國 鴿，劉春蕾

中國人民解放軍總醫(yī)院 醫(yī)學(xué)創(chuàng)新研究部 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100853

蛋白質(zhì)磷酸化的發(fā)現(xiàn)至今已有百年歷史,這種蛋白質(zhì)的修飾形式能夠關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的多種功能,例如控制細(xì)胞的增殖、分化及對外界刺激的反應(yīng)。組氨酸的磷酸化由組氨酸激酶(histidine kinase)催化完成,其去磷酸化的過程由組氨酸磷酸酶(histidine phosphatase)介導(dǎo)。1962年首次在牛線粒體中發(fā)現(xiàn)組氨酸磷酸酶,但直到2000年左右研究人員才重新重視起磷酸組氨酸的生物學(xué)功能。對磷酸組氨酸的文獻(xiàn)研究也逐漸從原核生物、真菌和植物過渡到哺乳動物的信號傳導(dǎo)過程。組氨酸磷酸酶參與調(diào)控多種生物學(xué)過程,其水平異常也會導(dǎo)致許多臨床疾病的發(fā)生。本文將分別從組氨酸磷酸酶的組成、組氨酸磷酸酶與臨床疾病的聯(lián)系,以及新建立的組氨酸磷酸酶活性檢測技術(shù)作一簡要綜述。

1 組氨酸磷酸酶

組氨酸磷酸酶共有3種, 分別是磷酸化磷酸組氨酸無機(jī)焦磷酸磷酸酶(phospholysine phosphohistid-ine inorganic pyrophosphate phosphatase, LHPP)、14 ku磷酸組氨酸磷酸酶(phosphohistidine phosphatase 1,PHPT1)和磷酸甘油酸變位酶家族5(phosphoglyce-rate mutase family 5, PGAM5)。LHPP主要在大腦、腎臟和肝臟中表達(dá),其特異性底物尚未確定[1];PHPT1是一種胞質(zhì)蛋白,主要在心臟和骨骼肌中的表達(dá)量高,其磷酸酶底物包括四聚體鈣激活鉀通道(Ca2+-activated K channels, KCa3.1)、新型Ca通道(transient receptor potential vanilloid 5,TRPV5)、ATP-檸檬酸裂解酶(ATPcitrate lyase, ACL)、鳥嘌呤核苷酸的調(diào)節(jié)蛋白β-亞單位(β-subunit of heterotrimeric G protein, Gβ);PGAM5是一種線粒體膜蛋白磷酸酶,定位于線粒體的內(nèi)膜、外膜和細(xì)胞質(zhì)中,其唯一底物是核苷二磷酸激酶B (nucleoside diphosphate kinase B,NDPK-B)。

2 組氨酸磷酸酶與疾病

組氨酸的磷酸化改變參與多種生物學(xué)過程調(diào)控。組氨酸磷酸酶的表達(dá)或活性異常會引發(fā)生物功能紊亂,進(jìn)而引起相關(guān)的疾病。

2.1 組氨酸磷酸酶與腫瘤

LHPP是一種腫瘤抑制因子,其表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。宮頸癌是常見的直接影響女性健康的惡性腫瘤[2],與相鄰正常組織相比,人宮頸癌腫瘤組織中LHPP表達(dá)顯著降低。LHPP高表達(dá)有助于降低宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[3]。不僅是宮頸癌,在多種腫瘤疾病中,LHPP均可減緩癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。胰腺癌是最常見的胰腺腫瘤,惡性程度極高。在胰腺癌中,LHPP能夠抑制腫瘤的增殖、遷移和侵襲并增加細(xì)胞凋亡,LHPP表達(dá)下調(diào)具有致癌作用[4]。肝癌的發(fā)病率和病死率都很高。在肝癌中,LHPP高表達(dá)降低了腫瘤負(fù)荷,并同時(shí)降低肝臟損傷相關(guān)的血清學(xué)指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)的表達(dá)。LHPP在腫瘤中的保護(hù)作用機(jī)制,主要涉及Akt, TGF-β等相關(guān)信號通路。LHPP通過抑制TGF-β/smad信號通路抑制肝內(nèi)膽管癌的發(fā)生[5]。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中,LHPP通過下調(diào)Akt和Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮腫瘤抑制作用[6],并且LHPP的表達(dá)量與患者的中位生存期相關(guān),LHPP高表達(dá)有助于改善膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后。在膀胱癌中,LHPP通過滅活的AKT/p65信號通路抑制膀胱癌細(xì)胞增殖[7]。

PHPT1對維持正常細(xì)胞穩(wěn)態(tài)起重要作用,它的表達(dá)失調(diào)與疾病的發(fā)生密切相關(guān)。PHPT1在肝癌細(xì)胞中表達(dá)量升高,利用特異性小干擾RNA抑制PHPT1后,部分抑制細(xì)胞的增殖。PHPT1對HepG2和SMMC7721細(xì)胞的刺激作用表明PHPT1基因可能是直接或間接控制細(xì)胞增殖的生長啟動子基因,這些基因的產(chǎn)物調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化,從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展,說明PHPT1在肝細(xì)胞癌中可能起到腫瘤啟動子的作用。PHPT1異常表達(dá)參與腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動和腫瘤的轉(zhuǎn)移。在肺癌細(xì)胞中,干擾PHPT1后抑制腫瘤的遷移和侵襲。PHPT1對腫瘤細(xì)胞運(yùn)動的影響與細(xì)胞運(yùn)動的一種重要結(jié)構(gòu)細(xì)胞層狀偽足形成密切相關(guān),通過調(diào)節(jié)肌動蛋白介導(dǎo)細(xì)胞骨架重排,從而影響肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[8]。另外,在腎透明細(xì)胞癌患者中,PHPT1高表達(dá)與腫瘤大小的增加及患者的預(yù)后不良相關(guān)[9]。

PGAM5是線粒體自由基線粒體降解的調(diào)節(jié)因子[10]。結(jié)直腸癌患者的PGAM5表達(dá)水平顯著降低[11],而活化PGAM5則可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡,進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌[12]。在前列腺癌患者中,PGAM5以復(fù)合物Bax-PGAM5-LDrp1的形式存在,通過增加癌細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。PGAM5誘導(dǎo)細(xì)胞抑癌因子Bax激活和Drp1去磷酸化,若將PGAM5敲除后抑制Bax向線粒體的易位和降解,進(jìn)而抑制前列腺癌細(xì)胞的凋亡。

2.2 組氨酸磷酸酶與代謝疾病

棕色脂肪細(xì)胞因含有大量線粒體,以產(chǎn)熱的形式消耗能量[13],是預(yù)防和治療肥胖癥的重要靶標(biāo),PHPT1參與調(diào)控棕色脂肪細(xì)胞的分化過程。在棕色細(xì)胞分化的早期PHPT1迅速降低并在后期恢復(fù),PHPT1降低促進(jìn)棕色脂肪細(xì)胞的分化,PHPT1增加抑制棕色脂肪細(xì)胞的分化。這一作用使其有望成為治療肥胖等相關(guān)代謝病的治療靶點(diǎn)[14]。另外,PGAM5可通過抑制解偶聯(lián)蛋白1的表達(dá)抑制棕色脂肪細(xì)胞的能量消耗[15]。PGAM5敲除會刺激脂質(zhì)消耗,抑制棕色脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)積累。

組氨酸磷酸酶可促進(jìn)脂肪細(xì)胞葡萄糖氧化,適當(dāng)水平的組氨酸磷酸酶可維持血糖穩(wěn)定。胰島素是人體內(nèi)唯一能降低血糖的激素,由胰島β細(xì)胞分泌。胰島β細(xì)胞的生物學(xué)調(diào)控在葡萄糖穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用。PHPT1 在正常胰島β細(xì)胞中有調(diào)節(jié)血糖的作用,胰島β細(xì)胞中PHPT1表達(dá)水平改變與血糖異常有關(guān),Phpt1敲除小鼠表現(xiàn)出新生兒高胰島素血癥性低血糖。Phpt1敲除小鼠中,其激活瞬時(shí)受體電位通道受損,Ca2+內(nèi)流減少,AMPK下游激活受損,使KATP通道到質(zhì)膜的轉(zhuǎn)移受損,胰島β細(xì)胞中KATP通道缺陷誘導(dǎo)小鼠新生兒低血糖。與PHPT1作用不同,Pgam5敲除小鼠對嚴(yán)重的代謝性疾病具有抵抗性,抑制PGAM5能夠改善糖尿病損傷[16]。

2.3 組氨酸磷酸酶與心臟疾病

組氨酸激酶NDPK-B與組氨酸磷酸酶PHPT1共同調(diào)節(jié)組蛋白磷酸化,是一種類似蹺蹺板的動態(tài)過程,與調(diào)節(jié)心肌收縮力相關(guān)。NDPK-B /PHPT1能夠調(diào)節(jié)底物KCa3.1、TRPV5、Gβ相關(guān)組氨酸殘基(His)的磷酸化和去磷酸化,磷酸化組氨酸通過影響心肌細(xì)胞中cAMP的形成,參與心臟收縮力的調(diào)節(jié)。在新生大鼠心肌細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá)NDPK-B可以使Gαs-腺苷酰環(huán)化酶(adenylate cyclase,AC)依賴性激活增強(qiáng),進(jìn)而增加心肌細(xì)胞的收縮力。另外,NDPK-B/Gβγ復(fù)合物通過His266處G蛋白亞基磷酸化,使G蛋白受體非依賴性激活,對胚胎早期心臟收縮力的形成至關(guān)重要。心力衰竭時(shí)心肌細(xì)胞中發(fā)生復(fù)雜的重塑過程,G蛋白信號傳導(dǎo)的變化是這種重塑過程的標(biāo)志。心力衰竭中NDPK-B /PHPT1調(diào)節(jié)異常,使Gα介導(dǎo)的AC活化降低,cAMP信號傳導(dǎo)的改變導(dǎo)致關(guān)鍵心臟Ca2+處理蛋白的磷酸化減少,是心衰疾病中心室收縮性降低的重要原因。另外,PHPT1能夠?qū)Ca3.1通道中His358位點(diǎn)去磷酸化[17]。KCa3.1通道中His358的磷酸化對血管平滑肌細(xì)胞增殖至關(guān)重要。血管平滑肌細(xì)胞增殖是動脈粥樣硬化和血管再生的重要標(biāo)志。因此,通過激活PHPT1抑制KCa3.1,可能在血管增生性疾病中提供有意義的臨床效果[18]。此外,PHPT1還與調(diào)節(jié)心律失常相關(guān),在心律失常性右心室心肌病患者中發(fā)現(xiàn)NDPK-B和KCa3.1通道表達(dá)上調(diào),細(xì)胞自律性增加,心律失常發(fā)生率增加。重組NDPK-B心肌干細(xì)胞可增強(qiáng) KCa3.1通道電流、細(xì)胞自律性和心律失常的發(fā)生,PHPT1阻止了NDPK-B的效應(yīng),單獨(dú)使用PHPT1能夠減少心律失常疾病的發(fā)生[19]。

此外,LHPP與嚴(yán)重抑郁障礙、酒精依賴和危險(xiǎn)行為有關(guān)[20]。PGAM5是實(shí)驗(yàn)性肺纖維化中線粒體功能障礙的關(guān)鍵驅(qū)動因素,在肺纖維化形成過程中起重要作用[21]。在神經(jīng)退行性疾病帕金森病模型中,STAT5-PGAM5-Drp1信號傳導(dǎo)破壞,導(dǎo)致線粒體受損、ATP 產(chǎn)生不足和過度氧化應(yīng)激積聚。STAT5- PGAM5- LDrp1復(fù)合物激活神經(jīng)元中的線粒體裂變以穩(wěn)定線粒體平臺,是構(gòu)成神經(jīng)保護(hù)的重要機(jī)制[22]。PGAM5還可通過調(diào)節(jié)線粒體動力學(xué)來調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老[23]。

3 組氨酸磷酸酶活性相關(guān)的檢測新技術(shù)

磷酸化組氨酸在相對溫和條件下不穩(wěn)定性,而且缺乏特異性抗體和保存、檢測方法導(dǎo)致對組氨酸磷酸化酶的研究嚴(yán)重滯后。近年來,隨著相應(yīng)的檢測技術(shù)逐漸增多,對組氨酸磷酸酶研究的越來越多。目前新建立的檢測磷酸酶活性的技術(shù)主要包括:1)利用小分子底物來監(jiān)測體外磷酸酶的活性。小分子底物常被用來監(jiān)測體外磷酸酶的活性。雖然不能像磷酸化組氨酸的蛋白質(zhì)或者多肽那樣代表組氨酸磷酸酶的生物底物,但它們能夠提供更簡便和靈敏的方法。6,8-二氟-4-甲基傘形基磷酸酯(6,8-Difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate,DiFMUP)是一種磷酸酪氨酸模擬分子,其熒光在磷酸化后會淬滅。去磷酸化后,DiFMUP變?yōu)閺?qiáng)熒光。因此,DiFMUP可作為監(jiān)測組氨酸磷酸酶活性的底物,用于測定組氨酸磷酸酶的活性。2)設(shè)計(jì)熒光探針用于檢測組氨酸磷酸酶。最新發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)合成熒光探針可用于檢測組氨酸磷酸酶的活性。Sox-H4P探針的合成方法為Sox修飾后獲得Sox-H4修飾肽,將Sox-H4與合成氨基磷酸鉀在pH8的磷酸緩沖液中共孵育獲得Sox-H4P。隨后通過HPLC純化,LCox-MS/MS分析驗(yàn)證Sox和磷酸化組氨酸的有效性。利用這個(gè)探針,可連續(xù)測量細(xì)胞裂解物中組氨酸磷酸酶活性,探針對PHPT1表現(xiàn)出極好的敏感性和特異性。此方法較過去更靈敏,可以更方便的獲得組氨酸磷酸酶朝向磷酸化組氨酸底物的動力學(xué)參數(shù)[24]。另外,正在開發(fā)新的方法用來探測組氨酸磷酸化蛋白質(zhì)組并確定其功能結(jié)果,包括負(fù)離子模式質(zhì)譜分析和非天然氨基酸摻入等。這些新的工具和策略有可能克服細(xì)胞生物學(xué)中對磷酸化組氨酸理解的阻礙。

4 問題與展望

組氨酸磷酸化在疾病中的作用已逐漸得到重視。組氨酸磷酸酶的異常表達(dá)在腫瘤、代謝性疾病中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。一方面,可作為疾病診斷的指標(biāo),對臨床疾病的預(yù)防和診斷起到提示作用。另一方面,可為相關(guān)疾病干預(yù)提供新思路。由于影響疾病發(fā)生發(fā)展的因素眾多,未來研究還需要聚焦組氨酸磷酸化與臨床疾病的關(guān)聯(lián),特別是明確其中關(guān)鍵的通路和靶點(diǎn),以利于更好的靶點(diǎn)治療,開發(fā)相關(guān)酶與蛋白的抑制劑或激動劑以更好的為臨床轉(zhuǎn)化服務(wù)。同時(shí),還要積極研究未知的組氨酸磷酸酶、創(chuàng)新相關(guān)檢測技術(shù),開發(fā)更為快捷的磷酸酶活性檢測技術(shù)。相信隨著對組氨酸磷酸酶開展研究的增加,對組氨酸磷酸酶作用機(jī)制的進(jìn)一步探索,對組氨酸磷酸酶檢測技術(shù)的更新,組氨酸磷酸酶在將來的一系列醫(yī)學(xué)未知領(lǐng)域中將會有新的應(yīng)用前景。