陳俊羽，張婧

（廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

石斑魚（Epinephelusspp）是鮨科石斑魚屬魚類的總稱，已經(jīng)報(bào)道的有400 余種，其中我國(guó)沿海地區(qū)有記錄的45 種，主要有斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）、赤點(diǎn)石斑魚（Epinephelus akaara）、棕點(diǎn)石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus）和鞍帶石斑魚（Epinephelus lanceolatus）等[1]。石斑魚常棲息于熱帶、亞熱帶暖水水域的礁石附近，最適生存水溫為22～28 ℃，在鹽度＞10%的海域均可生存。石斑魚為肉食性魚類，捕食對(duì)象包括甲殼類和各種小型魚類[2]。

神經(jīng)壞死病毒為野田村病毒科的單鏈RNA 病毒，首次報(bào)道于日本長(zhǎng)崎水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所繁殖的鸚嘴魚（Amphilophus）和澳大利亞北昆士蘭州某孵化場(chǎng)養(yǎng)殖的澳洲肺魚（Neoceratodus forsteri）中[3]。神經(jīng)壞死病毒可通過垂直或水平傳播方式侵染個(gè)體，引起魚類患病毒性神經(jīng)壞死病，處理不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致魚類大批死亡。神經(jīng)壞死病毒對(duì)漁業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展具有嚴(yán)重的危害[4]。在石斑魚養(yǎng)殖中，神經(jīng)壞死性病可感染石斑魚腦部和眼部組織，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致個(gè)體死亡。在石斑魚的生長(zhǎng)周期中，稚魚時(shí)期及成熟度相對(duì)較高的幼魚期易感染，且死亡率達(dá)到60%～100%[5]。

石斑魚神經(jīng)壞死病的致病機(jī)理、檢測(cè)方法以及防治措施一直是研究人員關(guān)注的重點(diǎn)和難點(diǎn)。現(xiàn)簡(jiǎn)述石斑魚神經(jīng)壞死病毒的研究進(jìn)展。

1 神經(jīng)壞死病毒的分類

目前神經(jīng)壞死病毒主要有2 種分類方式：基因型和血清型。1997 年，Nishizawa 等[6]通過分子系統(tǒng)發(fā)育，分析25 種神經(jīng)壞死病毒RNA2 序列第604～1 030 位堿基的差異，把神經(jīng)壞死病毒分為4個(gè)基因亞型，即紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）神經(jīng)壞死病毒（TPNNV）、擬鲹（Pseudocaranx）神經(jīng)壞死病毒（SJNNV）、條斑星鰈（Verasper moseri）神經(jīng)壞死病毒（BFNNV）和赤點(diǎn)石斑魚型神經(jīng)壞死病毒（RGNNV）。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，2010 年，Johansen 等[7]通過序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了第5 種神經(jīng)壞死病毒的基因型：大菱鲆（Scophthalmus maximus）型神經(jīng)壞死病毒。這一研究，進(jìn)一步完善了神經(jīng)壞死病毒的基因型分類依據(jù)。

2003 年，Morit 等[8]根據(jù)來源于日本、印尼、泰國(guó)、希臘、美國(guó)和澳大利亞等20 種神經(jīng)壞死病毒的血清，開展中和試驗(yàn)，將神經(jīng)壞死病毒分為3 種血清型：A、B 和C，見表1。擬鲹神經(jīng)壞死病毒屬于血清型A 類，宿主為黃帶擬鲹（Pseudocaranxdentex）；紅鰭東方鲀神經(jīng)壞死病毒屬于血清型B 類，赤點(diǎn)石斑魚神經(jīng)壞死病毒與條斑星鰈神經(jīng)壞死病毒同屬于血清C 類。赤點(diǎn)石斑魚神經(jīng)壞死病毒的宿主多為溫水魚類，條斑星鰈神經(jīng)壞死病毒的宿主多為冷水魚類，雖然屬于不同的基因型分類，但是由于其衣殼蛋白序列的相似性較高，導(dǎo)致這2 種病毒之間存在共同的表位，即相同的血清類型。

表1 魚類神經(jīng)壞死病毒的基因型與血清型[3]

2 神經(jīng)壞死病毒的結(jié)構(gòu)

神經(jīng)壞死病毒粒子呈20 面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，無囊膜包裹，直徑約25～30 nm。180 個(gè)衣殼蛋白，以三聚體形式構(gòu)成高度對(duì)稱的中空結(jié)構(gòu)，其中P 結(jié)構(gòu)域由8 個(gè)反向平行的β 折疊和1 個(gè)α 螺旋折疊，形成獨(dú)立的表面突起，在病毒的黏附入侵過程中發(fā)揮著重要作用。排列整齊的N 臂主要存在于20 面體內(nèi)表面的二重界面處，通過N 端在三重軸處形成β 環(huán)。S結(jié)構(gòu)域和P 結(jié)構(gòu)域通過連接區(qū)域連接，二者在空間上并不直接接觸。60 個(gè)P 結(jié)構(gòu)域三聚體在三重軸上相互連接形成表面突起[9]。

3 侵染石斑魚引發(fā)的免疫反應(yīng)機(jī)制

研究表明，宿主細(xì)胞表面受體在病毒入侵過程中發(fā)揮重要作用，可以是病毒進(jìn)入細(xì)胞的通道，也可以引發(fā)細(xì)胞自噬，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。Zhang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，赤點(diǎn)石斑魚神經(jīng)壞死病毒表面的衣殼蛋白，與受體海鱸（Perca fluviatilis）熱休克蛋白90ab1 結(jié)合后，抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶信號(hào)通路，引發(fā)細(xì)胞自噬過程。這一結(jié)果，初步揭示了神經(jīng)壞死病毒在侵染初期的細(xì)胞應(yīng)答機(jī)制。巨噬細(xì)胞是硬骨魚類先天免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分。活化的巨噬細(xì)胞分泌免疫因子指導(dǎo)炎癥的消退，對(duì)于魚體的健康至關(guān)重要[12]。小膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的免疫效應(yīng)因子，在點(diǎn)帶石斑魚（Epinephelus coioides）中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)壞死病毒進(jìn)入石斑魚腦組織后，小膠質(zhì)細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化為M1 型或M2 型活化巨噬細(xì)胞。M1 型活化巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子1（TNF-R1），導(dǎo)致腫瘤壞死因子α（TNFα）表達(dá)水平升高，抗炎細(xì)胞因子IL-10 降低，引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)損傷。與之相對(duì)，M2 型巨噬細(xì)胞分泌抗炎細(xì)胞因子IL-10 和腫瘤壞死因子2（TNF-R2）能夠減輕腦部挫傷，促進(jìn)神經(jīng)元恢復(fù)，可降低病毒對(duì)腦和神經(jīng)組織的傷害[13-14]。

4 感染模型的建立

在細(xì)胞生物學(xué)層面，1991 年，F(xiàn)rerichs 等[15]以條紋月鱧（Channomuraena vittata）細(xì)胞為基礎(chǔ)，成功建立神經(jīng)壞死病毒感染模型，標(biāo)志著細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)方法的正式建立。目前已經(jīng)建立的神經(jīng)壞死病毒敏感細(xì)胞系，包括褐點(diǎn)石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus）鰭條組織、心臟組織以及鰾部細(xì)胞系[16]、青石斑魚及斜帶石斑魚腦組織細(xì)胞系[17]、云紋石斑魚（Epinephelus moara）吻部、心臟、腦部、腎臟、脾臟以及性腺組織細(xì)胞系等[18]。研究人員以上述細(xì)胞系為基礎(chǔ)，將神經(jīng)壞死病毒大量增殖形成空斑等拉網(wǎng)病變后，進(jìn)行分離純化，獲得具有一定感染能力的活病毒，從而達(dá)到檢測(cè)的目的。

5 檢測(cè)方法

目前常用的神經(jīng)壞死病毒檢測(cè)方法有分子生物學(xué)檢測(cè)法、電化學(xué)檢測(cè)法以及免疫學(xué)方法。在分子生物學(xué)層面，熒光定量PCR 技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和交叉引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等，都是常用的神經(jīng)壞死病毒檢測(cè)方法。其中，熒光定量PCR 技術(shù)較為常見。測(cè)試發(fā)現(xiàn)，該方法在檢測(cè)點(diǎn)帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒感染時(shí)，靈敏度較高，但耗時(shí)較長(zhǎng)[19]。Zhao 等[20]在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中加入SYTO-9 熒光染料后，實(shí)時(shí)檢測(cè)擴(kuò)增曲線，將所需的檢測(cè)時(shí)間縮短至40 min，滿足了疾病檢測(cè)快速準(zhǔn)確的診斷要求。目前，納米銀溶膠探針檢測(cè)方法和切向流試紙條法的電化學(xué)檢測(cè)法引起了研究人員關(guān)注，有望成為新興的神經(jīng)壞死病毒快速檢測(cè)方法[21]。

免疫學(xué)相關(guān)技術(shù)為較早應(yīng)用于神經(jīng)壞死病毒檢測(cè)的方法之一。目前，利用免疫學(xué)相關(guān)技術(shù)，應(yīng)用于水生動(dòng)物神經(jīng)壞死病毒檢測(cè)方法，主要有酶聯(lián)反應(yīng)吸附試驗(yàn)和熒光抗體法等。1992 年，Arimoto 等[22]發(fā)現(xiàn)，使用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，在黃帶擬鲹的魚卵、幼魚和稚魚中均檢測(cè)到神經(jīng)壞死病毒，但是該方法靈敏度不高且需要的魚組織量相對(duì)較大。2018 年，韓國(guó)學(xué)者Gye 等[23]改進(jìn)了免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，提高了檢測(cè)特異性，降低了硬骨魚抗原-抗體非特異性結(jié)合反應(yīng)引起的背景光密度偏高問題。

6 預(yù)防措施

目前石斑魚神經(jīng)壞死病的預(yù)防措施，主要有轉(zhuǎn)基因飼料預(yù)防和接種疫苗預(yù)防2 種方式。Lin 等[24]將赤點(diǎn)石斑魚神經(jīng)壞死病毒外殼蛋白基因重組至鹵蟲細(xì)胞中，飼喂石斑魚幼魚。結(jié)果顯示，被神經(jīng)壞死病毒侵染后的幼魚存活率提高了30%，由此證明口服轉(zhuǎn)基因飼料，可以使石斑魚幼魚獲得一定的免疫效果。萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）具有生長(zhǎng)周期快、性狀穩(wěn)定、遺傳背景清晰等特點(diǎn)，郭德權(quán)[25]將病毒性神經(jīng)壞死病毒外殼蛋白基因整合入萊茵衣藻基因組中，利用該轉(zhuǎn)基因混合飼料投喂珍珠龍膽石斑魚后，進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，采用熒光定量PCR技術(shù)，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)壞死病毒外殼蛋白mRNA 含量減少60%；病理切片發(fā)現(xiàn)，腦組織細(xì)胞空泡化數(shù)量減少，試驗(yàn)組的平均存活率比對(duì)照組高33%。上述研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因混合飼料對(duì)預(yù)防石斑魚病毒性神經(jīng)壞死病有一定作用。

在石斑魚病毒性神經(jīng)壞死病的防治中，以接種疫苗預(yù)防為主。目前，針對(duì)神經(jīng)壞死病毒開發(fā)的疫苗包括福爾馬林滅活病毒疫苗、重組外套蛋白亞基疫苗、病毒顆粒疫苗以及RNA 疫苗等[26]。神經(jīng)壞死病毒主要作用于石斑魚幼魚階段，該階段魚體的免疫系統(tǒng)未充分發(fā)育，疫苗的保護(hù)效果十分有限[27]。現(xiàn)多采取親本魚注射疫苗的方法，切斷病毒的垂直傳播途徑，使子代獲得先天性病毒免疫能力[28-29]。Gye 等[30]使用不同效價(jià)的疫苗注射七帶石斑魚（Epinephelus septemfasciatus）試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)壞死病毒滅活疫苗的有效性與誘導(dǎo)免疫細(xì)胞產(chǎn)生中和抗體的滴度有關(guān)，滴度越高疫苗的保護(hù)能力越強(qiáng)。石斑魚養(yǎng)殖水域的溫度也對(duì)神經(jīng)壞死病疫苗的免疫效果有一定影響。研究發(fā)現(xiàn)，已接種疫苗的七帶石斑魚在不同水溫下，腦部組織中神經(jīng)壞死病毒的濃度不同，水溫為14.3～24.8 ℃，神經(jīng)壞死病毒疫苗的免疫效果較好[31-32]?，F(xiàn)今，尋找神經(jīng)壞死病毒入侵魚體后細(xì)胞作用的靶點(diǎn)和高效激活免疫通路的相關(guān)細(xì)胞因子，是疫苗研究的主要方向[33]。

7 治療方法

注射神經(jīng)壞死病毒特異性抗體是目前廣泛采用的治療手段。Yamashita 等[33]對(duì)七帶石斑魚腹腔內(nèi)注射福爾馬林滅活的赤點(diǎn)石斑魚神經(jīng)壞死病毒后，其死亡率明顯下降。朱松[34]選取金剛烷胺作為抗神經(jīng)壞死病毒藥物，利用納米靶向給藥系統(tǒng)，延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間的同時(shí)提高了準(zhǔn)確率。但長(zhǎng)期使用抗病毒藥物會(huì)增加病毒的耐藥性，且金剛烷胺在魚體的殘留，危害人類健康，因此該治療方法仍存在一定的爭(zhēng)議[35]。

利用碳酸鹽緩沖液進(jìn)行輔助治療，是防治神經(jīng)壞死病毒感染的新思路。研究表明，于石斑魚腹腔內(nèi)注射pH 值為9.6 的碳酸鹽緩沖溶液，可有效清除神經(jīng)壞死病毒抗原，降低病毒的感染性[36]。2021 年，Gye 等[37]發(fā)現(xiàn)，2.0 mol/L 的尿素也可降低神經(jīng)壞死病毒的抗原性，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組病毒的抗原性下降75%～84%。Xiao 等[38]從健康的鞍帶石斑魚中分離出干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、副伯克霍爾德氏菌（Burkholderia）和路德維希大腸桿菌（Enterobacter ludwigii），并將上述復(fù)合益生菌喂食患病的石斑魚，發(fā)現(xiàn)食用益生菌混合飼料的病魚，眼部和腦組織中神經(jīng)壞死病毒RNA 的表達(dá)量顯著下降。這一結(jié)果為石斑魚病毒性神經(jīng)壞死病的治療提供了新思路。

8 結(jié)語

目前，神經(jīng)壞死病毒侵染石斑魚的致病機(jī)制仍未完全闡明，感染后的治療手段也尚未成熟。在防治方法方面，接種疫苗等其他預(yù)先建立免疫屏障的防治措施比感染后再治療的效果更好。與此同時(shí)，碳酸鹽緩沖液療法及復(fù)合益生菌療法為治療手段提供了新思路，在一定程度上解決了抗生素耐藥性及水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素的殘留問題，值得推廣。