季 瑋，朱 玥，堯惠慈，盧紅艷

江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院 兒科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001

支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)是早產(chǎn)兒常見的呼吸系統(tǒng)疾病,病理特征主要是肺發(fā)育受阻及肺微血管發(fā)育不良,具體作用機(jī)制尚不清楚[1]。研究發(fā)現(xiàn),大量促炎因子存在于BPD患兒的氣道分泌物[2],表明炎性反應(yīng)仍為BPD發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。

2型固有淋巴細(xì)胞(type 2 innate lymphoid cell,ILC2)是2型炎性反應(yīng)的重要效應(yīng)細(xì)胞[3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),ILC2參與了BPD氣道炎性反應(yīng)的過程[4],但具體作用機(jī)制不明確。近年發(fā)現(xiàn),白三烯C4(leukotriene C4,LTC4)可與半胱氨酸白三烯受體1(cysteinyl leukotriene receptor 1,CysLT1R)結(jié)合作用于ILC2發(fā)揮生物學(xué)作用,但研究主要集中在哮喘、過敏性鼻炎等疾病[5],在BPD中尚無報(bào)道。因此,本研究通過建立 BPD模型小鼠,對(duì)此進(jìn)行研究,為深入研究BPD的發(fā)病機(jī)制和防治策略提供思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物:SPF級(jí)C57BL/6小鼠(江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),研究經(jīng)江蘇大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[許可證號(hào)為SYXK(蘇)2018-0053]。

1.1.2 主要試劑:兔多克隆白三烯C4合酶(leukotriene C4-synthase,LTC4S)抗體(NOVUS生物公司);小鼠單克隆β-actin抗體(CST公司);兔多克隆SPD抗體(Bioss公司);小鼠單克隆膜黏蛋白[podoplamin(PDPN)/T1α]抗體(Santa Cruz公司);HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體、蛋白酶抑制劑、紅細(xì)胞裂解液(Beyotime公司);Lineage-AF700單克隆抗體、CD90.2-PE單克隆抗體、CD45-BV510單克隆抗體(Biolegend公司);CysLT1R-FITC多克隆抗體(Cayman公司);引物(生工生物工程股份有限公司);SDS-PAGE、預(yù)染蛋白marker、熒光定量PCR試劑(諾唯贊生物科技股份有限公司);LTC4 ELISA試劑盒(酶免生物科技有限公司);IL-5、IL-13 ELISA試劑盒(Elabscience公司);IL-4(聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司);Trizol裂解液(Ambion公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分組及處理:按參考文獻(xiàn)[6]復(fù)制BPD模型,將小鼠隨機(jī)分為空氣組和高氧組,每組9只,高氧組置于85%密閉氧氣盒1、7及14 d,空氣組置于同一室內(nèi)空氣下,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取3只小鼠。

1.2.2 HE染色:石蠟切片用二甲苯溶液脫蠟并在乙醇溶液中放置2 min,利用蘇木精和伊紅(HE)經(jīng)肺組織進(jìn)行染色,正常脫水后,對(duì)切片進(jìn)行透明處理并密封,在光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.2.3 流式細(xì)胞檢測術(shù)檢測單細(xì)胞懸液中ILC2及CysLT1R+ILC2含量:將肺組織制成單細(xì)胞懸液,用流式表面抗體Lin-CD90.2+CD45+標(biāo)記ILC2,Lin-CD90.2+CD45+CysLT1R+標(biāo)記CysLT1R+ILC2, 4 ℃避光30 min,洗滌,離心,棄上清,加入200 μL PBS,24 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測,應(yīng)用FlowJo V10進(jìn)行結(jié)果處理與分析。

1.2.4 ELISA檢測肺組織中LTC4、IL-4、IL-5及IL-13含量:用PBS沖洗肺組織以除去殘留血液,將肺組織置于離心管中,剪碎,利用高通量組織研磨器制為組織勻漿,4 ℃ 3 000 r/min 離心20 min,收集上清液,嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明檢測LTC4、IL-4、IL-5及IL-13含量。

1.2.5 Western blot檢測肺組織LTC4S蛋白表達(dá):取肺組織30 mg,加入RIPA裂解液中制備組織勻漿,4 ℃離心取上清,加load buffer后封煮10 min分裝至-20 ℃保存。每孔加入10 μL蛋白質(zhì)樣品行電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉,加入一抗兔多克隆LTC4S抗體(1∶500)、小鼠單克隆β-actin抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜,加入山羊抗兔IgG抗體(1∶5 000)、山羊抗小鼠IgG抗體(1∶5 000)37 ℃恒溫?fù)u床分別孵育1 h,凝膠成像儀曝光顯影。

1.2.6 RT-qPCR檢測肺組織LTC4S、CysLT1R mRNA表達(dá):取肺組織30 mg,用Trizol法提取總RNA,用紫外分光光度法測定RNA濃度和純度,可至-80 ℃冰箱保存,引物序列見(圖表)。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Green進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量,檢測目標(biāo)基因mRNA水平的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理形態(tài)學(xué)改變

與空氣組相比,隨著高氧暴露時(shí)間延長,高氧組肺泡數(shù)量減少、體積增大,肺泡間隔中斷,間質(zhì)水腫,部分融合,肺泡結(jié)構(gòu)簡單化,肺泡壁增厚(圖1)。

P1.day 1 after birth; P7.day 7 after birth; P14.day 14 after birth

2.2 BPD小鼠肺組織ILC2及CysLT1R+ILC2動(dòng)態(tài)變化情況

隨著高氧暴露時(shí)間延長,高氧組ILC2及CysLT1R+ILC2呈現(xiàn)增高趨勢,各時(shí)間點(diǎn)均高于同時(shí)間點(diǎn)空氣組(P<0.05)(圖2)。

P1.day 1 after birth; P7.day 7 after birth; P14.day 14 after birth; A.percentages of ILC2 in mice lung tissue by flow cytometry; B.percentages of CysLT1R+ILC2 in mice lung tissue by flow cytometry;*P<0.05,**P<0.01 compared with air group

2.3 BPD小鼠肺組織LTC4、IL-4、IL-5、IL-13含量變化

隨著高氧暴露時(shí)間延長,高氧組LTC4、IL-4、IL-5、IL-13含量均呈時(shí)間依賴性逐漸增高(P<0.05)(圖3)。

P1.day 1 after birth; P7.day 7 after birth; P14.day 14 after birth;*P<0.05 compared with air group

2.4 BPD小鼠肺組織LTC4S蛋白表達(dá)變化

隨著高氧暴露時(shí)間延長,高氧組LTC4S蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性逐漸上升(P<0.05)(圖4)。

P1.day 1 after birth; P7.day 7 after birth;P14.day 14 after birth; A.expression of LTC4S protein; B.comparison of LTC4S protein expression level;*P<0.05 compared with air group

2.5 BPD小鼠肺組織LTC4S、CysLT1R mRNA表達(dá)情況

隨著高氧暴露時(shí)間延長,高氧組LTC4S、CysLT1R mRNA表達(dá)均逐漸增加,高于同時(shí)間點(diǎn)空氣組(P<0.05)(圖5)。

P1.day 1 after birth; P7.day 7 after birth; P14.day 14 after birth;*P<0.05,**P<0.01 compared with air group

3 討論

BPD是早產(chǎn)兒嚴(yán)重的肺部并發(fā)癥,發(fā)病機(jī)制尚不明確,其幸存者往往伴有認(rèn)知與行為障礙等后遺癥,因此,研究BPD發(fā)病機(jī)制對(duì)于預(yù)防和治療BPD至關(guān)重要[1]。本研究利用高氧暴露建立小鼠BPD模型,發(fā)現(xiàn)高氧組小鼠肺組織肺泡減少、增大及簡化,肺泡壁增厚,符合BPD的病理表現(xiàn),提示造模成功。

炎性反應(yīng)在BPD發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1]。1型炎性反應(yīng)在BPD的作用已有大量研究,但2型炎性反應(yīng)卻知之甚少[7]。ILC2作為2型免疫的關(guān)鍵細(xì)胞,釋放多種細(xì)胞因子介導(dǎo)炎性反應(yīng)過程[3]。本研究發(fā)現(xiàn),高氧組ILC2逐漸增加,進(jìn)一步檢測相關(guān)細(xì)胞因子發(fā)現(xiàn),高氧組IL-4、IL-5及IL-13表達(dá)水平也增加,與ILC2變化趨勢相同,這與報(bào)道[8]的在高氧小鼠肺組織中研究結(jié)果一致,提示ILC2參與BPD炎性反應(yīng),并釋放IL-4、IL-5及IL-13進(jìn)一步促進(jìn)肺部炎性反應(yīng)。

在多種疾病中發(fā)現(xiàn),ILC2不僅接受IL-33、IL-25和胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(thymic stromal lymphopoietin,TSLP)直接刺激,也對(duì)前列腺素D2(prostaglandin D2,PGD2)及半胱氨酸白三烯(cysteinyl leukotrienes,CysLTs)有反應(yīng)[5]。早期研究表明BPD患兒呼吸道中CysLTs升高[9]。近年發(fā)現(xiàn),LTE4在BPD患兒尿液中顯著上升[10],LTB4在博來霉素所致BPD樣損傷中促進(jìn)肺部炎性反應(yīng)[11],但LTC4在BPD中的具體作用尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn),與空氣組相比,高氧組LTC4含量、LTC4S蛋白及mRNA表達(dá)均增加,且隨高氧暴露時(shí)間延長,增加越明顯,提示LTC4參與BPD炎性反應(yīng)過程,具體作用機(jī)制尚不明確。

據(jù)研究,在哮喘、慢性鼻竇炎、過敏性鼻炎等多種呼吸道疾病中CysLTs增加并促進(jìn)ILC2及IL-4、IL-5等細(xì)胞因子的釋放[12-13],但CysLTs是否激活I(lǐng)LC2促進(jìn)BPD肺部2型炎性反應(yīng)尚不清楚。肺ILC2可表達(dá)CysLT1R,其可與CysLTs結(jié)合促進(jìn)炎性細(xì)胞聚集和炎性介質(zhì)釋放誘發(fā)氣道高反應(yīng)性引起氣道重塑,在氣道炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn),與空氣組相比, 高氧組CysLT1R+ILC2表達(dá)增加,與CysLT1R mRNA表達(dá)趨勢相同,提示LTC4可能通過CysLT1R激活I(lǐng)LC2。

綜上所述,在高氧誘導(dǎo)的小鼠BPD模型中,LTC4及ILC2在氣道炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,LTC4可能通過CysLT1R激活I(lǐng)LC2釋放2型細(xì)胞因子介導(dǎo)肺部炎性反應(yīng),但仍需進(jìn)一步研究。靶向LTC4及ILC2介導(dǎo)的2型細(xì)胞因子通路抑制劑可能在BPD患兒中具有應(yīng)用價(jià)值。