柯宏基，陳傅曉，李向民，樊佳偉，王永波，符書源，譚 圍

（1.海南熱帶海洋學(xué)院/熱帶海洋生物資源利用與保護(hù)教育部重點實驗室，海南 三亞 572022;2.海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院/海南省熱帶海水養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，?？?571126）

彈涂魚類棲息于海邊灘涂處及紅樹林等區(qū)域[1]，其肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，營養(yǎng)價值豐富[2]，不僅有著較高的經(jīng)濟(jì)價值，作為沿海灘涂特色小型魚類，還有著獨(dú)特的生態(tài)研究價值。近年來由于海域環(huán)境的惡化，彈涂魚的生存環(huán)境受到影響，資源數(shù)量下降，因此，保護(hù)彈涂魚類資源勢在必行。有關(guān)彈涂魚類的群體研究一直是國內(nèi)外研究熱點，研究方法較多，如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(RAPD)[3]、同工酶[4]、AFLP 技術(shù)[5]、線粒體基因片段[6]等，國外先后報道了銀線彈涂魚（Periophthalmus argentilineatus）、卡路彈涂魚（Periophthalmus.kalolo）、澳氏彈涂魚（Periophthalmus.waltoni）等魚類的群體研究[7-8]，國內(nèi)研究對象主要集中在彈涂魚（P.modestus）、大 彈 涂 魚（Boleophthalmus pectinirostris）、大鰭彈涂魚（P.magnuspinnatus）等[9-13]。大彈涂魚因為其食用價值較高而倍受關(guān)注[14-16]；大鰭彈涂魚因體型外貌與彈涂魚相似而常被誤認(rèn)為彈涂魚[1]。近年來，線粒體基因應(yīng)用范圍越來越廣泛，不僅在遺傳多樣性方面，也可應(yīng)用于鑒別不同物種[17]，王正琦等[18]通過cyt b基因序列建樹區(qū)分出了大鰭彈涂魚和彈涂魚。線粒體控制區(qū)（Control Region，D-loop）是進(jìn)化最快的部分，其基因變化速度比細(xì)胞核DNA 和其他細(xì)胞器的基因快5 倍。不同區(qū)段的進(jìn)化速度不同，應(yīng)用于不同級別的系統(tǒng)發(fā)育分析研究，是探討近緣種間和種內(nèi)遺傳變異的良好指標(biāo)[19-23]，在彈涂魚類研究上有了一定程度的應(yīng)用。王叢濤[16]基于控制區(qū)研究我國大彈涂魚群體，發(fā)現(xiàn)北海與其他群體存在分化，其余群體間基因交流頻繁。張順[9]基于Dloop對雷州半島彈涂魚類進(jìn)行分析，結(jié)果表明，東西半島的大彈涂魚、彈涂魚群體基因交流頻繁，大鰭彈涂魚基因交流少，存在遺傳分化。國內(nèi)關(guān)于海南島彈涂魚類的相關(guān)研究較少[11-12]，目前還未見有關(guān)于利用線粒體控制區(qū)開展海南島彈涂魚類遺傳多樣性方面的研究報道。筆者以在海南島采集到的彈涂魚、大彈涂魚和大鰭彈涂魚為研究對象，通過D-loop標(biāo)記，研究3 種彈涂魚群體的遺傳多樣性程度、地理群體間遺傳分化差異及種群歷史動態(tài)，旨在為今后更好利用開發(fā)海南島彈涂魚資源及制定保護(hù)政策提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣 品來源及擴(kuò)增測序2018-12-06—2019-10-16，分別在?？冢℉K）、文昌（WC）、澄邁（CM）、臨高（LG）、儋州（DZ）、昌江（CJ）、東方（DF）、樂東（LD）、三亞（SY）野外人工捕捉彈涂魚類群體（表1）。樣本活體運(yùn)輸至海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院瓊海科研基地，取背部肌肉組織，于75%的乙醇中保存 24 h，更換為 95%乙醇保存 24 h，最后于無水乙醇中常溫保存。采用TAKARA DNA 提取試劑盒提取 DNA。DNA 樣品經(jīng) 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，保存于-20 ℃冰箱中備用。線粒體控制區(qū)基因擴(kuò)增所用引物序列[9]，DloopF1：5′-AGC TCCCAAAGCTAGC ATTCT-3′；D-loopR1：5′-TTTCTAGGGCCCATCTTAACA-3′。擴(kuò)增程序為：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性 30 s、58 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 2 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，送至廣州艾基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測序。

表1 3 種彈涂魚采樣情況

1.2 數(shù)據(jù)分析測序完成后，用SeqMan 拼裝校對線粒體控制區(qū)基因序列。通過 MEGA7.0 軟件對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析。采用軟件DNASP6.0計算序列變異位點數(shù)、單倍型數(shù)目、單倍型多樣性和核苷酸多樣性等遺傳參數(shù)；利用MEGA7.0 軟件分析序列的堿基組成，基于Kimura 2-parameter 模型計算群體內(nèi)及群體間的遺傳距離，采用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建彈涂魚序列鄰接關(guān)系進(jìn)化樹[24]，節(jié)點支持率采用 Bootstrap 1 000 次重復(fù)檢驗置信度；利用 Arlequin3.11 軟件計算兩兩群體間的遺傳分化指數(shù)(Fst) ，并進(jìn)行分子方差分析（Analysis of molecular variance，AMOVA），用于遺傳變異和地理結(jié)構(gòu)特點研究；使用核苷酸不配對分析( mismatch distribution) 和中性檢驗( neutrality tests) 來檢測海南彈涂魚的種群歷史動態(tài)，利用Network5.0 軟件構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，分析單倍型之間的進(jìn)化關(guān)系。種群擴(kuò)張時間（T）利用公式τ=2ut進(jìn)行估算。式中t表示種群擴(kuò)張至今所經(jīng)歷的代數(shù)；T=t×代時，代時為研究對象的生殖周期；τ為擴(kuò)張時間參數(shù)；u=μk，μ為線粒體控制區(qū)基因變異速率，k表示序列長度。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析本研究獲得的D-loop基因片段長度為836 bp，總變異位點244 個。共獲得195個彈涂魚類目的基因片段，即彈涂魚133 個、大彈涂魚34 個、大鰭彈涂魚28 個。分析結(jié)果表明，彈涂魚序列組成顯示平均 A、T、G、C 堿基含量分別為 30.8%、33.3%、22.8%、14.1%，A+T（64.1%）含量高于G+C（36.9%）的含量。共檢測到125 個單倍型，發(fā)現(xiàn)134 個變異位點（占總位點數(shù)的16.0%），其中50 個為單變異位點，而另外84 個為簡約信息位點。大彈涂魚序列組成顯示平均 A、T、G、C 堿基含量分別為31.1%、34.3%、21.6%、13.0%，A+T（65.4%）含量高于G+C（34.6%）的含量。共檢測到28 個單倍型，發(fā)現(xiàn)58 個變異位點（占總位點數(shù)的6.9%），其中36 個為單變異位點，而另外22 個為簡約信息位點。大鰭彈涂魚序列組成顯示平均 A、T、G、C 堿基含量分別為31.9%、34.3%、20.7%、13.1%，A+T（66.2%）含量高于G+C（33.8%）的含量，共檢測到21 個單倍型，發(fā)現(xiàn)52 個變異位點（占總位點數(shù)的6.2%），17 個為單變異位點，而另外35 個為簡約信息位點。

2.2 遺傳多樣性3 種彈涂魚的相關(guān)多樣性數(shù)據(jù)見表2。彈涂魚群體單倍型多樣性在0.992～1.000 之間，核苷酸多樣性在0.014 09～0.023 84之間。平均核苷酸差異數(shù)為11.184～18.831，其在LG 群體中最多為18.831 個，在SY 群體中最少為11.184 個?？傮w單倍型多樣性為0.998 7，由單倍型參數(shù)可知，HK、CM、LG、DZ、CJ、DF 6 個群體單倍型多樣性皆為1.000，同為最豐富群體；LD 和SY 群體單倍型多樣性相比較低，為0.992和0.993。8 個群體的單倍型多樣性水平大于0.5，屬于高水平?？傮w核苷酸多樣性為0.020 57，8 個群體中最為豐富的LG 群體的核苷酸多樣性為0.023 84，核苷酸多樣性最低的為SY 群體（0.014 09），8 個群體核苷酸多樣均大于0.005，屬于高水平。8 個群體均具有較高的遺傳多樣性，其中LG 群體遺傳多樣性最豐富，SY 群體遺傳多樣性較缺乏。大彈涂魚群體單倍型多樣性在0.933～0.992 之間，核苷酸多樣性在 0.008 25～0.011 09 之間。平均核苷酸差異數(shù)為6.286～8.442；WC 群體中最多，為 8.442 個；DZ 群體中最少，為6.286 個。總體單倍型多樣性為0.979。由單倍型參數(shù)可知，WC 群體最豐富，為0.992；DZ 群體最低，為0.933；3 個群體的數(shù)值都在0.5 之上，屬高水平群體。總體核苷酸多樣性為0.011 09，其中WC 群體多樣性最豐富，為0.011 09；DZ 群體最低，為0.008 25，3 個群體核苷酸多樣均大于0.005，屬于高水平。3 個群體中，WC 群體遺傳多樣性最為豐富，DZ 群體遺傳多樣性較缺乏。大鰭彈涂魚單倍型多樣性數(shù)值為0.971，大于0.5，屬于高水平；核苷酸多樣性數(shù)值為0.016 08，大于0.005，屬于高水平。平均核苷酸差異數(shù)為12.783。

表2 3 種彈涂魚的采樣點、數(shù)目及遺傳多樣性

2.3 單倍型在群體中的分布在8 個彈涂魚群體中，共有單倍型125 個，5 個共享單倍型，獨(dú)有單倍型120 個。Hap24 為3 個群體共享（CM、LG、SY），Hap50、53 為2 個群體共享（DZ、CJ），Hap67為2 個群體共享（CJ、DF），Hap84 為2 個群體所共享（DF、SY）。在獨(dú)有單倍型中HK 群體有15 個（Hap1～15），CM 群 體 有16 個（Hap16～Hap23、Hap25～Hap32），LG 群 體 有 16 個（Hap33～Hap48），DZ 群體有15 個（Hap49、Hap51～Hap52、Hap54～Hap65），CJ 群體有14 個（Hap66、Hap68～Hap80），DF 群體有15 個（Hap81～Hap83、Hap85～Hap96）,LD 群體有15 個（Hap97～Hap111），SY 群體有14 個（Hap112～Hap125）。3 個大彈涂魚群體中共有單倍型28 個，共享單倍型2 個，為Hap19、Hap20（DZ、DF 2 個群體共享）；獨(dú)有單倍型26 個。在獨(dú)有單倍型中WC 群體有15 個（Hap1～Hap15），DZ 群體有5 個（Hap16～Hap18、Hap21～Hap22），DF 群體有6 個（Hap23～Hap28）。

2.4 遺傳分化彈涂魚單倍型網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）由Network 軟件分析得出：沒有按照地理群體而形成獨(dú)立的分支，共享單倍型約占所有單倍型的4.0%（5/125）。大彈涂魚單倍型之間的進(jìn)化關(guān)系顯示W(wǎng)C 群體較為聚在一起，共享單倍型約占所有單倍型的7.1%(4/24)（圖2）。

圖1 彈涂魚線粒體控制區(qū)單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖

圖2 大彈涂魚線粒體控制區(qū)單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖

基于線粒體控制區(qū)序列構(gòu)建的NJ 樹（圖3-a）結(jié)果表明彈涂魚各群體雜亂地聚在一起，沒有按采樣的地理位置聚集，大彈涂魚序列NJ 樹結(jié)果表明WC 群體較為聚在一起（圖3-b）。選取33 條彈涂魚（TT）、34 條大彈涂魚（DT）、28 條大鰭彈涂魚（DQ）序列建樹，結(jié)果表明3 個物種之間界限明確，不同種之間的序列可各自聚成單系，支持率較高，表明彈涂魚先與大鰭彈涂魚分離，再和大彈涂魚分離（圖3-c）。

圖3 彈涂魚（a）、大彈涂魚（b）及3 種彈涂魚（c）線粒體控制區(qū)序列鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹

8 個彈涂魚群體的遺傳距離見表3。表3 結(jié)果表明，彈涂魚群體內(nèi)的遺傳距離為0.014～0.025，群體間的遺傳距離為0.016～0.024，LG 和DF 群體的遺傳距離最大(0.024)，其余群體之間的遺傳距離在0.016～0.023 之間。大彈涂魚群體內(nèi)的遺傳距離為0.008～0.011，群體間的遺傳距離為0.010～0.013，WC 和DF 群體的遺傳距離最大，為0.013（表4）。

表3 基于線粒體控制區(qū)基因序列的彈涂魚群體遺傳距離

表4 基于線粒體控制區(qū)基因序列的大彈涂魚群體遺傳距離

3 種彈涂魚中，彈涂魚與大鰭彈涂魚群體遺傳距離最小有著較近的親緣關(guān)系，為0.097，大彈涂魚與彈涂魚和大鰭彈涂魚遺傳距離分別為0.344和0.357（表5）。

表5 基于線粒體控制區(qū)基因序列的3 種彈涂魚群體遺傳距離

群體間Fst分析結(jié)果顯示：8 個彈涂魚兩兩群體間的Fst值在-0.032 22～0.097 57 之間（表6），LG 和SY 群 體Fst為0.092 01（P＜0.05），DF 和SY 群體Fst為0.097 57（P＜0.05），LD 和SY 群體Fst為0.057 12（P＜0.05），其余群體間Fst均小于0.05(P＞0.05)。大彈涂魚兩兩群體間的Fst值在0.015 79～0.152 70 之 間（表7），WC 和DF 的Fst為0.152 70 （P＜0.01），其 余 群 體 間 的Fst為0.015 79 和0.097 75(P＞0.05)。彈涂魚與大鰭彈涂魚Fst為0.832 11（P＜0.01），彈涂魚與大彈涂魚Fst為0.974 60（P＜0.01），大鰭彈涂魚與大彈涂魚Fst為0.982 09（P＜0.01）（表8）。

表7 大彈涂魚遺傳分化指數(shù)

表8 3 種彈涂魚遺傳分化指數(shù)

彈涂魚地理群體AMOVA 分析結(jié)果（表9）表明群體間的遺傳變異占0.48%，比例極小；群體內(nèi)部變異占99.52%，比例大。不存在明顯的遺傳分化，群體間基因交流頻繁。大彈涂魚群體間變異占10%，具有一定比例，群體內(nèi)部變異占90%，F(xiàn)st為0.100 03(P＜0.01)，存在中等程度遺傳分化。3 種彈涂魚種群間的遺傳變異占所有遺傳變異的96.24%，種群內(nèi)的遺傳變異僅為3.76%。

表9 3 種彈涂魚的分子方差分析

2.5 種群歷史動態(tài)中性檢驗結(jié)果（表10）表明，彈涂魚全部群體Tajima'sD值均為負(fù)值，不顯著。Fu'sFs值均為負(fù)值，除LD 群體外其余群體P＜0.05?；?于Arlequin 不 配 對 分 布 結(jié) 果（圖4，表11）表明，全部群體都不是單峰狀。CM、CJ 群體的SSD 統(tǒng)計檢驗顯著，其余群體不顯著；全部群體r統(tǒng)計檢驗不顯著。大彈涂魚全部群體Tajima'sD值均為負(fù)值，不顯著。Fu'sFs值WC 群體P＜0.01，另外2 個群體負(fù)值不顯著?；贏rlequin 不配對分布結(jié)果表明WC 群體單峰狀，其余群體不為單峰狀。SSD 和r這2 個統(tǒng)計檢驗不顯著。大鰭彈涂魚Tajima'sD和Fu'sFs值負(fù)值，不顯著，未呈單峰分布。

表10 3 種彈涂魚中性檢驗結(jié)果

表11 3 種彈涂魚吻合度檢驗結(jié)果

圖4 3 種彈涂魚群體的核苷酸不配對分析圖

3 討 論

遺傳多樣性與物種的適應(yīng)能力、進(jìn)化能力密切相關(guān)，本研究對海南島的彈涂魚類進(jìn)行了全面調(diào)查，對采集到的3 種彈涂魚共12 個群體進(jìn)行分析。結(jié)果表明，彈涂魚群體的單倍型多樣性指數(shù)在0.992～1.000 之間，核苷酸多樣性指數(shù)在0.014 09～0.023 84 之間，總體單倍型多樣性指數(shù)為0.998 7，核苷酸多樣性指數(shù)為0.020 57。根據(jù)Grant 和Bowen[25]提出的4 種模式，海南島8 個彈涂魚群體為單倍型多樣性及核苷酸多樣性高類型。說明是一個大型穩(wěn)定的群體，具有長期的進(jìn)化歷史或者和其他支系發(fā)生過2 次交流。8 個群體中三亞群體的遺傳多樣性最低，筆者推測相比于其他群體，三亞群體最大的區(qū)別在于受周圍環(huán)境脅迫壓力較大，海岸線的開發(fā)及人類活動影響使彈涂魚棲息地范圍減小，幾近消失，而遺傳多樣性比較豐富的臨高群體則受人類活動影響明顯較小。海南島群體總體與廣東群體[10]對比結(jié)果表明：單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)均高于廣東群體。

大彈涂魚群體的單倍型多樣性指數(shù)在0.933～0.992 之間，核苷酸多樣性指數(shù)在 0.008 25～0.011 09 之間，總體單倍型多樣性為0.979，總體核苷酸多樣性為0.011 09。屬于高單倍型多樣性、高核苷酸多樣性類型。大彈涂魚3 個群體中，儋州群體遺傳多樣性最低，筆者推測相比于另外兩個采樣點，儋州群體采樣點附近受人類活動影響較為頻繁，而遺傳多樣性較為豐富的文昌群體位于東寨港紅樹林保護(hù)區(qū)，受人為活動的干擾較少。但與江蘇連云港群體、上海九段沙群體、浙江慈溪群體、浙江舟山群體、福建霞浦群體、廣東雷州半島群體、廣西北海群體[10,16]相比較，屬于較低水平。

大鰭彈涂魚單倍型多樣性指數(shù)為0.971，核苷酸多樣性指數(shù)為0.016 08。屬于高單倍型多樣性、高核苷酸多樣性類型。與雷州半島群體[9]相比屬于較高水平。將3 種彈涂魚與同處于南海的卵形鯧鰺（Trachinotus ovatus）[26]、圓舵鰹（Auxis tapeionosomaBleeker）[27]、鯻（Therapon theraps）[21]相比，彈涂魚屬于中上水平，大彈涂魚屬于低水平，大鰭彈涂魚屬于中下水平。3 種彈涂魚相互對比，彈涂魚最為豐富，大鰭彈涂魚次之，大彈涂魚最為匱乏，應(yīng)優(yōu)先對大彈涂魚進(jìn)行保護(hù)。

Fst是評價遺傳分化的指標(biāo)，F(xiàn)st大于0.25 表示分化程度非常高，F(xiàn)st在0.15～0.25 表示高度分化，F(xiàn)st在0.05～0.15 表示中等分化，F(xiàn)st小于0.05 表示未分化[28]。本研究群體間Fst分析結(jié)果表明，8 個彈涂魚兩兩群體間的Fst值在-0.032，22～0.097 57 之間，LG 和SY 群體Fst為0.092 01（P＜0.05），DF 和SY 群 體Fst為0.097 57 （P＜0.05），LD 和SY 群 體Fst為0.057 12（P＜0.05），其 余 群 體 間Fst均小于0.05(P＞0.05)。表明三亞與臨高、東方、樂東存在中等程度分化，推測三亞群體受人類活動干擾及棲息地地形阻隔阻礙了其與其他群體的正常交流。AMOVA 分析得出群體間的遺傳變異占0.48%，比例極??；群體內(nèi)部變異占99.52%，占據(jù)相當(dāng)大的比例，不存在明顯的遺傳分化，與之前使用COⅠ作為標(biāo)記得出的結(jié)果相似[12]。

大彈涂魚兩兩群體間的Fst值在 0.015 79～0.152 70 之 間，WC 和DF 的Fst為0.152 70 （P＜0.01），其余群體間的Fst為0.015 79 和0.097 75(P＞0.05)，WC 和DF 群體存在高度分化。AMOVA 分析結(jié)果表明，3 個大彈涂魚群體間變異占10%，具有一定比例，群體內(nèi)部變異占90%，F(xiàn)st為0.100 03(P＜0.01)，存在中等程度遺傳分化，根據(jù)之前Fst數(shù)據(jù)推測，主要的分化差異來自于WC 和DF 群體之間。張順[9]對雷州半島4 個大彈涂魚群體進(jìn)行分析得出Fst值在0～0.05 之間。王從濤[16]對中國沿海大彈涂魚群體研究得出無顯著遺傳分化，北海群體同其他群體存在中等程度分化。本研究結(jié)果可能與采樣地理位置有關(guān)，WC 采樣點處于港灣內(nèi)部較封閉區(qū)域，加上瓊州海峽阻隔洋流阻隔，在一定程度上影響了該群體與其他群體的基因交流。

通過構(gòu)建鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹顯示出3 個物種之間界限明確，不同種之間的序列可各自聚成單系，支持率較高，可看出彈涂魚先與大鰭彈涂魚分離，再和大彈涂魚分離。彈涂魚與大鰭彈涂魚距離最小為0.097，大彈涂魚與彈涂魚和大鰭彈涂魚距離分別為0.344 和0.357?？傻贸? 種彈涂魚中彈涂魚與大鰭彈涂魚親緣關(guān)系較近，與分類上彈涂魚與大鰭彈涂魚處同一屬相一致，彈涂魚與大鰭彈涂魚Fst為0.832 11（P＜0.01），彈涂魚與大彈涂魚Fst為0.974 60（P＜0.01），大鰭彈涂魚與大彈涂魚Fst為0.982 09（P＜0.01），AMOVA 顯示3 種彈涂魚種群間的遺傳變異占所有遺傳變異的92.41%，種群內(nèi)的遺傳變異僅為7.59%。3 種彈涂魚交流受阻，存在隔離。長期以來，彈涂魚和大鰭彈涂魚被混在一起，韓國學(xué)者證實其實它們是2 種不同的魚類[1]。王正琦等[18]通過cyt b基因序列建樹發(fā)現(xiàn)大鰭彈涂魚和彈涂魚分別聚在相近分支，本研究通過NJ 樹可將大鰭彈涂魚和彈涂魚相區(qū)分開來，與王正琦等[18]的分析結(jié)果一致。

中性檢驗結(jié)果表明，彈涂魚全部群體Tajima'sD值均為負(fù)值，不顯著。Fu'sFs值均為負(fù)值，除LD 群體外其余群體P＜0.05?；贏rlequin 不配對分布表明全部群體都不是單峰狀。CM、CJ 群體的SSD 統(tǒng)計檢驗顯著，其余群體不顯著；全部群體r 統(tǒng)計檢驗不顯著。以此，本研究推測海南島彈涂魚未經(jīng)歷過擴(kuò)張。大彈涂魚全部群體Tajima'sD值均為負(fù)值，不顯著。Fu'sFs 值WC 群體P＜0.01，另外2 個群體負(fù)值不顯著?；贏rlequin不配對分布表明WC 群體單峰狀，其余群體不為單峰狀。SSD 和r這2 個統(tǒng)計檢驗不顯著。大彈涂魚的性成熟年齡為1 齡[29]，D-loop進(jìn)化速率參考值為每百萬年3%～12%[16]，推測大彈涂魚WC 群體在17.9～4.5 萬年前經(jīng)歷過擴(kuò)張。大鰭彈涂魚群體Tajima'sD值和Fu'sFs 值均為負(fù)值，且不顯著?；贏rlequin 不配對分布表明不為單峰狀，據(jù)此推測大鰭彈涂魚未經(jīng)歷過擴(kuò)張。17.9～4.5 萬年前在第四紀(jì)，第四紀(jì)的冰期和間冰期的交替變化會造成海平面的下降和上升由此帶來的變化可能會對彈涂魚類產(chǎn)生影響，從而發(fā)生擴(kuò)張[30]。

本研究對海南島進(jìn)行了系統(tǒng)的采樣調(diào)查，采樣地點覆蓋范圍較廣，但對比中國動物志等[1]文獻(xiàn)的記載發(fā)現(xiàn)，資料上的許多地點已沒有彈涂魚類的活動蹤跡，比如陵水新村、英州等地。從彈涂魚和大彈涂魚的遺傳多樣性分析結(jié)果可看出：采樣點的棲息環(huán)境與遺傳多樣性豐富程度存在一定程度的關(guān)聯(lián)。根據(jù)本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，彈涂魚類不是海南的主要經(jīng)濟(jì)魚種，所以對于海南島彈涂魚類來說影響其多樣性的主要原因不是過度捕捉，海岸線過度開發(fā)、環(huán)境惡化及人類活動頻繁是導(dǎo)致彈涂魚棲息地退化、多樣性減少的主要原因。加強(qiáng)彈涂魚資源保護(hù)，倡導(dǎo)人與自然和諧共處，有利于海南島生態(tài)島的建設(shè)。對此建議采取以下措施保護(hù)彈涂魚類資源：（1）嚴(yán)格控制污水排放和灘涂畜禽養(yǎng)殖，減少在彈涂魚棲息地的人為活動；（2）加強(qiáng)彈涂魚繁殖生物學(xué)基礎(chǔ)理論研究，定期監(jiān)測生態(tài)環(huán)境以及彈涂魚生物資源，對資源衰退嚴(yán)重區(qū)域可通過人工增殖放流恢復(fù)彈涂魚資源。（3）對分布有彈涂魚資源的河口、灘涂地區(qū)景觀工程改造需充分考慮彈涂魚生活習(xí)性，為彈涂魚保留適當(dāng)棲息場所。（4）作為彈涂魚棲息地的紅樹林灘涂區(qū)，存在著利用不合理等問題，下一步需要加強(qiáng)對紅樹林的保護(hù)，為紅樹林生態(tài)系統(tǒng)的發(fā)展提供空間。