何靜 易航 楊希 榮姝恬 王麗

摘 要 ???：為探究雌雄異株植物響應(yīng)重金屬脅迫的性別差異，本研究利用超高效液相色譜結(jié)合四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（UPLC-Q-TOF-MS）測(cè)定了鎘（Cd）脅迫下雌雄地錢（ Marchantia polymorpha ）中的代謝產(chǎn)物，分析了與不同性別相關(guān)的差異代謝物和代謝通路.結(jié)果顯示，未受鎘脅迫時(shí)，雌性地錢中類黃酮生物合成、嘌呤代謝和玉米素生物合成代謝水平高于雄性，芹菜素、木犀草素、腺嘌呤和腺苷含量顯著高于雄性.受鎘脅迫后，雌性地錢中類黃酮生物合成、嘌呤代謝和玉米素生物合成代謝水平下降，芹菜素、木犀草素、矢車菊素-3-O-半乳糖苷、腺嘌呤和腺苷含量顯著下降.而雄性地錢中上述三條通路的代謝水平上升，刺槐苷、槲皮素、腺苷一磷酸和肌苷的含量顯著上調(diào).研究表明，地錢響應(yīng)鎘脅迫的代謝變化出現(xiàn)了性別差異.其中，雌性地錢降低了玉米素和遺傳物質(zhì)的合成水平，誘導(dǎo)谷胱甘肽的合成.雄性地錢上調(diào)了玉米素合成，緩解葉綠素的降解，同時(shí)上調(diào)類黃酮生物合成途徑中的槲皮素和刺槐苷等具有抗氧化活性的次生代謝產(chǎn)物.

關(guān)鍵詞 ：鎘脅迫； 地錢； 性別響應(yīng)差異； 代謝組

中圖分類號(hào) ： Q945 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ：A DOI ： ?10.19907/j.0490-6756.2023.046002

收稿日期： ?2022-12-14

基金項(xiàng)目： ?四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目（川林規(guī)函［2021］ 959號(hào)-002）

作者簡(jiǎn)介： ??何靜（1999-）， 女， 四川遂寧人， 碩士研究生， 研究方向?yàn)橹参飳W(xué). E-mail： jinghe@stu.scu.edu.cn

通訊作者： ?王麗. E-mail： yzxj@vip.163.com

Study on gender response difference of ?Marchantia polymorpha ??metabolome under cadmium stress based on LC-MS technique

HE Jing， YI Hang， YANG Xi， RONG Shu-Tian， WANG Li

（College of Life Sciences， Sichuan University， Chengdu 610065， China）

In order to explore the gender differences of dioecious plants in response to heavy metal stress， the metabolites of ?Marchantia polymorpha ?under cadmium （Cd） stress were determined by ultra-performance liquid chromatography combined with quadrupole time-of-flight mass spectrometry （ UPLC-Q-TOF-MS ）， and the differential metabolites and metabolic pathways related to different genders were analyzed. The results showed that， without cadmium stress， the levels of flavonoid biosynthesis， purine metabolism and zeatin biosynthesis in females were higher than those in males with significantly higher contents of apigenin， luteolin， adenine and adenosine. After cadmium stress， the levels of flavonoid biosynthesis， purine metabolism and zeatin biosynthesis in females were decreased with the significant decrease of ?apigenin， luteolin， cyanidin-3-O-galactoside， adenine and adenosine. The metabolic levels of the above three pathways increased in males with the significant increase of differential metabolites kaempferol-3-O-robinoside-7-O-rhamnoside， quercetin， adenosine monophosphate and inosine. Studies have shown gender differences in metabolic changes of ?M. polymorpha ?in response to cadmium stress. Among them， female ?M. polymorpha ?reduced the synthesis level of zeatin and genetic material， and induced the synthesis of glutathione. Male ?M. polymorpha ?increased zeatin synthesis， alleviated chlorophyll degradation， and up-regulated secondary metabolites with antioxidant activity such as quercetin and kaempferol-3-O-robinoside-7-O-rhamnoside in the flavonoid biosynthesis pathway.

Cadmium stress; ?Marchantia polymorpha ; Gender response differences; Metabolome

1 引 言

重金屬是地殼的天然元素，由于工業(yè)發(fā)展和人類活動(dòng)造成重金屬含量顯著高于天然含量，導(dǎo)致環(huán)境中重金屬污染的發(fā)生 ?［1］.鎘（Cd）是一種有毒重金屬，毒害植物，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成風(fēng)險(xiǎn)，并在生態(tài)循環(huán)中危害人類健康 ?［2］.重金屬鎘通過(guò)與其他礦物質(zhì)元素競(jìng)爭(zhēng)低特異性的Fe ?2+/Fe ?3+、Zn ?2+ 和 Mn ?2+ 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入植物，擾亂植物根系對(duì)礦質(zhì)元素的吸收，導(dǎo)致植物體營(yíng)養(yǎng)不足，生長(zhǎng)受限甚至死亡 ?［3］.鎘脅迫誘導(dǎo)活性氧（ROS）的產(chǎn)生 ?［4］，影響植物細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) ?［5］，降低葉綠素含量 ?［6］，抑制光合作用 ?［7］，與細(xì)胞核的相互作用導(dǎo)致 DNA 損傷、誘變損傷 ?［8］，影響植物的正常生理和生化過(guò)程 ?［9］.此外，鎘脅迫作用于植物代謝.研究表明，鎘脅迫抑制氨基酸和蛋白質(zhì)的生物合成 ?［10］，影響嘌呤、碳和甘油脂代謝途徑 ?［11］.

雌雄異株植物是植物界的重要組成成分，參與維持陸地生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定. 在雌雄異株植物中，兩性通常在形態(tài)和生理上表現(xiàn)出不同，這可能會(huì)造成群體性別比偏差 ?［12］.雌性偏倚的群體性別比是苔蘚植物種群中一種常見的現(xiàn)象 ?［13］.如齒肋墻蘚（ Syntrichia caninervis） 在海拔較高的區(qū)域雌、雄性別比為17∶1 ?［14］.雌雄間的性別差異在植物面對(duì)環(huán)境脅迫時(shí)尤為明顯，導(dǎo)致雌雄個(gè)體對(duì)環(huán)境變化產(chǎn)生不同的生理代謝響應(yīng).如酸雨脅迫下地錢 （Marchantia polymorpha） 雄配子體抗褪綠和抗氧化的能力要高于雌配子體，表現(xiàn)出對(duì)酸雨脅迫更強(qiáng)的耐受性 ?［15］，鎘脅迫下雌性角齒蘚（ Ceratodon purpureus ）對(duì)鎘的耐受性高于雄性 ?［16］，干旱脅迫下雌性滇楊（ Populus yunnanensis ）葉片中總酚、縮合單寧和類黃酮的含量下降且死亡率高于雄性 ?［17］.這些現(xiàn)象對(duì)種群結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性產(chǎn)生潛在影響，可能導(dǎo)致種群減少甚至滅絕.

地錢是典型的雌雄異株植物，隸屬苔綱（Hepaticae）地錢科（Marchantineae）地錢屬（ Marchantia ）.因其分布廣，易培養(yǎng)，生長(zhǎng)周期短，且基因組測(cè)序已完成，是研究植物響應(yīng)環(huán)境脅迫的模型植物.地錢富含生物活性化合物，如萜類、芳香化合物 ?［18］.研究表明，地錢受到環(huán)境脅迫時(shí)，其代謝會(huì)發(fā)生顯著變化以響應(yīng)脅迫.如創(chuàng)傷脅迫下地錢通過(guò)苯丙素途徑合成木犀草素、芹菜素和isoriccardin C以抵御病原體的入侵 ?［19］.高溫脅迫下地錢通過(guò)加強(qiáng)脫落酸（ABA）信號(hào)通路，以提高耐熱性 ?［20］.低溫條件下，地錢通過(guò)表達(dá)冷誘導(dǎo)的ω-3去飽和酶基因，積累二十碳五烯酸以助于適應(yīng)低溫 ?［21］.前期研究表明，地錢受到鎘脅迫時(shí)，在生理 ?［22］和轉(zhuǎn)錄 ?［23］上的變化表現(xiàn)出性別差異，然而其在代謝層面上的變化尚不明確.因此，研究不同性別地錢在鎘脅迫下的代謝反應(yīng)差異有助于進(jìn)一步理解雌雄異株植物響應(yīng)重金屬脅迫的分子機(jī)制.

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后的“組學(xué)級(jí)聯(lián)”的終點(diǎn) ?［24］.通過(guò)對(duì)有機(jī)體中代謝物的全面和無(wú)偏差的定性和定量分析 ?［25］，可了解有機(jī)體的遺傳特性或?qū)Νh(huán)境變化的響應(yīng).液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Liquid Chromatograph Mass Spectrometer，LC-MS）是植物代謝組學(xué)研究中的主要分析技術(shù) ?［26］，可對(duì)許多極性和半極性代謝物進(jìn)行檢測(cè)和分析 ?［27］，是檢測(cè)脅迫條件下雌雄植株代謝變化和差異分析的高效率途徑.

本研究以地錢為材料，通過(guò)UPLC-Q-TOF-MS測(cè)定鎘脅迫下雌雄地錢中的代謝產(chǎn)物，確定與不同性別相關(guān)的差異代謝物和代謝通路，旨在從代謝水平闡明不同性別地錢對(duì)鎘脅迫的響應(yīng)差異，為深入研究雌雄異株植物生態(tài)適應(yīng)的性別差異和種群動(dòng)態(tài)變化提供理論依據(jù).

2 材料與方法

2.1 材 料

地錢 （Marchantia polymorpha） 均采于四川省成都市武侯區(qū)望江公園（104°5′20″E，30°37′52″N）.

2.2 方 法

2.2.1 地錢的培養(yǎng)和鎘脅迫處理 ?根據(jù)生殖托分別挑選雄配子體和雌配子體進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件參照Yoshikawa等，鎘脅迫處理方式參照楊茹畫等，脅迫處理時(shí)間為21 d，以蒸餾水處理的為對(duì)照，每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù).

2.2.2 樣品制備 ?選取對(duì)照組和處理組中處于有性生殖階段、含生殖托的地錢配子體為材料，分別為雌性對(duì)照組（F 0）、雄性對(duì)照組（M 0）、雌性處理組（F ?21）、雄性處理組（M ?21）.各準(zhǔn)確稱取0.4 g，加液氮研磨成粉，將粉末轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的10 mL離心管中，加入4 mL 80%甲醇（80 mL色譜純甲醇加入20 mL純水），震蕩混勻，4 ℃冰箱過(guò)夜.取4.0 mL溶液于5.0 mL 離心管中，4 ℃下 12 000 r/min離心2 min，取1 mL上清液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，將樣品轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中，準(zhǔn)備進(jìn)樣.每個(gè)處理做3個(gè)生物學(xué)重復(fù).

2.2.3 UPLC-QTOF-MS 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)條件 ?色譜條件：色譜柱為 Agilent ZORBAX SB-C18 Rapid Resolution HD 2.1 mm×100 mm 1.8-Micron；柱溫 40 ℃；進(jìn)樣量5 μL，流速 0.35 mL/min，流動(dòng)相 A：0.1% FA ddH ?2O（甲酸水溶液），流動(dòng)相 B：ACN + 0.1% FA（甲酸乙腈溶液）.終止時(shí)間：15 min，色譜梯度洗脫程序如表1.

在 IDA 模式下采集數(shù)據(jù).離子源：ESI，掃描類型：TOFMSMS.離子噴涂電壓分別為-4500 V（負(fù)離子模式）、5500 V（正離子模式）， CAD氣體7，質(zhì)量掃描范圍（m/z）50～1200.

2.2.4 數(shù)據(jù)處理 ?利用MSDIAL ?［28］（V4.70），對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取、峰對(duì)齊以及降噪處理，普庫(kù)：MassBank of North America （MoNA），保留時(shí)間容忍度0.05，匹配度85，最小峰寬5，最小峰高1000.加合離子：［M+H］ ?+、［M+NH ?4］ ?+、［M+Na］ ?+、［M+CH ?3OH+H］ ?+、［M+K］ ?+、［M+Li］ ?+、［2M+H］ ?+、［2M+NH ?4］ ?+、［2M+Na］ ?+、［2M+K］ ?+，［M-H］ ?-、［M-H ?2O-H］ ?-、［M+Na-2H］ ?-、［M+Cl］ ?-、［M+K-2H］ ?-、［2M-H］ ?-.得到化合物的精確分子量、保留時(shí)間、荷質(zhì)比、加合離子、二級(jí)質(zhì)譜碎片信息、離子響應(yīng)強(qiáng)度和峰面積等數(shù)據(jù)信息.采用MetaboAnalyst 5.0 ?［29］進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)拉依達(dá)準(zhǔn)則（Pauta criterion）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)差（Standard Deviation，SD）過(guò)濾處理.通過(guò)T檢驗(yàn)和Fold change（FC）篩選性別間和性別內(nèi)差異代謝物，篩選標(biāo)準(zhǔn)為 P <0.05（經(jīng)FDR矯正）、|log ?2（fold change）|>1.以log 2（FC）的值表示差異代謝物上調(diào)（log 2（FC）>0）或下調(diào)（log 2（FC）<0）的程度.利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路分析，GraphPad Prism 9.0.0作代謝物含量圖，jven作韋恩圖，R（V4.1.0）作KEGG通路富集圖.

3 結(jié)果與分析

3.1 鎘脅迫下雌雄地錢表型特征

用100 mg/L氯化鎘溶液處理21 d后，雌雄地錢均出現(xiàn)了失綠現(xiàn)象，雌性失綠程度較雄性更嚴(yán)重（圖1）.

3.2 鎘脅迫下雌雄地錢的代謝組分析

基于物質(zhì)的分子量、保留時(shí)間、質(zhì)譜碎片信息和85%匹配度，本研究共檢測(cè)出320種代謝產(chǎn)物，包括121種初生代謝產(chǎn)物和199種次生代謝物（表2）.物質(zhì)種類最豐富的是脂質(zhì)（60種），其次是類黃酮（47種）、苯類（31種）、萜類（21種）、氨基酸（19種）、有機(jī)酸（18種）、苯丙素類（18種）、胺（10種）、生物堿（10種）、糖類（9種）等.

對(duì)M 0、F 0、M ?21、F ?21進(jìn)行偏最小二乘判別分析（Partial Least Squares Discriminant Analysis，PLS-DA）（圖2a）.component 1分離了對(duì)照組和處理組，解釋了92.1%的總變異，表明鎘處理誘導(dǎo)了地錢的生物學(xué)響應(yīng)；component 2分離了對(duì)照組和處理組中的雌性和雄性地錢，解釋了3%的總變異，表明雌雄間存在顯著的生物學(xué)差異.苔色酸（Orsellinic acid）、脫鎂葉綠酸鹽A（Pheophorbide A）、芥酸酰胺（Erucamide）、月桂基二乙醇胺（Lauryldiethanolamine）、3，4-二羥基苯乙酸（3，4-Dihydroxyphenylacetic acid）在component 1上載荷較大；苔色酸、芹菜素（Apigenin）、木犀草素（Luteolin）在component 2上載荷較大（圖2b）.通過(guò)交叉驗(yàn)證（Cross-Validation，CV）計(jì)算得出累計(jì) Q ?2=0.783， R ?2=0.935，說(shuō)明本模型具有良好的穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)能力.對(duì)本模型進(jìn)行1000次置換檢驗(yàn)， P <0.05，說(shuō)明構(gòu)建的模型并未產(chǎn)生過(guò)擬合現(xiàn)象.以上結(jié)果表示，本模型可用于不同處理和性別的識(shí)別與區(qū)分.

3.3 ?鎘脅迫下雌雄地錢性別間差異代謝物及代謝通路分析

為探明鎘脅迫下，地錢響應(yīng)脅迫的代謝變化，以 P <0.05和|log2（FC）|>1為標(biāo)準(zhǔn)，分別對(duì)地錢在鎘處理后性別內(nèi)/間的代謝物變化進(jìn)行了篩選和分析.結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，處理組雌性地錢中的代謝產(chǎn)物有97種上調(diào)， 105種下調(diào)；處理組雄性地錢中的代謝產(chǎn)物有104種上調(diào)，87種下調(diào)（圖3）.在上調(diào)或下調(diào)的差異代謝物中，雌性特有上調(diào)、下調(diào)代謝物分別是9種和30種；雄性特有上調(diào)、下調(diào)代謝物分別是16種和12種；雌雄共同上調(diào)、下調(diào)代謝物分別是88種和75種.（圖3）.

地錢響應(yīng)鎘脅迫的差異代謝物主要有9類，其中，脂質(zhì)類代謝物最多（雌性上/下調(diào)23/12種；雄性上/下調(diào)25/12種），其次是黃酮類（雌性上/下調(diào)7/20種；雄性上/下調(diào)10/15種），苯類、氨基酸類、苯丙素類、萜類、有機(jī)酸類和糖類代謝物數(shù)量依次減少，胺類代謝物數(shù)量最少（圖4）.

分別對(duì)上述各性別內(nèi)差異代謝物進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果表明雌性、雄性差異代謝物分別富集到53條、57條代謝通路.其中，亞油酸代謝，次生代謝物的生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，異喹啉生物堿生物合成，C5-支鏈二元酸代謝，酪氨酸代謝，檸檬酸循環(huán)，角質(zhì)、軟木脂和蠟的生物合成，色氨酸代謝，核黃素代謝，α-亞麻酸代謝等11條代謝通路在雌雄地錢中均顯著富集（Pathway impact>0.1）.

對(duì)性別特有上/下調(diào)的差異代謝物進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果表明，雌性特異性上調(diào)、下調(diào)差異代謝物分別富集到1條（圖 5a）、10條（圖 5b）代謝通路；雄性特異性上調(diào)、下調(diào)差異代謝物分別富集到10條（圖 5c）、7條（圖 5d）代謝通路.其中，類黃酮生物合成途徑在雌、雄地錢的性別特異性變化代謝物中均有富集，玉米素生物合成和嘌呤代謝在雄性中上調(diào)而在雌性中下調(diào).因此，選擇類黃酮生物合成、玉米素生物合成和嘌呤代謝途徑進(jìn)行分析.

對(duì)參與類黃酮生物合成代謝途徑的差異代謝物及其衍生物進(jìn)行分析.結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，柚皮素查爾酮（Naringenin chalcone）在雌性地錢中顯著上調(diào)（ P <0.05，log2（FC）=3.8828），在雄性中被過(guò)濾，未參與差異分析.芹菜素、木犀草素、矢車菊素-3-O-半乳糖苷（Cyanidin-3-O-galactoside）在雌性地錢中顯著下調(diào)（ P <0.05，log2（FC）分別為-1.5878、-1.1861、-7.9682）；在雄性中差異不顯著（ P >0.05）.刺槐苷（Kaempferol-3-O-robinoside-7-O-rhamnoside）在雄性地錢中顯著上調(diào)（ P <0.05，log2（FC）= 12.907），在雌性中無(wú)顯著差異（ P >0.05）.槲皮素（Quercetin）在雄性地錢中顯著上調(diào)（ P <0.05，log2（FC）=2.3982），在雌性中被過(guò)濾，未參與差異分析.對(duì)參與玉米素生物合成和嘌呤代謝代謝途徑的差異代謝物進(jìn)行分析，雌性地錢中腺嘌呤（Adenine）、腺苷（Adenosine）顯著下調(diào)（ P <0.05，log2（FC）分別為 -1.7287、 -1.9712），而在雄性中沒(méi)有顯著差異（ P >0.05）.雄性地錢中腺苷一磷酸（AMP）、肌苷（Inosine）顯著上調(diào)（ P <0.05，log2（FC） 分別為2.5716、2.0931），在雌性沒(méi)有顯著差異（ P >0.05）（圖6）.

為探明鎘脅迫下地錢性別間的代謝水平差異，以 P <0.05和|log2（FC）|>1為標(biāo)準(zhǔn)，分別比較處理組和對(duì)照組中雌雄地錢各代謝物含量，結(jié)果顯示，對(duì)照組雌性地錢中有17種代謝物的含量顯著高于雄性，1種代謝物的含量低于雄性.處理組雌性地錢中柚皮素查爾酮含量顯著高于雄性（ P <0.05，log2（FC）=11.051）.對(duì)這19種差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析，共富集到8代謝通路，包括類黃酮生物合成、玉米素生物合成和嘌呤代謝等.

類黃酮生物合成途徑中，對(duì)照組雌性地錢中芹菜素和木犀草素的含量顯著高于雄性（ P <0.05，log2（FC）分別為1.677和1.3649）；玉米素生物合成和嘌呤代謝途徑中，對(duì)照組雌性地錢中腺嘌呤和腺苷的含量顯著高于雄性（ P <0.05，log2（FC）分別為1.6224和2.0697）.

4 討 論

本研究利用LC-MS技術(shù)，對(duì)鎘脅迫下地錢的代謝物進(jìn)行了定性和定量分析，共檢測(cè)到320種代謝產(chǎn)物，其中包括脂質(zhì)、氨基酸等121種初生代謝產(chǎn)物和類黃酮等199種次生代謝產(chǎn)物.PLS-DA分析顯示12個(gè)樣本聚成四個(gè)不同的簇，指示鎘脅迫誘導(dǎo)了地錢的生物學(xué)響應(yīng)，代謝產(chǎn)物出現(xiàn)了明顯的組間和性別間差異.其中，部分脂質(zhì)、氨基酸、有機(jī)酸等代謝物的含量顯著變化，而且參與類黃酮生物合成、玉米素生物合成和嘌呤代謝的物質(zhì)在兩性中的變化趨勢(shì)不同.

重金屬對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用，使植物體內(nèi)的代謝過(guò)程發(fā)生紊亂，直接影響植物生長(zhǎng)發(fā)育 ?［30］.與此同時(shí)，植物通過(guò)調(diào)整某些代謝物含量以響應(yīng)脅迫.如鎘脅迫下水稻（ Oryza sativa ）脂質(zhì) ?［31］、有機(jī)酸和氨基酸 ?［32］分泌量明顯增加.本研究中，處理組與相應(yīng)的對(duì)照組相比，共有163種相同代謝物發(fā)生顯著變化.顯著上調(diào)的主要為脂質(zhì)和氨基酸，顯著下調(diào)的主要為類黃酮和糖類，有機(jī)酸類部分上調(diào)部分下調(diào).涉及到脂質(zhì)、氨基酸代謝以及次生代謝產(chǎn)物的生物合成等代謝途徑.脂質(zhì)是細(xì)胞膜的組成成分，氨基酸和有機(jī)酸參與植物中重金屬的積累與解毒 ?［33，34］.這三類物質(zhì)在地錢中上調(diào)，推測(cè)是用于維護(hù)細(xì)胞膜正常的結(jié)構(gòu)和功能，螯合重金屬，維持滲透平衡.此外，與鎘脅迫下曼陀羅（ Datura Stramonium ）中可溶性碳水化合物下調(diào)的結(jié)果類似 ?［35］，鎘處理后地錢的碳固定通路代謝水平下降，糖類下調(diào).這將會(huì)影響地錢的正常生長(zhǎng)發(fā)育.

與前期對(duì)地錢響應(yīng)鎘脅迫的轉(zhuǎn)錄組性別差異研究結(jié)果相同 ?［23］，雄性地錢中性別差異代謝物也顯著富集在類黃酮生物代謝途徑上.黃酮類物質(zhì)已被證實(shí)在植物抵抗環(huán)境脅迫過(guò)程中起著核心作用 ?［36］.研究表明，干旱脅迫下黃絲瓜蘚（ Pohlia nutans ）中類黃酮上調(diào)，與抗氧化酶和解毒蛋白的上調(diào)起協(xié)同作用 ?［37］.UV-B脅迫的地錢（ M. polymorpha ）中木犀草素上調(diào)以提高抗氧化防御水平 ?［38］.鎘脅迫下洋甘菊（ Matricaria chamomilla ）中的芹菜素 ?［39］和鉬（Mo）脅迫下大豆（ Glycine max ）中的槲皮素 ?［40］上調(diào)以滿足抗氧化需求和螯合重金屬.然而在脅迫條件下，類黃酮含量并不總是增加.類黃酮的合成依賴于初生代謝提供的碳源.研究表明，鎘脅迫下，刺槐（ R. pseudoacacia ）葉片中可溶性糖與總黃酮含量顯著正相關(guān) ?［41］.干旱脅迫下，菊科植物 Achillea pachycephala 中總黃酮含量在脅迫后期下降，歸因可用碳的減少 ?［42］.本研究中，對(duì)照組雌性地錢芹菜素、木犀草素以及總黃酮含量（804.56 μg/gFW）顯著大于雄性（508.99 μg/gFW）（ P <0.05），指示雌性類黃酮生物合成水平更高.鎘脅迫21天后，雌、雄地錢中總黃酮含量均顯著下降.這可能是由于可用碳的減少.在類黃酮合成通路中，柚皮素查爾酮通過(guò)合成柚皮素進(jìn)一步生成黃酮，也可以通過(guò)合成二氫黃酮醇進(jìn)一步生成黃酮醇.研究表明，來(lái)自于黃絲瓜蘚（ Pohlia nutans ）的I型黃酮合酶（PnFNSI）催化柚皮素合成芹菜素，該酶的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了植物中黃酮的累積 ?［36］.本研究中，受鎘脅迫后，雌性中柚皮素查爾酮上調(diào)，芹菜素和木犀草素下調(diào)（圖7）.這可能是由于鎘降低了雌性中催化芹菜素和木犀草素合成的酶活性.與雌性不同，雄性中槲皮素和刺槐苷含量顯著上調(diào)（圖7）. 有研究表明類黃酮抗氧化能力和羥基數(shù)量有關(guān) ?［43］，具有五個(gè)羥基的槲皮素表現(xiàn)出比山奈酚、芹菜素和木犀草素更強(qiáng)的抗氧化活性 ?［44］.本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)鎘脅迫下地錢的生理響應(yīng)研究表明，鎘脅迫下雄性地錢中的脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化物酶（POD）活性顯著上調(diào) ??［22］.因此，推測(cè)雄性通過(guò)上調(diào)黃酮醇與抗氧化酶共同抵抗氧化性損傷.

腺嘌呤和腺苷通過(guò)嘌呤代謝途徑合成DNA或RNA.同時(shí)，腺嘌呤經(jīng)玉米素生物合成途徑，由類異戊二烯取代N6位生成玉米素.玉米素是細(xì)胞分裂素家族成員，通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖分化參與植物生長(zhǎng)發(fā)育 ?［45］，同時(shí)，細(xì)胞分裂素參與葉綠體發(fā)育和葉綠素生物合成，并具有保護(hù)葉綠素免受氧化降解的作用 ?［46］.對(duì)照組雌性地錢中腺嘌呤和腺苷含量顯著高于雄性，經(jīng)鎘處理后，雌性中腺嘌呤和腺苷含量顯著下降，雄性中AMP和肌苷含量顯著上升.玉米素生物合成和嘌呤代謝水平在雌性中下調(diào)而在雄性中上調(diào).對(duì)地錢響應(yīng)鎘脅迫的轉(zhuǎn)錄組性別差異研究表明，響應(yīng)鎘脅迫的植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在雌性中下調(diào)而在雄性中上調(diào) ?［23］，本研究結(jié)果從代謝層面證實(shí)了這一點(diǎn).研究表明，鎘脅迫降低了黑麥草（ Lolium perenne ）中細(xì)胞分裂素生物合成基因的表達(dá)，玉米素含量顯著降低，腋芽的生長(zhǎng)受抑制 ?［47］.砷（As）脅迫下擬南芥 （Arabidopsis thaliana） 中的細(xì)胞分裂素水平降低， 由此增強(qiáng)了硫醇生物合成基因的表達(dá)，累積包括谷胱甘肽（GSH）在內(nèi)的硫醇化合物以固存As ?［48］.前期的生理響應(yīng)研究也發(fā)現(xiàn)，鎘脅迫下雌雄地錢中GSH含量地均顯著上調(diào)，且處理20 d后雌性的GSH顯著高于雄性 ?［22］. 因此，結(jié)合代謝組研究結(jié)果，推測(cè)雌性地錢通過(guò)下調(diào)玉米素合成水平，誘導(dǎo)GSH的合成以響應(yīng)鎘脅迫. 但重金屬脅迫下，植物中細(xì)胞分裂素水平對(duì)GSH的合成并不總是呈負(fù)效應(yīng). 如在綠藻（ Chlorella vulgaris ）中施用外源細(xì)胞分裂素可抑制重金屬脅迫下葉綠素的降解，并通過(guò)刺激抗氧化系統(tǒng)積累GSH抑制氧化爆發(fā) ?［49］.鎘脅迫下，盡管雄性地錢中葉綠素a/b含量也下降，但下降程度顯著低于雌性 ?［25］. 圖1也可看出雄性的失綠程度也較雌性輕. 因此，推測(cè)鎘脅迫下雄性地錢可能是通過(guò)上調(diào)玉米素合成，來(lái)緩解葉綠素的降解，以維持正常光合作用.至于雄性地錢中內(nèi)源玉米素與GSH間是否存在正效應(yīng)關(guān)系有待更深入的研究.

綜上所述，地錢在代謝層面上對(duì)鎘脅迫的響應(yīng)出現(xiàn)了性別差異.雌性地錢降低了玉米素生物合成和嘌呤代謝水平，誘導(dǎo)GSH的合成以提高耐受性.雄性地錢則上調(diào)了玉米素合成，以緩解葉綠素的降解，來(lái)維持正常光合作用，同時(shí)還通過(guò)上調(diào)類黃酮生物合成途徑中的槲皮素和刺槐苷等具有抗氧化活性的次生代謝產(chǎn)物，與上調(diào)的抗氧化系統(tǒng)共同作用來(lái)抵抗氧化性損傷.

參考文獻(xiàn)：

［1］ ??Nagajyoti P C， Lee K D， Sreekanth T V M. Heavy metals， occurrence and toxicity for plants： a review ［J］. Environ Chem Lett， 2010， 8： 199.

［2］ ?Su T T， Fu L B， Kuang L H， ?et al . Transcriptome-wide m6A methylation profile reveals regulatory networks in roots of barley under cadmium stress ［J］. J Hazard Mater， 2022， 423： 127140.

［3］ ?Kintlová M， Vrána J， Hobza R， ?et al . Transcriptome response to cadmium exposure in barley （ Hordeumvulgare ?L.） ［J］. Front Plant Sci， 2021， 12： 629089.

［4］ ?Cuypers A， Plusquin M， Remans T， ?et al . Cadmium stress： an oxidative challenge ［J］. Biometals， 2010， 23： 927.

［5］ ?Maresca V， Bellini E， Landi S， ?et al . Biological responses to heavy metal stress in the moss Leptodictyum riparium （Hedw.） Warnst ［J］. Ecotoxicol Environ Saf， 2022， 229： 113078.

［6］ ?Du Y Z， Zhang D W， Zhou D G， ?et al . The growth of plants and indigenous bacterial community were significantly affected by cadmium contamination in soil-plant system ［J］. AMB Express， 2021， 11： 103.

［7］ ?Hatamian M， Rezaei Nejad A， Kafi M， ?et al . Interaction of lead and cadmium on growth and leaf morphophysiological characteristics of European hackberry （ Celtis australis ） seedlings ［J］. Chem Biol Technol Agric， 2020， 7： 1.

［8］ ?Fusconi A， Repetto O， Bona E， ?et al . Effects of cadmium on meristem activity and nucleus ploidy in roots of ?Pisum sativum ?L. cv. Frisson seedlings ［J］. Environ Exp Bot， 2006， 58： 253.

［9］ ?Pereira D A R， Furtado D A A， Silva P L， ?et al . Photosynthetic， antioxidative， molecular and ultrastructural responses of young cacao plants to Cd toxicity in the soil Ecotoxicol ［J］.Environ Saf， 2017， 144： 148.

［10］ ?Sutter K， Jung K， Krauss G J. Effects of heavy metals on the nitrogen metabolism of the aquatic moss ?Fontinalis antipyretica ?L. ex Hedw. A 15N tracer study ［J］. Environ Sci Pollut Res Int， 2002， 9： 417.

［11］ Navarro-Reig M， Jaumot J， Pi ?n ～ a B， ?et al . Metabolomic analysis of the effects of cadmium and copper treatment in ?Oryza sativa ?L. using untargeted liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry and all-ion fragmentation ［J］. Metallomics， 2017， 9： 660.

［12］ Petry W K， Soule J D， Iler A M， ?et al . Sex-specific responses to climate change in plants alter population sex ratio and performance ［J］. Science， 2016， 353： 69.

［13］ Bisang I， Hedens L. Sex ratio patterns in dioicous bryophytes re-visited ［J］. J Bryol， 2005， 27： 207.

［14］ Baughman J T， Payton A C， Paasch A E， ?et al . Multiple factors influence population sex ratios in the Mojave Desert moss Syntrichia caninervis ［J］. Am J Bot， 2017， 104： 733.

［15］ 柴淑麗， 陳亞菲， 樊曉旭， 等. 地錢（ Marchantia polymorpha ）雌雄配子體對(duì)酸雨脅迫的耐受性差異［J］. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)， 2019， 25： 0100.

［16］ Boquete M T， Lang I， Weidinger M， ?et al . Patterns and mechanisms of heavy metal accumulation and tolerance in two terrestrial moss species with contrasting habitat specialization ［J］. Environ Exp Bot， 2021， 182： 104336.

［17］ Zhang R， Liu J Y， Liu Q S， ?et al . Sexual differences in growth and defence of Populus yunnanensis under drought stress ［J］. Can J For Res， 2019， 49： 491.

［18］ Asakawa Y， Ludwiczuk A， Nagashima F. Phytochemical and biological studies of bryophyte ［J］.Phytochemistry， 2013， 91： 52.

［19］ Yoshikawa M， Luo W F， Tanaka G， ?et al . Wounding stress induces phenylalanine ammonia lyases， leading to the accumulation of phenylpropanoids in the model liverwort Marchantia polymorpha ［J］. Phytochemistry， 2018， 155： 30.

［20］ Marchetti F， Cainzos M， Cascallares M， ?et al . Heat stress in Marchantia polymorpha： Sensing and mechanisms underlying a dynamic response ［J］. Plant Cell Environ， 2021， 44： 2134.

［21］ Takemura M， Hamada T， Kida H. Cold-Induced Accumulation of ω-3 Polyunsaturated Fatty Acid in a Liverwort， ?Marchantia polymorpha ?L. ［J］. Biosci Biotechnol Biochem， 2012， 76： 785.

［22］ 楊茹畫， 金瑭， 代玉烜， 等．雌雄異株地錢（Marchantia polymorpha）對(duì)鎘脅迫生理響應(yīng)的性別差異［J］. 廣西植物， 2020， 40： 1671．

［23］ 徐海霞， 何靜， 易航， 等. 鎘脅迫下地錢轉(zhuǎn)錄組的性別特異性響應(yīng)機(jī)制［J］. 植物學(xué)報(bào)， 2022， 57： 182.

［24］ Dettmer K， Aronov P A， Hammock B D. Mass spectrometry-based metabolomics ［J］. Mass Spectrom Rev， 2007， 26， 51.

［25］ Fiehn O. Metabolomics -the link between genotypes and phenotypes ［J］. Plant Mol Biol， 2002， 48， 155.

［26］ Gika H G， Theodoridis G A， Plumb R S， ?et al .Current practice of liquid chromatography-mass spectrometry in metabolomics and metabonomics ［J］. J Pharm Biomed Anal， 2014， 87： 12.

［27］ Cajka T， Fiehn O. Toward merging untargeted and targeted methods in mass spectrometry-based metabolomics and lipidomics ［J］. Anal Chem， 2016， 88： 524.

［28］ Tsugawa H， Cajka T， Kind T， ?et al . MS-DIAL： Data-independent MS/MS Deconvolution for Comprehensive Metabolome Analysis ［J］， Nat Methods， 2015， 12： 523.

［29］ Pang Z， Chong J， Zhou G， ?et al . MetaboAnalyst 5.0： narrowing the gap between raw spectra and functional insights ［J］. Nucleic Acids Res， 2021， 49： W388.

［30］ Maresca V， Bellini E， Landi S， ?et al . Biological responses to heavy metal stress in the moss Leptodictyum riparium （Hedw.） Warnst ［J］. Ecotoxicol Environ Saf， 2022， 229： 113078.

［31］ Liu C， Lan M M， He E K. ?et al . Phenomic and metabolomic responses of roots to cadmium reveal contrasting resistance strategies in two rice cultivars （ Oryza sativa ?L.） ［J］. Soil Ecol Lett， 2021， 3： 220.

［32］ Fu H J， Yu H Y， Li T X， ?et al . Influence of cadmium stress on root exudates of high cadmium accumulating rice line （ Oryza sativa ?L.） ［J］. Ecotoxicol Environ Saf， 2018， 150： 168.

［33］ Rabêlo F H S， Fernie A R， Navazas A， ?et al . A glimpse into the effect of sulfur supply on metabolite profiling， glutathione and phytochelatins in ?Panicum maximum ?cv. Massai exposed to cadmium ［J］. Environ Exp Bot， 2018， 151： 76.

［34］ Sun X M， Zhang J X， Zhang H J， ?et al .The responses of ?Arabidopsis thaliana ?to cadmium exposure explored via metabolite profiling ［J］.Chemosphere， 2010， 78： 840.

［35］ Shirkhani Z， Chehregani R A， Mohsenzadeh F. Effects of soil and foliar cadmium application on morphological， physiological， genetic and epigenetic characteristics of ?Datura stramonium ?L. ［J］. Int J Environ Sci Technol， 2022， 19： 9067.

［36］ Wang H J， Liu S H， Wang T L， ?et al . The moss flavone synthase I positively regulates the tolerance of plants to drought stress and UV-B radiation ［J］. Plant Science， 2020， 298： 110591.

［37］ Fang S， Li T， Zhang P， ?et al . Integrated transcriptome and metabolome analyses reveal the adaptation of Antarctic moss Pohlia nutans to drought stress ［J］. Front Plant Sci. 2022， 13： 924162.

［38］ Kenneth R， Markham， Ryan K G， ?et al . An increase in the luteolin： apigenin ratio in ?Marchantia polymorpha ?on UV-B enhancement ［J］. Phytochemistry， 1998， 48： 791.

［39］ Zarinkamar F， Moradi A， Davoodpour M. Ecophysiological， anatomical， and apigenin changes due to uptake and accumulation of cadmium in ?Matricaria chamomilla ?L. flowers in hydroponics ［J］. Environ Sci Pollut Res， 2021， 28： 55154.

［40］ Xu S J， Hu C X， Hussain S， ?et al . Metabolomics analysis reveals potential mechanisms of tolerance to excess molybdenum in soybean seedlings ［J］. Ecotoxicol Environ Saf， 2018， 164： 589.

［41］ Zhang C Y， Jia X， Zhao Y H， ?et al .The combined effects of elevated atmospheric CO2 and cadmium exposure on flavonoids in the leaves of ?Robinia pseudoacacia ?L. seedlings ［J］. Ecotoxicol Environ Saf， 2021， 210： 111878.

［42］ Gharibi S， Ebrahim Sayed Tabatabaei B， Saeidi G， ?et al .The effect of drought stress on polyphenolic compounds and expression of flavonoid biosynthesis related genes in ?Achillea pachycephala ?Rech.f ［J］. Phytochemistry， 2019， 162： 90.

［43］ Rice-Evans C A， Miller N J， Paganga G. Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids ［J］.Free Radic Biol Med， 1996， 20： 933.

［44］ Tian C L， Liu X， Chang Y， ?et al .Investigation of the anti-inflammatory and antioxidant activities of luteolin， kaempferol， apigenin and quercetin ［J］. S Afr J Bot， 2021， 137： 257.

［45］ Keshishian E A， Rashotte A M. Plant cytokinin signaling ［J］. Essays Biochem， 2015， 58： 13.

［46］ Hude ?c ?ˇ ek M， Noková V， Plíhalová L， ?et al . Plant hormone cytokinin at the crossroads of stress priming and control of photosynthesis ［J］. Front Plant Sci， 2023， 13： 1103088.

［47］ Niu K J， Zhang R， Zhu R T， ?et al .Cadmium stress suppresses the tillering of perennial ryegrass and is associated with the transcriptional regulation of genes controlling axillary bud outgrowth ［J］. Ecotoxicol Environ Saf， 2021， 212： 112002.

［48］ Mohan T C， Castrillo G， Navarro C， ?et al . Cytokinin determines thiol-mediated arsenic tolerance and accumulation ［J］. Plant Physiol， 2016， 171： 141.

［49］ Piotrowska-Niczyporuk A， Bajguz A， Zambrzycka E， ?et al . Phytohormones as regulators of heavy metal biosorption and toxicity in green alga Chlorella vulgaris （Chlorophyceae） ［J］. Plant Physiol Bioch， 2012， 52： 52.