王璐瑤,丁美云,孫玉婷,張東向,2,李珊珊,2,金忠民,2,蘭紅宇,劉麗杰,2

(1.齊齊哈爾大學生命科學與農林學院,黑龍江齊齊哈爾 161006; 2.黑龍江省抗性基因工程與寒地生物多樣性保護重點實驗室,黑龍江齊齊哈爾 161006; 3.黑龍江省農業(yè)科學院齊齊哈爾分院,黑龍江齊齊哈爾 161006)

低溫是限制植物生長的主要環(huán)境因素之一,東農冬麥1號是首例可以在黑龍江省高寒地區(qū)過冬的超強冬性小麥品種[1],可以抵御-30 ℃的低溫。此外,東農冬麥1號能夠提高黑龍江省可耕土地的復種指數,可與大豆等作物套種,不僅可實現“兩年三熟”,增加土地資源利用率,而且解決了大豆的重茬問題,這對我國糧食增產具有重要的意義。

wcor413-like基因屬于COR(cold-regulation)基因家族[2]。COR基因是一類在低溫誘導下可快速表達的植物抗寒基因,也稱為低溫誘導( low temperature induced,LTI)基因[3]。研究發(fā)現,小麥在抵御嚴寒時,COR基因編碼的蛋白可保護細胞的結構[3-6]。COR基因啟動子區(qū)含有C-重復元件/脫水響應元件(C-repeat/dehydration responsive element, CRT/DRE)[4],在低溫脅迫下,細胞膜發(fā)生相變,改變了細胞膜的流動性,細胞內肌動蛋白骨架進行重排,Ca2+離子通道開啟,使得Ca2+離子濃度升高,誘導COR基因的表達[7]。CRT/DRE順式作用元件的調控途徑:順式作用元件CRT/DRE與轉錄活性因子CBF(C-repeat binding factor)結合,促進COR基因的表達,進而提高植物的抗寒性[8-9]。因此,研究低溫脅迫下wcor413-like基因的表達模式,為了解植物的抗寒機制奠定了基礎。

油菜素內酯 (brassinosteroid,BR) 作為一種類固醇激素,可調控作物細胞的伸長、分裂和分化[10-12],增強作物的抗逆性[13-16],進而有利于提高作物的產量[17]。BR在植物體內的含量極低,但其生理活性極高,極低濃度的BR處理就可以對植物產生明顯的影響[18-20]。研究表明,在低溫脅迫下,BR可以減輕低溫對辣椒[20]、番茄[21]等植物的傷害。目前,關于BR對冬小麥抗寒基因表達的影響尚未見報道。本研究對寒地冬小麥東農冬麥1號中的wcor413-like基因進行克隆,利用生物信息學對wcor413-like基因cDNA序列進行分析,利用qRT-PCR技術分析不同溫度(5 ℃、0 ℃、-10 ℃和-25 ℃)處理下,BR對冬小麥葉片和分蘗節(jié)中wcor413-like基因表達量的影響,探索wcor413-like調控冬小麥的抗寒機制,以期為研究冬小麥在高寒地區(qū)安全越冬提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

試驗材料為寒地冬小麥品種東農冬麥1號(TriticumaestivumL.),由齊齊哈爾大學生命科學與農林學院植物代謝生理實驗室提供。供試材料于2020年9月播種于齊齊哈爾大學試驗田中,株距5 cm,行長1.6 m,行距20 cm,常規(guī)田間管理。于小麥三葉期時,在葉片表面噴施濃度為0.1 mg·L-1的BR溶液,對照組噴灑蒸餾水,在此期間實時監(jiān)測室外溫度,連續(xù)10 d最低溫度平均值分別為5 ℃、0 ℃、 -10 ℃和-25 ℃時,對冬小麥葉片和分蘗節(jié)進行取樣。所取樣品用蒸餾水進行沖洗,擦干后用錫紙包裹后放入液氮中進行速凍,并放于-80 ℃冰箱進行冷凍保存。

1.2 RNA的提取及cDNA的合成

分別取0.1 g葉片和分蘗節(jié),用Trizol法提取RNA,用微量紫外分光光度計檢測RNA的濃度后,于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。利用反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa,大連)合成cDNA第一條鏈。

1.3 wcor413-like基因的克隆

在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲得小麥wcor413-like基因的全長序列(GenBank登錄號:AY057118.1),用Primer 5設計特異性引物wcor413-like-F/R(表1),按照試劑盒Premix TaqTM(TaKaRa,大連)說明書的PCR反應體系進行PCR擴增,PCR反應程序: 94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,65.5 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min 20 s,30個循環(huán);72 ℃ 10 min。用膠回收試劑盒(景新生物,杭州)將目的條帶進行回收,并連接到pMD18-T Vector(TaKaRa,大連)載體上,連接產物導入大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細胞DH5α中,挑取陽性單克隆搖培12 h,隨后進行菌液PCR檢測,利用質粒提取試劑盒(索萊寶,北京)進行質粒提取,將提取的質粒送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序。

1.4 wcor413-like蛋白的生物信息學分析

利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)對wcor413-like蛋白的理化性質進行分析。利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr)預測蛋白質的二級結構;利用Swiss-model(https://swissmodel.expasy.org/)預測wcor413-like蛋白的三級結構。利用MEGA 5.0構建小麥與其他10種植物wcor413-like蛋白的系統(tǒng)進化樹,利用MEME-Submission(https://meme-suite.org/meme/tools/meme)對這些物種的蛋白序列進行比對。利用IncLocator在線數據庫(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/lncLocator/)對蛋白進行亞細胞定位。

1.5 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析

根據wcor413-like基因的cDNA序列設計qRT-PCR引物wcor413-like-2F/2R(表1),以TaActin為內參基因,按照TB Green Premix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa,大連)說明書的PCR反應體系對基因進行qRT-PCR分析。PCR反應程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,共40個循環(huán)。用2-ΔΔCt法進行計算基因的表達量,用SPSS軟件進行差異顯著性分析。所有的處理均進行3次生物學重復。

表1 本研究用到的引物信息

2 結果與分析

2.1 wcor413-like基因的克隆結果及其序列分析

分別以冬小麥東農冬麥1號分蘗節(jié)和葉片的cDNA為模板進行PCR擴增,均可擴增出629 bp的條帶(圖1)。將目的片段的預測結果提交到NCBI數據庫(Gene ID:2571178),分析表明,wcor413-like基因的開放閱讀框區(qū)為629 bp,可編碼209個氨基酸。

M:DL2000;1:H2O;2:分蘗節(jié);3:葉片。

2.2 wcor413-like蛋白的生物信息學分析

2.2.1 wcor413-like蛋白的理化性質分析

ProtParam分析結果表明,wcor413-like蛋白的分子式為C1044H1628N274O268S11,相對分子質量為22 658.75 Da,屬于穩(wěn)定蛋白質,穩(wěn)定指數為 44.44,理論等電點(pI)為9.21。wcor413-like蛋白的氨基酸組成中,亮氨酸的含量最高,占比15.8%,表面帶負電荷的氨基酸(天冬氨酸+谷氨酸)殘基有11個,表面帶正電荷的氨基酸(精氨酸+賴氨酸)殘基有17個,平均親水系數為0.589(表2)。

表2 冬小麥wcor413-like蛋白的氨基酸組成

2.2.2 蛋白二、三級結構預測

利用SOPMA對wcor413-like蛋白進行二級結構預測,結果(圖2A)顯示, wcor413-like蛋白含有102個α-螺旋(H),占比49.4 %;13個β-轉角(T),占比6.25 %;46個延伸片段(E),占比22.12%;47個無規(guī)則卷曲(C),占比22.6%。 利用Swiss-model對wcor413-like蛋白的三級結構進行預測,結果(圖2B)顯示,該蛋白的三級結構與二級結構一致。

圖2 wcor413-like蛋白的二級結構(A)和三級結構(B)

2.2.3 wcor413-like蛋白的系統(tǒng)進化樹分析以及同源蛋白序列比對

利用MEGA 5.0構建小麥與二粒小麥(Triticumdicoccoides)、大麥(Hordeumvulgare)、柳枝稷(Panicumvirgatum)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、玉米(Zeamays)、毒麥(Loliumtemulentum)、粟米(Setariaitalica)、割手密(Saccharumspontaneum)、高粱(Sorghumbicolor)以及模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)wcor413-like蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹,結果(圖3)顯示,小麥與大麥、二粒小麥的wcor413-like蛋白親緣關系最近,而與玉米和高粱wcor413-like蛋白的親緣關系較遠。利用Clustal軟件對上述植物wcor413-like蛋白的基序進行比對,結果(圖4)顯示,除擬南芥和玉米含有一個相同的基序外,小麥與其他8種植物(二粒小麥、大麥、柳枝稷、二穗短柄草、毒麥、粟米、割手密、高粱)均含有三個相同的基序。

圖3 小麥與其他10種植物wcor413-like蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 不同物種的wcor413-like蛋白質motif分析

2.2.4 wcor413-like蛋白的亞細胞定位預測結果

利用IncLocator在線工具對wcor413-like蛋白進行亞細胞定位預測,結果(表3)顯示,wcor413-like蛋白在細胞質中占比最大,為 32.69%;其次為核糖體和細胞溶質,分別占比 21.26%和16.99%;在外泌體和細胞核中占比較小,分別為19.11%和9.95%。

表3 wcor413-like蛋白亞細胞定位預測結果

2.3 低溫脅迫下BR處理對冬小麥葉片和分蘗節(jié)中 wcor413-like基因表達模式的影響

從表4可以看出,隨著溫度的降低,冬小麥葉片中wcor413-like基因的表達量在對照組中呈先升后降的變化趨勢,在-10 ℃達到峰值,顯著高于5 ℃和-25 ℃的表達量;在BR處理組中呈先降后升的變化趨勢,在-25 ℃達到峰值,顯著高于5 ℃、0 ℃和-10 ℃的表達量。分蘗節(jié)中wcor413-like基因的表達量在對照組中呈先降后升的變化趨勢,在BR處理組中呈“升-降-升”的變化趨勢,均在-25 ℃達到峰值,且均顯著高于5 ℃、0 ℃和-10 ℃的表達量。與對照組相比,BR處理提高了冬小麥葉片中wcor413-like基因在5 ℃、-10 ℃和-25 ℃的表達量;降低了冬小麥分蘗節(jié)中wcor413-like基因在5 ℃、0 ℃、 -10 ℃和-25 ℃的表達量,均在-25 ℃達到顯著水平。

表4 低溫脅迫下BR處理對冬小麥葉片和分蘗節(jié)中 wcor413-like基因相對表達量的影響

3 討 論

低溫不僅影響作物的品質和產量,而且會造成嚴重的農業(yè)災害,因此研究低溫對農業(yè)生產的影響至關重要。研究表明,COR基因家族成員在低溫條件下能夠快速表達,且在葉片中表達量較高[22]。wcor413-like基因作為COR基因家族的成員之一,推測其參與植物的抗寒過程。

在植物非生物脅迫的過程中,BR具有正向調節(jié)的作用。外源噴施一定濃度的BR可阻止植物幼苗產生過多的自由基,從而維持細胞膜結構和功能的穩(wěn)定性,增加植物對逆境的適應能力[23]。研究表明,BR可以提高水稻[24]、玉米[25]、小麥[26]、香蕉[27]等植物的抗寒能力。本研究初步探討了不同低溫條件下BR處理對冬小麥東農冬麥1號葉片和分蘗節(jié)中wcor413-like基因的表達模式,發(fā)現隨著溫度的降低,對照組葉片中該基因的表達量呈先升后降的變化趨勢,在-10 ℃時達到峰值;而分蘗節(jié)中該基因的表達量呈先降后升的變化趨勢,在-25 ℃時達到峰值。這與崔 紅等[28]對冬小麥分蘗節(jié)中wcor413-like基因的分析結果相吻合。推測wcor413-like基因參與冬小麥抗寒過程。經過BR處理后的東農冬麥1號,wcor413-like基因在葉片中的表達量呈先降后升的變化趨勢,在分蘗節(jié)中的表達量呈“升-降-升”的變化趨勢,均在-25 ℃達到峰值。此外,-25 ℃時,BR處理后葉片中wcor413-like基因的表達量約為對照組的49倍,而分蘗節(jié)中的表達量約為對照組的一半,兩個處理間wcor413-like基因的表達量差異均達顯著水平。初步預測冬小麥wcor413-like基因在-25 ℃才開始對寒冷做出應答反應,且BR處理可促進該基因在葉片中的表達。

4 結 論

本研究從寒地冬小麥東農冬麥1號中克隆到wcor413-like基因,開放閱讀框為629 bp,可編碼209個氨基酸,其編碼的蛋白屬于穩(wěn)定蛋白質,分子量為22 932.43 Da,主要分布于細胞質中。-25 ℃時分蘗節(jié)wcor413-like基因的表達量明顯高于葉片中的表達量。BR處理葉片中wcor413-like的表達量顯著高于對照組,而分蘗節(jié)中wcor413-like的表達量顯著低于對照組。本研究初步分析了wcor413-like基因在冬小麥抗寒過程中發(fā)揮的功能,為BR參與低溫調控提供了信息支持,也為探索wcor413-like基因調控冬小麥的抗寒機制提供理論依據。