng)皿)。

方法一:1)去除上清,吸取2 mL 1×PBS加入培養(yǎng)皿中,潤洗整個培養(yǎng)皿細胞,重復洗滌1次;2)培養(yǎng)皿中加 0.5 mL胰蛋白酶消化液,37 ℃消化2 min,加1.5 mL RPMI 1640完全培養(yǎng)基終止消化;3)2 mL PBS洗滌一次,重懸細胞。

方法二:與方法一相比,僅2)步有兩個不同,一是胰蛋白酶消化液用量由0.5 mL增加至2 mL;二是吸棄胰蛋白酶消化液,再補加2 mL RPMI 1640 的完全培養(yǎng)基。

1.2.2 熱激誘導凋亡:65 ℃水浴鍋,分別0、1、2、3、5和8 min熱激分裝好的細胞,混合所有細胞,離心去上清,重懸并按照每管5×105個/400 μL均分細胞(即1.25×106個/mL)。

1.2.3 Annexin V/PI 染色:1)根據(jù)說明書建議分別將2.5 μL annexin V和5 μL PI加入到細胞懸液中,室溫避光孵育15 min,上機檢測。2)采用優(yōu)化后的annexin V/PI染色方案,染色后樣本分為兩組,一組直接上機檢測;一組離心洗滌,棄上清后,上機檢測。

1.2.4 流式細胞術檢測凋亡:傳統(tǒng)流式細胞儀: C6 plus,帶通濾光片配置為533/30 nm,585/40 nm, 675/25 nm;Cytoflex,帶通濾光片配置為525/40 nm,585/42 nm,660/10 nm,對應檢測熒光素為FITC、PI、APC。但Cytoflex具有顯示自發(fā)熒光的功能。光譜流式細胞儀:SA 3800:前側向信號與熒光信號合計共可同時采集34個通道信號并且可以生成不同亞群自發(fā)熒光光譜。SA3800采集420～800 nm的光譜信號,其405 nm、640 nm激光器共線,488 nm、561 nm激光器共線。Cytek Aurora:5激光64通道,可以檢測420～830 nm波長的光譜,無共線激光器。數(shù)據(jù)分析軟件:各流式細胞儀自帶軟件及Flowjo_V10.8.1。

2 結果

2.1 優(yōu)化annexin V/PI染色方案

按照說明書推薦annexin V用5 μL,PI用10 μL,室溫孵育15 min,Cytek Aurora檢測發(fā)現(xiàn)熒光素FITC和PI光譜最高峰的平均熒光強度MFI(mean fluorescence intensity)超過Y軸高限(圖1A)。優(yōu)化條件后annexin V 1.25 μL室溫孵育15 min后加入PI 0.5 μL即刻上機,并將Cytek Aurora電壓參數(shù)設定為儀器自動優(yōu)化后的10%,全部熒光信號均在儀器的檢測范圍內(nèi)(圖1B)。該條件下,傳統(tǒng)流式細胞儀也可獲得良好檢測結果。后續(xù)實驗均采取此方案。

AV-FITC.annexin V-FITC; A.the full spectrum signal maps of SK-hep1 cells under cytek normal assay setting; B.the full spectrum signal maps of SK-hep1 cells under 10% of cytek normal assay setting; X-axis was the detectors on the Aurora.With these detectors, the fluorescent signal between 320 nm and 808 nm was detected; Y-axis was the mean fluorescence intensity(MFI) about a given antigen in different detectors

2.2 單細胞制備過程會產(chǎn)生自發(fā)熒光

圖2A(方法一制備)的前側向散點圖比2B(方法二制備)多出一個明顯的細胞群。利用SA3800自發(fā)熒光探測器分析發(fā)現(xiàn)該群內(nèi)有自發(fā)熒光(圖2C B群細胞):光譜拆分各群,得到它們的全光譜圖,經(jīng)過疊加,發(fā)現(xiàn)C、E、F細胞群光譜形狀一致,C群細胞僅熒光信號略強,B、D群光譜形狀與C、E、F存在顯著差異,進一步證明D群內(nèi)存在可產(chǎn)生自發(fā)熒光的細胞群B。Cytoflex分析也發(fā)現(xiàn), FITC通道自發(fā)熒光本底相對較高,校正后,二維流式圖呈現(xiàn)典型的橫平豎直狀態(tài)(圖2D)。

A.dead cell populations on the left side of 2D FSC-SSC scatter plots were observed when single cell populations prepared by the first method; B.there was only one distinct cell population when single cell populations prepared by the second method; C.full spectrum signal maps of every gate and spectral overlay diagram (red arrows: auto-fluorescent cell populations); D.auto-fluorescence was shown by Cytofle

2.3 傳統(tǒng)流式細胞儀分析自發(fā)熒光樣本FITC-annexin V/PI染色相對困難

由于FITC與PI發(fā)射光譜重疊,所以傳統(tǒng)流式細胞儀利用FITC-annexin V/PI檢測凋亡和壞死細胞,在分析數(shù)據(jù)前需要先進行補償校正。圖3A、3B分別為C6 plus和Cytoflex針對同一樣本采集分析數(shù)據(jù)的結果。因為有自發(fā)熒光的存在,僅用FITC和PI單染樣本校正補償,C6 plus達不到補償最佳狀態(tài)“橫平豎直”的效果,而Cytoflex因為有自發(fā)熒光的去除功能,故表現(xiàn)相對更好。此外,兩臺流式細胞儀由于原理的不同,Cytoflex用H信號,C6 plus用A信號作圖的效果好。

A.C6 plus;B.Cytoflex

2.4 傳統(tǒng)流式細胞儀分析自發(fā)熒光樣本APC-annexin V/PI染色相對容易

理論上APC與PI發(fā)射光譜無重疊,所以傳統(tǒng)流式細胞儀利用APC-annexin V/PI檢測凋亡壞死細胞,無需補償校正。C6 plus(圖4A)和Cytoflex(圖4B)都可以清楚地辨析各個細胞群。但是Cytoflex效果更好,表現(xiàn)為PI單染組未向右偏移。

A.C6 plus;B.Cytoflex

2.5 光譜流式細胞儀分析自發(fā)熒光樣本FITC或APC標記annexin V/PI染色結果良好

無論是5激光配置的Cytek Aurora還是激光器共線的SA3800,不僅可以清楚的辨析APC-annexin V/PI凋亡和壞死細胞群,同時可以很好的進行FITC-annexin V/PI 凋亡壞死染色分群(圖5)。

A.SA3800; B.Cytek Aurora

2.6 離心洗滌過程增加annexin V-PI+單陽細胞群和annexin V+PI+雙陽細胞群比例

雖然凋亡試劑盒說明書建議染料加完后,不洗滌直接上機檢測,但是有很多實驗者還是習慣將離心洗滌去除多余染料后再上機檢測,本研究做了對比研究,發(fā)現(xiàn)離心洗滌后上機檢測,PI+陽性細胞群比例均升高(圖6)。

A.FITC-annexin V/PI;B.APC-annexin V/PI

3 討論

流式細胞術通過采集樣本的熒光信號來解讀生物學信息,樣本自發(fā)熒光的存在,會降低傳統(tǒng)流式細胞儀在FITC通道的分辨率。annexin V-FITC和PI染色是流式細胞術檢測細胞凋亡的經(jīng)典方法。傳統(tǒng)流式細胞儀難于分辨自發(fā)熒光和FITC通道熒光素,在檢測細胞凋亡時建議優(yōu)先選擇APC-annexin V/PI染料,避免使用FITC通道熒光素。而全光譜流式細胞儀,即便選用FITC熒光素也可以很好地區(qū)分自發(fā)熒光、FITC熒光素和PI。分析原因一是光譜流式分析儀可以采集熒光素的全光譜信息,并可將自發(fā)熒光作為一種獨立的熒光信號進行光譜拆分,與傳統(tǒng)流式相比,不僅信號采集更全面,與補償校正相比,光譜拆分是一種無監(jiān)督聚類算法,拆分混合熒光信號中各熒光素獨立表達強度和儀器背景噪音,可減少人為因素的干擾[5-6]。二是這兩臺儀器都配備561 nm激光器,FITC和PI分別用不同的激光器激發(fā),降低了這兩個染料之間的相互干擾,整體降低了實驗的難度。如果傳統(tǒng)流式細胞儀配備有獨立排布的561nm激光器,PI染料用561 nm激光器激發(fā),FITC/PI之間的補償會相對減少,甚至沒有,也可能得到清晰分群的結果,由于本實驗室不具備配有561 nm激光器的傳統(tǒng)流式細胞分析儀,該部分內(nèi)容并沒有得以驗證。

此外,本研究提示樣本自發(fā)熒光的產(chǎn)生與細胞消化方式有直接關系,忽略樣本制備的細節(jié)操作可能導致產(chǎn)生自發(fā)熒光,對結果干擾較大,為實驗者敲響了警鐘!同時,發(fā)現(xiàn)離心洗滌后PI+陽細胞群比例升高,annexin V+/PI+和annexin V+/PI-分群更加清楚,可能與離心降低了細胞的活性有關。

綜上所述,流式細胞術需要綜合考慮儀器配置、樣本特性以確定最優(yōu)熒光素組合方案,分析時亦可嘗試不同的數(shù)據(jù)表現(xiàn)形式以達到最佳檢測效果。對于有自發(fā)熒光的樣品,首選全光譜流式細胞儀,在無光譜流式細胞儀的條件下,盡可能選擇具有自發(fā)熒光顯示功能的傳統(tǒng)流式細胞儀。本研究為具有自發(fā)熒光樣品獲得良好流式細胞術結果提供了方法學的參考,對于提高其數(shù)據(jù)的準確和可靠性,具有重要的意義。