李朔　陳鑫　吳昊　陳冬梅　謝書宇

摘要：胞內(nèi)菌通過在宿主細胞內(nèi)生存以逃避機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，宿主細胞的膜屏障作用致使抗菌藥物無法進入胞內(nèi)殺滅細菌，這使得胞內(nèi)菌感染成為一大治療難題。納米藥物的獨特結(jié)構(gòu)促使其能有效跨細胞轉(zhuǎn)運并逃逸溶酶體降解，因此所荷載的抗菌藥物能在胞內(nèi)維持有效濃度，實現(xiàn)胞內(nèi)菌感染的高效治療。此外，許多納米材料自身也具備獨特的抗菌特性。本文將對納米藥物治療胞內(nèi)菌感染的藥效學(xué)及機制進行總結(jié)概述，以期為抗胞內(nèi)菌納米藥物的研發(fā)提供借鑒，并為解決胞內(nèi)菌感染的治療難題提供新方案。

關(guān)鍵詞：納米系統(tǒng)；胞內(nèi)菌；抗菌藥物；胞內(nèi)傳遞；抗菌活性；抗菌策略

中圖分類號：R978.1? ? ? ?文獻標志碼：A? ? ? ? ?文章編號：1001-8751（2023）03-0211-06

Research Progress of Nano-antimicrobial Drugs for Intracellular

Bacteria Infection Treatment

Li Shuo1， Chen Xin1， Wu Hao1， Chen Dong-mei1，2， Xie Shu-yu1

（1 Reference Laboratory for the Test of Veterinary Drug Residues， Huazhong Agricultural University，? ?Wuhan? ?430070;

2 National Veterinary Drug Safety Evaluation， Huazhong Agricultural University，? ?Wuhan? ?430070）

Abstract：The membrane barrier of the host cell prevents antibacterial drugs from entering the cell to kill the bacteria， making intracellular infections a major therapeutic challenge. The unique structure of nanomedicines allows them to be efficiently transported across cells and escape lysosomal degradation， thus maintaining effective intracellular concentrations of the loaded antibacterial drugs and enabling efficient treatment of intracellular bacterial infections. In addition， many nanomaterials have unique antimicrobial properties of their own. In this paper， we present an overview of the pharmacodynamics and mechanisms of nanomedicines for the treatment of intracellular infections， with a view to informing the development of anti-intracellular nanomedicines and providing new solutions to the therapeutic challenges of intracellular infections.

Key words：nanosystems; intracellular bacteria; antibacterial drugs; intracellular delivery; antibacterial activity; antibacterial strategy

1 前言

細菌感染嚴重威脅了人類和動物的健康。EM-DAT公開數(shù)據(jù)顯示在1900—2008年期間，全球因細菌感染死亡的人數(shù)超過590萬，占總死亡人數(shù)的6成以上。2017年統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，每年約有100萬人因細菌感染造成死亡，并且該數(shù)據(jù)正以每年32%的速度增長。據(jù)估計，到2050年，死亡人數(shù)將激增至1000萬[1]。細菌在宿主細胞的寄居部位不同，可將其分為胞外菌和胞內(nèi)菌。常見的胞內(nèi)菌有結(jié)核分枝桿菌、布氏桿菌、李斯特桿菌等。根據(jù)胞內(nèi)菌在宿主細胞內(nèi)生長繁殖的專一性可將其分為專性胞內(nèi)菌和兼性胞內(nèi)菌。專性胞內(nèi)菌只在宿主細胞存活和繁殖，如衣原體、立克次體等[2]。兼性胞內(nèi)菌，例如結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)桿菌、化膿性鏈球菌、化膿性葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌等，不僅可以在細胞內(nèi)復(fù)制，也可以在細胞外復(fù)制。胞內(nèi)菌可以通過寄生在宿主細胞內(nèi)來逃避免疫系統(tǒng)清除，胞內(nèi)菌比胞外菌更難清除，造成的危害也更嚴重[3]。例如，結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病仍是導(dǎo)致人類死亡的十大原因之一[4]。

胞內(nèi)菌侵入機體，在細胞內(nèi)生長繁殖，產(chǎn)生毒素和其他代謝產(chǎn)物，引起急性或全身性感染。吞噬細胞的主要功能是清除宿主中細菌病原體，但胞內(nèi)菌特殊生存方式可逃避吞噬細胞的清除[5]，在巨噬細胞中長期持續(xù)存活。如單核細胞增生李斯特菌和立克次體便可在巨噬細胞胞質(zhì)內(nèi)增殖，嗜肺李斯特菌定植于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)液泡內(nèi)[6]，腸道沙門菌則在晚期內(nèi)體的隔室進行增殖[7]。由于胞內(nèi)菌可以逃避，抵抗機體的免疫反應(yīng)，這導(dǎo)致胞內(nèi)菌和機體的免疫系統(tǒng)的長久共生，造成細菌的長期持續(xù)和反復(fù)感染，造成治療的難題。自1928年首個抗生素—青霉素被發(fā)現(xiàn)以來，抗生素在治療細菌感染方面便發(fā)揮了巨大的作用[8]。由于宿主細胞膜通透性低和外排轉(zhuǎn)運體的作用，臨床批準使用的絕大部分抗菌藥都無法穿透細胞膜并長時間在細胞內(nèi)存在，難以高效精準殺傷胞內(nèi)菌。同時，宿主細胞內(nèi)的強酸性吞噬溶酶體和氧化還原酶會使進入細胞的抗生素失活[9]。此外，抗生素長期的不規(guī)范使用甚至濫用，導(dǎo)致胞內(nèi)菌耐藥性增加，甚至出現(xiàn)多重耐藥（MRD）現(xiàn)象。胞內(nèi)菌侵入細胞后在宿主免疫力和持續(xù)性低濃度抗菌藥物的作用下以休眠狀態(tài)存活從而逃避抗生素的殺傷作用。因此，多數(shù)抗生素不但無法完全消除胞內(nèi)菌，還極易導(dǎo)致復(fù)發(fā)性感染。

綜上所述，抗生素對胞內(nèi)菌治療效果較差主要源于以下三個因素：（1）宿主細胞膜屏障阻礙抗生素內(nèi)化，導(dǎo)致胞內(nèi)抗生素濃度低于最低有效濃度；（2）細胞內(nèi)微環(huán)境（例如酸性pH、酶等）減弱了抗生素的殺菌活性；（3）胞內(nèi)菌借助休眠模式來抵御抗生素的殺滅作用（如圖1）。因此，亟需新的有效策略來解決胞內(nèi)菌感染性疾病治療難題。納米傳遞系統(tǒng)可吸附、包裹、荷載和共價鏈接抗菌藥物，利用自身的小尺寸效應(yīng)和比表面積效應(yīng)實現(xiàn)抗菌藥物的緩釋、控釋、靶向、胞內(nèi)傳遞等作用。納米遞送系統(tǒng)通過增強細胞膜通透性和保留效應(yīng)（EPR），使藥物優(yōu)先積聚在胞內(nèi)菌感染的靶向部位和細胞[10]，達到優(yōu)于普通抗菌藥物的治療效果。更重要的是納米傳遞系統(tǒng)可將其荷載的藥物利用不同的內(nèi)吞途徑將高效輸送至細菌感染的細胞內(nèi)，維持有效的濃度，從而高效發(fā)揮胞內(nèi)感染的作用，為解決胞內(nèi)菌治療難題提供了潛在的方案。

本文將對納米藥物治療胞內(nèi)菌的機制及策略進行總結(jié)，以期為治療胞內(nèi)菌的納米抗菌藥物的開發(fā)提供思路和借鑒。

2 納米抗菌藥物治療胞內(nèi)菌的機理

負載藥物的納米遞送系統(tǒng)和納米材料可向胞內(nèi)精準、高效遞送藥物從而提高抗菌藥物對胞內(nèi)菌的抗菌活性。通過對納米材料的設(shè)計和功能性修飾，如特異性配體對納米抗菌藥物進行表面修飾后可使納米特異性的識別感染細胞，從而使藥物靶向感染細胞傳遞和釋放。此外，部分納米仿生材料，如外泌體能夠穩(wěn)定的透過細胞膜，將納米藥物高效的遞送到細胞內(nèi)部發(fā)揮作用。另外，一些納米系統(tǒng)可以避免吞噬溶酶體酶的降解以及和寄生在胞內(nèi)的菌高效結(jié)合，實現(xiàn)亞細胞器和細菌的靶向，向胞內(nèi)寄生菌精準高效靶向遞送，從而實現(xiàn)胞內(nèi)菌感染的高效治療。本節(jié)將從納米系統(tǒng)和材料的跨膜轉(zhuǎn)運途徑、藥物胞內(nèi)的穩(wěn)定作用以及胞內(nèi)靶向等方面總結(jié)納米抗菌藥物抗胞內(nèi)菌感染的機制。

2.1 納米系統(tǒng)的靶向宿主細胞傳遞機制

納米系統(tǒng)可以通過主被動的方式實現(xiàn)感染部位和感染細胞的靶向遞送。例如，通過對納米系統(tǒng)表面的親水性修飾，可避免其被單核吞噬系統(tǒng)吞噬，從而延長其體內(nèi)循環(huán)時間[11]。目前，利用環(huán)境響應(yīng)性策略（pH、酶、光、熱）和表面功能性修飾使納米靶向傳遞至感染部位和感染細胞成為主流策略和研究熱點。Tao等[12]通過將小分子、肽、抗體和適配體結(jié)合到納米系統(tǒng)表面，實現(xiàn)了納米粒在感染部位的蓄積。本課題組通過透明質(zhì)酸、明膠修飾的納米系統(tǒng)實現(xiàn)了對胞內(nèi)金黃色葡萄球菌感染部位的靶向傳遞。同時，以多重靶向分子卟啉作為組裝成分，實現(xiàn)了對金黃色葡萄球菌感染細胞及其胞內(nèi)寄生菌的多重靶向，提高了對胞內(nèi)金黃色葡萄球菌感染的治療效果[13]。

2.2 納米系統(tǒng)攝入宿主細胞的機制

由于細胞膜通透性、穩(wěn)定性和保留性差，多數(shù)抗生素（除大環(huán)內(nèi)酯類、氟喹諾酮類藥物外）的細胞內(nèi)化效率低，無法大量進入宿主細胞以清除胞內(nèi)菌[14]。納米高效跨膜轉(zhuǎn)運效率為抗生素胞內(nèi)輸送提供了新思路。感染部位的細胞膜通透性和保留效應(yīng)（EPR）亦協(xié)助納米系統(tǒng)靶向進入感染部位。目前，模擬天然細胞膜或膜結(jié)構(gòu)而構(gòu)成的仿生納米遞送系統(tǒng)[如細胞外囊泡（EVs）[15]，外泌體[16] 、凋亡小體等]，因與宿主細胞成分相似，可通過膜的融合作用而實現(xiàn)有效跨宿主細胞膜轉(zhuǎn)運，增加了其荷載抗菌藥物的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運效率。例如，磷脂雙層組成脂質(zhì)體通過與生物膜的融合將包埋的化合物高效遞送至細胞內(nèi)。青霉素G（PenG）和左氧氟沙星（Levo）合成負載青霉素G的脂質(zhì)偶聯(lián)物能增強細胞對青霉素G的攝取，從而使99.99%的胞內(nèi)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌被清除[17]。涂有含金黃色葡萄球菌分泌物的納米顆粒（NP@EV）作為活性靶向抗生素載體，可對感染金黃色葡萄球菌的巨噬細胞產(chǎn)生更高效率的內(nèi)化，同時抗生素的釋放緩慢亦有利于治療胞內(nèi)菌造成的慢性感染。除了細胞膜的融合作用外，納米系統(tǒng)還可以通過吸附，穿透網(wǎng)格蛋白、小窩蛋白、非網(wǎng)格蛋白小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞等內(nèi)吞途徑、微胞飲和吞噬等方式高效進入到宿主細胞從而使其荷載的藥物大量攝入感染細胞。Mitra等[18]制備了一種絲素蛋白納米粒，該納米?？韶撦d利福平并以66.2±2.1%的細胞攝取效率經(jīng)網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進入巨噬細胞，其對細胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的MIC90為34.0 ±6.2 μg/mL，而游離利福平MIC90僅為其1/17。通過調(diào)節(jié)納米系統(tǒng)的物理性質(zhì)（如大小，表面電荷，疏水性和形態(tài)等可）改變納米抗菌藥物攝入進細胞的速率和效率。本課題組前期研究表明，固體脂質(zhì)納米顆粒（SLN）的粒徑從150 nm增加到605 nm，其攜帶的恩諾沙星在細胞內(nèi)濃度顯著增強，605 nm的SLN在細胞中的積累效率約為游離恩諾沙星的27.06～37.71倍，顯著抑制了RAW264.7巨噬細胞中99.97%的細胞內(nèi)沙門菌生長[19]。

2.3 降低抗菌藥物在胞內(nèi)溶酶體的降解

胞內(nèi)菌通過其獨特的免疫逃避機制在宿主細胞內(nèi)存活[20]。例如，結(jié)核分枝桿菌能夠抵抗肺部巨噬細胞和中性粒細胞的殺傷作用，破壞溶酶體運輸途徑，從而在細胞內(nèi)存活。單核細胞增生李斯特菌等細菌則使用溶血素O（LLO）穿透吞噬體膜以逃避吞噬體，最終駐留于細胞質(zhì)[21]。常規(guī)抗菌藥物進入細胞后易被溶酶體降解，無法發(fā)揮藥效。研究發(fā)現(xiàn)，納米粒能使?jié)B透壓升高，內(nèi)體破裂，從而實現(xiàn)藥物的內(nèi)體逃逸[22]。因此，許多可逃逸溶酶體酶解的納米藥物被設(shè)計開發(fā)。Ding等[23]將金納米粒（Au-NPs）與LLO毒素結(jié)合，以促進Au-NPs在小鼠胚胎成纖維細胞（MEFs）的溶酶體逃逸，并減少甚至阻止其排出。同時，用信號和靶向蛋白裝飾在納米粒表面能夠使納米藥物滿足其胞內(nèi)細菌的靶向性[24]。He等[25]將多巴胺同血紅蛋白聚合形成智能納米載體（PDA/Hb），該納米能使其吸附的抗菌藥物呈現(xiàn)強大的溶酶體逃逸功能，顯著提升了細胞漿內(nèi)的藥物含量，發(fā)揮出更為優(yōu)異的抗菌作用。

2.4 納米系統(tǒng)的緩釋作用

抗菌藥物在治療胞內(nèi)感染時，胞內(nèi)的藥物濃度會隨著胞外藥物濃度的下降而急劇外排。而在治療胞內(nèi)細菌感染時，需要抗菌藥物在體內(nèi)持續(xù)維持有效劑量才能保證對胞內(nèi)菌的殺滅作用。納米系統(tǒng)能夠緩慢釋放藥物，延長藥物在體內(nèi)停留時間，避免胞內(nèi)藥物的快速下降，使抗菌藥物充分發(fā)揮抗胞內(nèi)菌活性。例如，納米區(qū)室周圍的脂質(zhì)基質(zhì)屏障能維持藥物的持續(xù)釋放。Feng等[26]通過將利福平（Rif）封裝到甘露糖修飾的納米顆粒中設(shè)計了Rif@FAM NPs，實現(xiàn)了抗生素在體內(nèi)和細胞內(nèi)長時間停留，從而使Rif@FAM NPs對MASA殺菌作用 （1.36 log10CFU） 明顯優(yōu)于游離的Rif的 （2.18 log10CFU）。由于多西環(huán)素—固體脂質(zhì)納米對巨噬細胞的高效跨膜轉(zhuǎn)運和緩釋作用[27]，負載多西環(huán)素的固體脂質(zhì)納米顆粒對巨噬細胞內(nèi)的布氏桿菌顯示出更好的殺滅效果，顯著降低了巨噬細胞內(nèi)的微生物負荷（log10CFU）。

3 納米系統(tǒng)治療胞內(nèi)菌研究進展

研究表明，由有機、無機或者復(fù)合納米材料等構(gòu)建的載藥納米系統(tǒng)殺滅胞內(nèi)菌的能力明顯優(yōu)于游離抗菌藥物[28]。并且，部分納米材料因自身具備抗菌效果，無需載藥便可發(fā)揮殺滅胞內(nèi)菌作用。有機納米材料多由，聚合物納米顆粒、脂質(zhì)體、固體脂質(zhì)納米顆粒（SLNs）和納米級金屬有機框架（MOF）等構(gòu)成。Kisich等[29]通過有機納米材料（氰基丙烯酸丁酯）負載抗菌藥物，顯著提高了藥物的內(nèi)化效率及胞內(nèi)積累率，從而發(fā)揮出優(yōu)于游離藥物的抗胞內(nèi)菌作用。游離莫西沙星和氰基丙烯酸丁酯（PBCA）負載莫西沙星雖均能對巨噬細胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌起到殺菌效果，但PBCA負載莫西沙星的MIC值僅為游離藥物的1/10，且包封的莫西沙星在巨噬細胞內(nèi)的積累效率高出游離藥物2倍左右。無機納米材料多包括金屬，磁性和半導(dǎo)體納米顆粒、碳納米管（CNT）、碳點（CDs）等。Clemens等[30]發(fā)現(xiàn)載藥介孔二氧化硅納米顆粒（MSNP）能被巨噬細胞有效內(nèi)化，其在細胞內(nèi)可釋放高濃度的抗結(jié)核藥物。與游離異煙肼相比，負載異煙肼的MSNP使胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的CFU降低了3.8log10。近年來，將有機和無機納米顆粒結(jié)合以抑制胞內(nèi)菌的復(fù)合納米材料也被廣泛研究。復(fù)合納米材料可產(chǎn)生協(xié)同抗菌作用，且有利于藥物入胞并逃避溶酶體酶降解。Feng等[31]將利福平（Rif）封裝到甘露糖修飾的聚（α-N-丙烯?；?苯丙氨酸）-嵌段-聚（β-N-丙烯?；?d-氨基丙氨酸）納米顆粒中（Rif@FAM NPs），實現(xiàn)了藥物在巨噬細胞內(nèi)的級聯(lián)遞送。其中，甘露糖使Rif@FAM NPs在巨噬細胞中特異性累積，并隨后在酸性吞噬溶酶體的作用下暴露d-氨基丙氨酸位點，從而使納米顆粒逃避溶酶體并靶向細胞內(nèi)MRSA。除以上納米材料外，還有聚乳酸羥基乙酸（PLGA）、聚乙烯亞胺（PEI）、金屬納米粒等納米材料亦被用于胞內(nèi)菌治療，具體相關(guān)實例見表1。

4 展望

當前胞內(nèi)菌引起的一系列公共衛(wèi)生問題已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)生物醫(yī)學(xué)的巨大挑戰(zhàn)。由于胞內(nèi)病原體存在于宿主細胞內(nèi)部，能夠逃避機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，難以被機體免疫系統(tǒng)徹底清除，極易造成持續(xù)性的疾病。同時，由于抗菌藥物難以穿過宿主細胞膜精準達到病原體所在部位，藥物便難以達到有效治療濃度，無法對胞內(nèi)菌造成有效打擊，而長時間高劑量的治療極易導(dǎo)致毒副作用。納米系統(tǒng)的靶向傳遞、跨膜轉(zhuǎn)運、溶酶體逃逸、緩釋效應(yīng)為抗菌藥物的胞內(nèi)高效傳遞提供了有效的策略，為解決胞內(nèi)菌感染的治療難題提供新的方案。

除了納米納米系統(tǒng)通過主被動修飾提高抗菌藥物在胞內(nèi)的濃度發(fā)揮殺菌活性以外，當前已經(jīng)許多新型納米療法，如光熱療法、光動力或熱動力學(xué)不但可以實現(xiàn)高效胞內(nèi)傳遞開可以發(fā)揮不同與傳統(tǒng)抗菌機制的殺菌活性，為耐藥胞內(nèi)菌的高效防控提供機遇。隨著納米技術(shù)和材料科學(xué)的不斷發(fā)展，納米抗菌藥物在治療胞內(nèi)菌感染的優(yōu)勢將更加顯著和更具開發(fā)應(yīng)用前景。然而，如何提升和系統(tǒng)評價納米系統(tǒng)的安全性和穩(wěn)定性，仍然是當前開發(fā)納米系統(tǒng)亟待面對和解決的首要問題。隨著納米技術(shù)的不斷拓寬及其安全性評估的不斷深入開展，其在治療胞內(nèi)菌的產(chǎn)業(yè)化必將進一步加快。

參 考 文 獻

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收稿日期：2023-01-10

作者簡介：李朔，碩士研究生，主要從事新獸藥研究。

*通訊作者：謝書宇，博士，教授，主要從事新獸藥研究。