常薇薇，李勛凱，張祝琴，陳厚早，劉德培

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京 100005

細(xì)胞呼吸通過一系列化學(xué)反應(yīng)將葡萄糖分解產(chǎn)生大量三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)和還原電子載體還原型輔酶Ⅰ(nicokinamide adenine dinucleotide, reduced, NADH)和還原黃素腺嘌呤二核苷酸(flavine ademine dinucleotide, reduced,FADH2)為細(xì)胞供能[1-2]。細(xì)胞呼吸過程同時(shí)也產(chǎn)生過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2),其水平受到生物體內(nèi)氧化還原系統(tǒng)的控制[3]。內(nèi)源性H2O2是細(xì)胞內(nèi)重要的信號分子,但其是否可以反饋調(diào)節(jié)細(xì)胞呼吸目前依舊未知。

生物鐘是生物體為了適應(yīng)環(huán)境節(jié)律性變化而進(jìn)化出的保守內(nèi)在計(jì)時(shí)機(jī)制,調(diào)節(jié)細(xì)胞呼吸等多種細(xì)胞功能。其核心分子晝夜節(jié)律運(yùn)動(dòng)輸出周期蛋白(circadian locomalor output cycles kaput,CLOCK)缺失會導(dǎo)致肝臟和肌肉線粒體呼吸鏈?zhǔn)軗p或ATP合酶表達(dá)下降[4],但CLOCK翻譯后修飾對細(xì)胞呼吸的調(diào)節(jié)尚不明確。研究發(fā)現(xiàn),CLOCK半胱氨酸195位點(diǎn)可以直接被內(nèi)源性H2O2氧化修飾并影響下游基因表達(dá)[5]。本文利用ClockC195S細(xì)胞,探究CLOCK的氧化還原修飾介導(dǎo)內(nèi)源性H2O2對細(xì)胞呼吸的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠:C57BL/6JClockwt和ClockC195S由北京唯尚立德生物科技有限公司提供。

1.1.2 材料:DMEM高糖培養(yǎng)基,PBS(賽維爾生物科技公司);0.25%胰蛋白酶(北京雷根生物技術(shù)公司);胎牛血清(GE Healthcare公司);NAD/NADH定量試劑盒(Sigma-Aldrich公司);增強(qiáng)型ATP檢測試劑盒、蛋白酶抑制劑(碧云天生物技術(shù)有限公司);細(xì)胞線粒體壓力檢測試劑盒、糖酵解檢測試劑盒、Seahorse XF Base Medium(Agilent Technologies公司);Trolox(MedChemExpress公司);Amplex? Red H2O2檢測試劑盒(Invitrogen 公司);CLOCK抗體(Cell Signaling Technology公司);Biotin-conjugated iodoacetamide, BIAM (Molecular Probes公司); Amicon? Ultra-15 離心過濾裝置(Merck公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)和小鼠成體成纖維細(xì)胞(MAFs)的提取:按照常規(guī)方法提取和培養(yǎng)[6-7]。

1.2.2 細(xì)胞線粒體壓力的檢測:實(shí)驗(yàn)前1 d將細(xì)胞按1×104接種到Seahorse XF 24孔板中,在DMEM完全培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng),預(yù)熱儀器并在37 ℃無CO2培養(yǎng)箱水化探針板。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天配制Seahorse XF Base Medium檢測液,用檢測液清洗細(xì)胞2遍并在37 ℃無CO2培養(yǎng)箱孵育1 h。將細(xì)胞線粒體壓力檢測試劑盒中寡霉素、解偶聯(lián)劑(trifluoromethoxy carbonylcyanide phenylhydrazone, FCCP)、魚藤酮(rotenone)和抗霉素A(antimycin A)按比例稀釋并依次加到測試板的A、B、C孔中,放入儀器中校準(zhǔn)。校準(zhǔn)完成后,替換細(xì)胞板進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)完成后采用wave和Graphpad Prism9.0.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.3 生物素碘乙酰胺(biotin-conjugated iodoacetamide, BIAM)標(biāo)記及Western blot檢測CLOCK蛋白:用含有蛋白酶抑制劑和 20 μmol/L BIAM的IP緩沖液收集實(shí)驗(yàn)細(xì)胞,轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中。超聲5次(每次15 s,間隔45 s)后,將細(xì)胞裂解液置于旋轉(zhuǎn)混勻儀在室溫孵育60 min。4 ℃,12 000×g離心20 min,用Amicon Ultra-15離心管去除過量BIAM。所得上清液加入60 μL鏈霉親和素磁珠,4 ℃旋轉(zhuǎn)混勻孵育過夜。隔天在磁力架上用1 mL IP緩沖液洗滌鏈霉親和素磁珠3次,加入60 μL 2× SDS上樣緩沖液煮沸,用于Western blot,按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法操作[5]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ClockC195S細(xì)胞呼吸水平下降

在ClockC195SMEFs和MAFs中,ATP含量顯著下降(圖1A),細(xì)胞氧耗能力受損(圖1B),包括基礎(chǔ)呼吸速率(basal respiration rate)、氧化磷酸化(ATP link respiration)、質(zhì)子滲漏(proton leak)、氧耗率(oxygen consumption rate,OCR)、最大氧耗量(maximal respiration)以及呼吸潛力(spare respiratory capacity)(圖1C,D)。

A.relative levels of ATP in Clockwt and ClockC195S MEFs and MAFs; B.the Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress Test profiles of Clockwt and ClockC195S MEFs and MAFs; C,D.the oxygen consumption rate(OCR) of basal respiration, ATP link respiration, proton leak, maximal respiration, spare respiratory capacity in Clockwt and ClockC195S;C.MEFs and D.MAFs.*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with Clockwt

2.2 ClockC195S細(xì)胞糖酵解和NAD合成受損

在MEFs(圖2A)和 MAFs(圖2B)中,ClockC195S導(dǎo)致糖酵解能力受損,酵解容量(glycolytic capacity)和酵解儲備(glycolytic reserve)顯著下降,糖酵解和TCA循環(huán)中產(chǎn)生的主要輔酶因子NADH含量明顯降低,其氧化當(dāng)量NAD+含量也低于野生型細(xì)胞(圖2C,D)。在哺乳動(dòng)物中,NAD+合成的一個(gè)重要途徑是以煙酰胺(nicotinamide,NAM)為起點(diǎn)的補(bǔ)救途徑[8]。其中關(guān)鍵酶煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶NAMPT的表達(dá)在Clockwt和ClockC195SMEFs中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶家族(nicotinamide nucleotide adenylyltransfertises,NMNATs)中,Nmnat1和Nmnat3表達(dá)沒有明顯改變,Nmnat2表達(dá)明顯降低(圖2E)。

A, B.extracellular acidification rates (ECAR) of glycolysis, glycolytic capacity, glycolytic reserve in Clockwt and ClockC195S.A.MEFs and B.MAFs; C,D.The NAD+ and NADH levels in Clockwt and ClockC195S.C.MEFs and D.MAFs; E.relative mRNA levels of Nampt, Nmnat1, Nmnat2 and Nmnat3 in Clockwt and ClockC195S MEFs;*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with Clockwt

2.3 CLOCK蛋白氧化還原修飾介導(dǎo)內(nèi)源性H2O2對細(xì)胞呼吸的調(diào)節(jié)作用

野生型MEFs在100、500 μmol/L和1 mmol/L抗氧化劑Trolox處理12 h后[9],H2O2含量均明顯下降(圖3A),BIAM標(biāo)記的還原態(tài)CLOCK蛋白含量相應(yīng)增加(圖3B)。野生型MEF細(xì)胞在100 μmol/L Trolox處理12 h后,細(xì)胞ATP含量、細(xì)胞氧耗能力等指標(biāo)顯著降低(圖3C～E)。ClockC195SMEFs在相同Trolox處理?xiàng)l件下,ATP含量及細(xì)胞氧耗能力無變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3C～E)。

A.cellular H2O2 levels in MEFs in the presence of 100 μmol/L, 500 μmol/L and 1 mmol/L Trolox, with DMSO treatment as control; B.a representative Western blot of CLOCK-SH proteins labelled by BIAM from MEFs in the presence of 100, 500 μmol/L and 1 mmol/L Trolox, Western blot of CLOCK-T showing the total content of CLOCK proteins; C-E.relative levels of ATP (C), the Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress Test profiles (D) and the oxygen consumption rates (OCR) of basal respiration, ATP link respiration, proton leak, maximal respiration, spare respiratory capacity (E) of Clockwt and ClockC195S MEFs in the presence of 100 μmol/L Trolox for 12 h;*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with Clockwt DMSO

2.4 CLOCK蛋白氧化還原修飾介導(dǎo)內(nèi)源性H2O2對Nmnat2的調(diào)節(jié)

Clockwt和ClockC195SMEFs在100 μmol/L Trolox處理12 h后,Nampt,Nmnat1和Nmnat3表達(dá)均沒有明顯差異;Nmnat2表達(dá)量在100 μmol/L Trolox處理的野生型MEFs中明顯降低,而在同樣處理的ClockC195SMEFs中改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

Relative mRNA levels of Nampt(A),Nmnat1 (B), Nmnat2 (C) and Nmnat3(D) in Clockwt and ClockC195S MEFs in the presence of 100 μmol/L Trolox for 12 h; *P<0.05, **P<0.01 compared with Clockwt DMSO

3 討論

越來越多研究表明生物鐘與線粒體功能相關(guān),這些研究主要聚焦在生物鐘基因本身的表達(dá)對線粒體功能的調(diào)節(jié)作用。Clock、Arntl、Per1/2、Cry1/2等生物鐘核心基因的敲除或敲低改變線粒體呼吸和能量代謝[4]。但生物鐘核心元件翻譯后修飾對細(xì)胞呼吸的調(diào)節(jié)還存在許多未知。研究發(fā)現(xiàn)CLOCK 195位半胱氨酸能被內(nèi)源性H2O2可逆地氧化修飾并改變其轉(zhuǎn)錄功能。在此基礎(chǔ)上,本研究利用ClockC195S細(xì)胞探究CLOCK氧化還原修飾對于細(xì)胞呼吸的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn),在MEFs和MAFs中,ClockC195S細(xì)胞氧耗能力和糖酵解能力下降,NADH和NAD+水平降低。CLOCK可以調(diào)節(jié)NAD+補(bǔ)救途徑關(guān)鍵基因Nampt節(jié)律表達(dá)從而導(dǎo)致NAD+含量的節(jié)律性振蕩[10]。但ClockC195S細(xì)胞Nampt水平?jīng)]有顯著變化,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)NAD+補(bǔ)救途徑中另一重要代謝酶NMNAT2表達(dá)量下降,NMNAT家族主要參與煙酸鹽和煙酰胺代謝,有3種亞型:NMNAT1、 NMNAT2和NMNAT3[11]。研究發(fā)現(xiàn)NMNAT2可以維持軸突NAD+/NADH氧化還原電位和糖酵解,影響線粒體代謝。ClockC195S細(xì)胞Nmnat2表達(dá)下降,導(dǎo)致細(xì)胞呼吸中關(guān)鍵輔酶因子NADH含量下降,從而影響細(xì)胞呼吸,并且內(nèi)源性H2O2可以通過CLOCK 195位半胱氨酸的氧化還原修飾調(diào)節(jié)Nmnat2的表達(dá)。以上結(jié)果證明CLOCK蛋白可以通過195位點(diǎn)半胱氨酸氧化還原修飾調(diào)節(jié)細(xì)胞呼吸,進(jìn)一步完善晝夜節(jié)律與細(xì)胞呼吸、線粒體功能的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

線粒體呼吸與活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生有關(guān),是ROS的重要來源。NADPH氧化酶(NADPH oxidases, NOXs)和線粒體電子傳遞鏈(electron transport chain, ETC)中復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ產(chǎn)生超氧負(fù)離子和H2O2[3];過氧化物酶、谷胱甘肽、硫氧還蛋白等抗氧化蛋白參與ROS的清除,ROS產(chǎn)生和清除的平衡構(gòu)成線粒體氧化還原穩(wěn)態(tài),調(diào)節(jié)細(xì)胞關(guān)鍵信號通路和細(xì)胞代謝。H2O2作為ROS重要分子之一,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和小鼠肝臟中存在晝夜節(jié)律振蕩[5]。本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性H2O2可以通過CLOCK蛋白195位半胱氨酸的氧化還原修飾調(diào)節(jié)細(xì)胞呼吸,但具體機(jī)制仍需更多的實(shí)驗(yàn)探究。本研究將生物鐘、細(xì)胞呼吸和氧化還原穩(wěn)態(tài)聯(lián)系起來,從氧化還原角度理解生物鐘核心元件對細(xì)胞呼吸的調(diào)節(jié)作用,但這種調(diào)節(jié)方式在時(shí)間維度上對細(xì)胞呼吸的作用和調(diào)節(jié)機(jī)制還需進(jìn)一步探究。