康紅麗,潘秀虹,崔久明,尤燕舞

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院,廣西百色533000;2.廣西醫(yī)學(xué)科學(xué)院·廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院腎內(nèi)科,廣西南寧530000)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是具有臨床異質(zhì)性的復(fù)雜的累及多個系統(tǒng)和器官的自身免疫性疾病。狼瘡性腎炎(lupus nephritis,LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡累及腎臟所致的最常見的并發(fā)癥之一,也是影響患者預(yù)后的一個最主要因素[1]。目前對于SLE的常規(guī)治療方法包括使用糖皮質(zhì)激素和/或免疫抑制劑治療,雖可以部分緩解病情,但毒副作用大,且重癥患者可能會出現(xiàn)嚴重的臟器損傷[2-3]。因此,還需要我們進一步探索LN的藥物治療。

研究發(fā)現(xiàn)Toll 樣受體4/髓系分化因子88/核轉(zhuǎn)錄因子κB(Toll-like Receptor 4/myeloid differentiation factor 88/nuclear factor-kappa B, TLR4/MyD88/NF-κB)信號通路與 LN 的腎小球損傷密切相關(guān)[4]。雷帕霉素(rapamycin, RAPA)作為大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑可用于預(yù)防腎移植術(shù)后的急性排斥反應(yīng)[5],但是基于TLR4/MyD88/NF-κB信號通路研究RAPA對LN的治療作用還少有報道。本研究選用經(jīng)典狼瘡模型MRL/lpr小鼠,通過分析雷帕霉素對MRL/lpr小鼠蛋白尿水平、自身抗體水平、腎組織病理變化、TLR4/MyD88/NF-κB信號通路蛋白和基因的表達水平及腎組織細胞凋亡等的作用,試圖闡明雷帕霉素對LN的作用機制和作用靶點,為狼瘡性腎炎的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物C57BL/6小鼠和MRL/lpr小鼠各20只,購買于上海斯萊克實驗動物有限公司,實驗動物合格證號2017000504481。飼養(yǎng)于右江民族醫(yī)學(xué)院實驗動物中心(NO.SYXK 2017-0004)SPF級動物房。

1.1.2 主要儀器Thermo scientific GeminiAS全自動染色機、自動化封片機 ClearVueTM、3DHistech Pannoramic Midi掃描儀、OLYMPUS顯微鏡、OLYMPUS激光共聚焦顯微鏡。

1.1.3 主要試劑RAPA、HE、Masson、PAS、PASM染色試劑盒、Trizol試劑(北京索萊寶科技有限公司);BCA蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所);ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司);qRT-PCR及cDNA合成試劑盒(莫納生物科技有限公司),Anti-TLR4 Ab、MyD88Ab、phospho-NF-κB-p65Ab(江蘇親科生物研究中心有限公司),TUNEL原位細胞凋亡檢測盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理20周齡C57BL/6小鼠和MRL/lpr小鼠各20只,分為正常對照組、治療組、狼瘡組、狼瘡治療組,每組10只。正常對照組野生型C57BL/6小鼠、狼瘡組MRL/lpr小鼠腹腔注射生理鹽水溶液,治療組野生型C57BL/6小鼠、狼瘡治療組MRL/lpr小鼠腹腔注射RAPA 2.0 mg/kg,每天1次,連續(xù)注射28天。第29天處死小鼠。

1.2.2 各組小鼠24小時尿蛋白及自身抗體檢測在實驗第28天代謝籠收集24小時尿液并記錄 24 h 尿量。按照南京建成生物公司提供的尿蛋白測定試劑盒(CBB法)說明書檢測各組小鼠24小時尿蛋白水平。小鼠麻醉后采用摘眼球取血法留取血清,嚴格按照武漢華美生物工程有限公司試劑盒說明書操作步驟進行ELISA檢測各組小鼠血清anti-dsDNA、ANA、anti-Sm抗體水平。

1.2.3 腎臟病理學(xué)檢查采用頸椎脫臼法處死小鼠,將腎臟標本固定在4%多聚甲醛,石蠟包埋后3 μm切片,按照北京索萊寶試劑說明書行HE、Masson、PAS、PASM染色。400倍光鏡下觀察15個視野腎組織切片,進行腎組織狼瘡性腎炎的活動性指數(shù)評分。腎組織病理評分結(jié)果判定根據(jù)2016年國際腎臟病學(xué)會/腎臟病理學(xué)會(International Society of Nephrology/Renal Pathology Society,ISN/RPS)狼瘡性腎炎病理分型的共識評分標準進行活動性指數(shù)(activity index, AI)和非活動性指數(shù)(chronic index, CI)評分評定。

1.2.4 實時熒光定量PCRqRT-PCR檢測腎組織TLR4、MyD88和NF-κB-p65mRNA表達。使用Trizol試劑提取總RNA,并合成cDNA,按照莫納生物Mon ScriptTMRTIII All-in-One Mix with ds Dnase試劑盒操作進行。引物設(shè)計參照GenBank中的mRNA序列,由上海生工生物合成,按照莫納生物MonAmpTMSYBRGreen qPCR Mix試劑盒操作說明進行檢測。應(yīng)用LightCycler96實時熒光定量PCR儀進行熒光定量PCR。每個樣品設(shè)2個復(fù)孔,取平均擴增循環(huán)次數(shù)Ct值。以內(nèi)參GAPDH為對照,計算相對定量ΔCt 值。以對照組為對照,計算相對定量ΔΔCt 值。采用相對定量2-ΔΔCt法比較三個基因的mRNA的表達差異。2-ΔΔCt代表實驗組目的基因相對于對照組的變化倍數(shù)。ΔΔCt值=實驗組(目的基因 Ct值-內(nèi)參基因Ct值)-對照組(目的基因 Ct 值-內(nèi)參基因Ct值)。熒光定量 PCR 擴增基因引物序列TLR4 F序列：CAGAATGAGGACTGGGTGAGA,R序列：CTGTAGTGAAGGCAGAGGTGA;MyD88 F序列：ATCGCTGTTCTTGAACCCTCG,R序列：CTCACGGTCTAACAAGGCCAG,NF-κB-p65 F序列：TCGAGTCTCCATGCAGCTACGG,R序列：CGGTGGCGATCATCTGTGTCTG;GAPDH F序列：ATCATCCCTGCATCCACT,R序列：ATCCACGACGGACACATT。

1.2.5 腎組織免疫熒光取小鼠的腎臟組織,4%多聚甲醛液固定后,石蠟包埋3 μm 切片,脫蠟,PBS洗3次,每次5 min;山羊血清室溫封閉1小時;檸檬酸鹽修復(fù)液高溫高壓抗原修復(fù),PBS洗3次,每次5 min; TLR4、MyD88、p-NF-κB-p65山羊抗兔抗體4 ℃冰箱孵育過夜;熒光二抗孵育,室溫60 min,PBS洗3次,每次5 min;(含DAPI)抗熒光淬滅封片液封片,共聚焦顯微鏡下觀察拍照。通過Image J對TLR4、MyD88的平均熒光強度進行半定量分析。對于p-NF-κB-p65通過多個視野觀察計數(shù)入核的陽性細胞數(shù)計算所占百分比來分析。

1.2.6 TUNEL染色法檢測小鼠腎臟細胞凋亡按照江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司的TUNEL凋亡試劑盒操作說明檢測,大體步驟如下：腎組織進行常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟后,用蛋白酶K工作液進行樣本通透,過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶,根據(jù)切片數(shù)量和組織大小取適量TdT酶反應(yīng)液于37 ℃溫箱內(nèi)避光反應(yīng)60 min,辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗地高辛孵育避光反應(yīng)30 min,DAB室溫下顯色,蘇木素溶液室溫孵育后流水沖洗,脫水透明封片。細胞核染成棕黃色及褐色的細胞為凋亡細胞,而細胞核呈藍色的細胞為未凋亡細胞。隨機選取20個不重疊的400倍鏡視野,觀察所計數(shù)的凋亡細胞數(shù)和總細胞數(shù),最后按照細胞凋亡率計算公式：凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%計算各組的凋亡率。

2 結(jié) 果

2.1 四組小鼠24小時尿蛋白水平比較狼瘡組24小時尿蛋白水平高于正常對照組,狼瘡治療組低于狼瘡組,比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明雷帕霉素可減可輕狼瘡組小鼠尿蛋白水平。見表1。

表1 四組小鼠24小時尿蛋白水平比較

2.2 四組小鼠24周齡末血清ANA、anti-dsDNA、anti-Sm水平比較狼瘡組血清ANA、anti-dsDNA、anti-Sm水平高于正常對照組,狼瘡治療組低于狼瘡組,比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明雷帕霉素可降低狼瘡組小鼠血清ANA、anti-dsDNA、anti-Sm抗體水平。見表2。

表2 四組小鼠24周齡末血清ANA、anti-dsDNA、anti-Sm水平比較

2.3 雷帕霉素改善狼瘡組小鼠腎臟病變腎組織HE、Masson、PAS、PASM染色結(jié)果顯示,狼瘡組腎組織的腎小球出現(xiàn)中性粒細胞浸潤、大量系膜細胞增生及系膜基質(zhì)增生、新月體形成、腎間質(zhì)的中性粒細胞淋巴細胞浸潤等表明腎臟結(jié)構(gòu)損害的病理改變,在狼瘡治療組病理損害明顯改善,表現(xiàn)為腎小球中性粒細胞浸潤減少,系膜細胞系膜基質(zhì)增生減少,腎間質(zhì)的炎癥細胞浸潤,血管周圍炎癥減輕。狼瘡組與正常對照組相比,狼瘡組AI評分(14.00±1.00)明顯高于正常對照(0),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。狼瘡治療組AI評分(7.00±1.00)與狼瘡組(14.00±1.00)相比顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。狼瘡組CI評分(5.00±1.00)明顯高于正常對照(0),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。狼瘡治療組CI評分(5.00±1.00)與狼瘡組(5.33±1.54)相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、圖2。

2.4 雷帕霉素對狼瘡組小鼠腎組織TLR4、MyD88、NF-κB-p65 mRNA表達水平的影響狼瘡組腎組織TLR4、MyD88、NF-κB-p65 mRNA表達水平高于正常對照組,狼瘡治療組上述腎組織表達水平低于狼瘡組,比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

注：a.正常對照組;b.治療組;c.狼瘡組;d.狼瘡治療組

AI評分：狼瘡組與正常對照組相比,*P<0.05,狼瘡組與狼瘡治療組相比,#P<0.05;CI評分：狼瘡組與正常對照組相比,*P<0.05

表3 四組TLR4、MyD88、NF-κB-p65 mRNA表達水平2-ΔΔCt比較

2.5 雷帕霉素對狼瘡組小鼠腎皮質(zhì)TLR4、MyD88、p-NF-κB-p65蛋白表達的影響如圖3所示,各組小鼠腎組織免疫熒光染色后發(fā)現(xiàn),TLR4、MyD88、p-NF-κB-p65主要表達于腎小管和腎小球的部分內(nèi)皮細胞、系膜細胞及足細胞中。結(jié)果分析如表4所示,狼瘡組TLR4、MyD88、NF-κB-p65 蛋白表達水平高于正常對照組,狼瘡治療組低于狼瘡組,比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表4。

2.6 TUNEL染色觀察腎組織細胞凋亡TUNEL染色分析各組小鼠凋亡細胞,狼瘡組細胞凋亡率(54±3)%與正常對照組(5±1)%相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。狼瘡治療組的凋亡率(36±2)%與狼瘡組的(54±3)%相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

注：a.四組TLR4免疫熒光結(jié)果;b.四組MyD88免疫熒光結(jié)果;c.四組NF-κB-p65免疫熒光結(jié)果

表4 四組TLR4、MyD88、NF-κB-p65 蛋白表達水平比較

注：a.正常對照組;b.治療組;c.狼瘡組;d.狼瘡治療組 注：狼瘡組與正常對照組相比,*P<0.05;狼瘡治療組與狼瘡組相比,#P<0.05

3 討 論

SLE作為一種多因素且復(fù)雜的自身免疫性疾病,其特點是各種細胞和分子異常。先天免疫和適應(yīng)性免疫功能失調(diào)均與其發(fā)生密切相關(guān),本研究旨在探討RAPA改善LN腎損傷的可能機制。

RAPA作為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)的抑制劑,1999年開發(fā)上市批準雷帕霉素為免疫抑制劑[6],越來越多的研究關(guān)注RAPA治療狼瘡性腎炎的作用機制。2006年,FERNANDEZ等人[7]報道了對9名傳統(tǒng)治療無效的SLE患者,RAPA 似乎是一種更安全有效的治療方法。該研究持續(xù)了6～48個月,結(jié)果表明RAPA使SLE患者的 T 細胞活化,并改善了患者的臨床癥狀。也有研究表明雷帕霉素具有直接的抗增殖特性,能夠抑制系膜[8]和上皮細胞的增殖[9],改善LN的腎組織損害。

TLR作為天然免疫的眼睛,在感染性疾病和多種慢性疾病的發(fā)病機制中起著監(jiān)視和識別不同的病原相關(guān)分子模式[10]和損傷相關(guān)分子模式的作用[11]。TLR4是由POLTORAK等人[12]于1998年發(fā)現(xiàn)的由 TLR4 基因編碼的表面先天免疫受體,研究表明TLR4基因敲除純合子小鼠(Toll-like receptor 4 gene knockout mouse,TLR4 KO)或應(yīng)用了TLR4抑制劑的狼瘡小鼠免自身抗體的產(chǎn)生受到了顯著抑制,腎組織病理改變?nèi)缒I小球免疫復(fù)合物沉積和系膜細胞增生也顯著較輕,這些均提示TLR4參與了自身免疫過程[13-14]。TLR4信號通路的激活可以誘導(dǎo)NF-κB,通過經(jīng)典途徑產(chǎn)生促炎細胞因子和/或通過替代途徑產(chǎn)生 I 型干擾素和抗炎細胞因子[15-16]。XIE等人[17]發(fā)現(xiàn)了NF-κB的激活,參與了LN的發(fā)生發(fā)展。我們課題組之前的研究也發(fā)現(xiàn)NF-κB的激活也參與了LN的病理進展[18]。

但是RAPA對TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的影響還少有報道。在我們的研究中,我們證實 RAPA 可減輕MRL/lpr小鼠狼瘡性腎炎的嚴重程度。不僅是從蛋白尿水平、自身抗體水平及腎臟組織病理方面,同時RT-PCR和免疫熒光結(jié)果顯示,狼瘡模型組腎組織TLR4/MyD88/NF-κB通路的基因和蛋白的表達量顯著增高,腎組織細胞凋亡率增加,這些表明所探索的模型激活了TLR4/MyD88/NF-κB通路,導(dǎo)致了腎組織細胞凋亡率的增加。此外,RAPA治療后,腎組織中TLR4/MyD88/NF-κB通路的mRNA和蛋白表達量下降,腎組織的細胞凋亡率減少。

綜上,本研究表明RAPA對于LN的治療作用可能與抑制LN腎組織中的TLR4/MyD88/NF-κB信號通路并改善腎組織的細胞凋亡率有關(guān),為狼瘡性腎炎的治療提供理論和實驗基礎(chǔ)。